Determinazione della gittata cardiaca in un modello suino per la perfusione polmonare ex vivo

Riepilogo

Questo protocollo descrive la tecnica chirurgica utilizzata per il posizionamento di un catetere di termodiluizione attraverso la vena giugulare nei suini per stimare la gittata cardiaca e garantire un'adeguata perfusione polmonare durante la perfusione polmonare ex vivo (EVLP).

Abstract

A causa delle loro somiglianze fisiologiche con l'uomo, i suini sono utilizzati come modelli sperimentali per la perfusione polmonare ex vivo (EVLP). L'EVLP è una tecnica che perfonde i polmoni che non sono adatti al trapianto tramite una pompa di circolazione extracorporea per migliorarne la funzione e aumentarne la vitalità. I protocolli EVLP esistenti si differenziano per il tipo di soluzione di perfusione e il flusso di perfusione, che varia dal 40% al 100% della gittata cardiaca stimata (CO) in base alla superficie corporea (BSA). I dispositivi per la misurazione del CO utilizzano semplici principi fisici e altri modelli matematici. La termodiluizione nei modelli animali continua ad essere lo standard di riferimento per la stima del CO grazie alla sua semplicità e facilità di riproduzione. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è stato quello di riprodurre la misurazione del CO mediante termodiluizione nei suini e confrontarne la precisione e l'accuratezza con quelle ottenute con il BSA, il peso e il metodo di Fick, per stabilire il flusso di perfusione durante l'EVLP. In 23 suini, un catetere di termodiluizione è stato posizionato nella vena giugulare destra e l'arteria carotide sullo stesso lato è stata incannulata. I campioni di sangue sono stati prelevati per la gasometria e il CO è stato stimato mediante termodiluizione, superficie corporea regolata, principio di Fick e peso corporeo. Il CO ottenuto dalla BSA era maggiore (p = 0,0001, ANOVA, Tukey) rispetto a quello ottenuto con gli altri metodi. Concludiamo che, sebbene i metodi utilizzati in questo studio per stimare il CO siano affidabili, ci sono differenze significative tra loro; Pertanto, ogni metodo deve essere valutato dallo sperimentatore per determinare quale soddisfa le esigenze del protocollo.

Introduzione

Nei centri di trapianto di polmone, la perfusione polmonare ex vivo (EVLP) è uno strumento che aiuta ad aumentare il potenziale di donazione di polmoni che non soddisfano i criteri standard per il trapianto¹. Ciò si ottiene preservando e migliorando la funzionalità polmonare dei donatori con morte cerebrale o arresto cardiaco, nonché valutando le prestazioni polmonari prima del trapianto ^2,3,4. Nell'EVLP, una pompa di circolazione extracorporea consente la perfusione del polmone da trapiantare attraverso uno scambiatore di gas a membrana e un filtro per l'intrappolamento dei leucociti⁵.

Ad oggi, sono stati descritti diversi protocolli EVLP (Toronto, Lund e Organ Care System). Questi si differenziano per il tipo di soluzione di perfusione utilizzata, se l'atrio sinistro viene mantenuto aperto o chiuso durante la perfusione, e per il flusso di perfusione, che varia dal 40% al 100% (a seconda della tecnica utilizzata) della gittata cardiaca stimata (CO) del donatore ^6,7,8. Il CO è la quantità di sangue pompata dal cuore al minuto⁹ ed è il meccanismo attraverso il quale viene mantenuta la perfusione tissutale. Pertanto, il monitoraggio del CO garantisce una corretta ossigenazione dei tessuti. Il CO, prodotto della frequenza cardiaca e della gittata sistolica, è misurato in litri 10,11,12. Tuttavia, questo approccio per il mantenimento della perfusione tissutale dipende anche da altri fattori, come il ritorno venoso, l'uso periferico di ossigeno, la resistenza vascolare sistemica, la respirazione, il volume totale del sangue e la posizione del corpo¹².

Esistono diversi dispositivi per la misurazione e il monitoraggio del CO, alcuni dei quali utilizzano semplici principi fisici, mentre altri utilizzano modelli matematici. Questi metodi includono il principio di Fick, la termodiluizione (diluizione transpolmonare o al litio), l'analisi dell'onda di pressione arteriosa per stimare la gittata sistolica (SV) e metodi meno invasivi come il Doppler o la bioreattanza toracica. Tuttavia, nessun dispositivo di monitoraggio del CO può soddisfare tutti i requisiti clinici a causa delle limitazioni della corrispondente tecnica di monitoraggio^10,13.

La misurazione del CO mediante termodiluizione transcardiaca è un metodo semplice e facilmente riproducibile nei suini. Consiste nel posizionare un catetere con un termistore nell'arteria polmonare e iniettare un volume di liquido con una temperatura inferiore a quella del sangue. Il termistore rileva le variazioni di temperatura nel tempo, che vengono poi tracciate sotto forma di curva, con l'area sotto la curva che rappresenta il volume minuto¹⁴. Vari studi hanno descritto che per i modelli animali EVLP, il CO può essere calcolato in base al peso (100 mL/kg)¹⁵, alla termodiluizione e al metodo di Fick^10,13. Tuttavia, in clinica, il CO viene calcolato utilizzando l'indice cardiaco (CI), che è il CO aggiustato per la superficie corporea del donatore¹⁶. Tuttavia, non ci sono studi che confrontino questi metodi in modelli sperimentali di suini.

L'obiettivo di questo studio è stato quello di riprodurre la misurazione del CO mediante termodiluizione nei suini e confrontarne la precisione e l'accuratezza con quelle ottenute utilizzando il CO regolato mediante BSA, il peso e il metodo di Fick per stabilire il flusso di perfusione durante l'EVLP.

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Protocollo

Il protocollo (B09-17) è stato approvato dal comitato di bioetica dell'INER (Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias "Ismael Cosio Villegas"). Per questo studio sono stati utilizzati ventitré suini Landrace clinicamente sani di entrambi i sessi, di peso compreso tra 20 e 25 kg. Gli animali sono stati gestiti secondo le specifiche tecniche per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dello standard ufficiale messicano¹⁷ e della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Stati Uniti¹⁸. Tutti gli animali sono stati ottenuti dall'Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Ismael Cosio Villegas e sono stati alloggiati in gabbie individuali in condizioni ambientali identiche, fornite di acqua e cibo ad libitum. In tutti gli animali, un catetere di termodiluizione è stato posizionato nella vena giugulare destra e un catetere arterioso è stato posizionato nell'arteria carotide sullo stesso lato per raccogliere i gas sanguigni e quindi calcolare il CO. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione sperimentale

1. Diluire 1000 UI di eparina in ciascuna delle tre soluzioni da 250 mL di cloruro di sodio allo 0,9% (soluzione salina, SS).
2. Collegare i trasduttori di pressione al monitor dei segni vitali. Utilizzare ciascun trasduttore per misurare la pressione alla porta corrispondente del catetere di termodiluizione.
3. Collegare le soluzioni eparinizzate al trasduttore tramite infusione endovenosa senza ago. Assicurarsi che siano puliti e pronti per il collegamento al catetere.
4. Rimuovere il catetere di termodiluizione dalla confezione. Immergere l'estremità distale in NaCl allo 0,9% per verificare l'integrità del palloncino.
5. Controllare la pervietà delle connessioni del catetere distale e prossimale. Tenere il catetere sul tavolo degli strumenti chirurgici fino all'uso.

2. Preparazione degli animali

1. Somministrare 0,05 mg/kg di atropina e 4 mg/kg di tiletamina-zolazepam per via intramuscolare a tutti i suini nella sala di preparazione degli animali (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
2. Lasciare i maiali indisturbati ma sotto sorveglianza fino a quando non diventano sdraiati e rimanere in questa posizione senza segni di eccitazione o risposta agli stimoli nocicettivi.
3. Posizionare l'animale sedato in posizione prona e inserire un catetere nella vena marginale dell'orecchio sinistro.
4. Trasferire l'animale in sala operatoria per l'intervento chirurgico.
5. Posizionare l'animale in posizione dorsale e somministrare 4 mg/kg di propofol EV, 300 μg/kg di vecuronio bromuro e 0,1 mg/kg di fentanil IV.
6. Abbassare la mandibola del maiale con l'aiuto del personale di laboratorio per mantenere la bocca aperta e la lingua sporgente.
7. Spruzzare il 10% di lidocaina sulle corde vocali, eliminare la saliva accumulata con una garza tenuta da una pinza ad anello e separare l'epiglottide dall'apertura laringea.
8. Identificare l'ingresso tracheale con un laringoscopio e una lama diritta numero 3, quindi inserire un tubo endotracheale da 7 Fr con un palloncino.
9. Gonfiare il palloncino e fissare il tubo alla mandibola dopo averne verificato il posizionamento all'interno delle vie aeree.
10. Collegare il maiale alla macchina per anestesia per mantenere uno stato anestetico con il 2,5%-3% di sevoflurano (Figura 1).
11. Ventilare l'animale in modalità di ventilazione a volume controllato con una frequenza di 25 respiri/min, volume corrente di 6-8 mL/kg di peso, FiO₂% del 50%-70% per mantenere SaO₂ superiore al 90%, trigger di 2, pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 5 cmH₂O, rapporto di inspirazione di 1:2 s e flusso inspiratorio di 15 L/min e massimo di 30 L/min.

3. Posizionamento del catetere di termodiluizione e misurazione della gittata cardiaca

1. Mantenere l'animale in posizione dorsale in anestesia generale ed eseguire l'antisepsi della regione cervicale con iodopovidone (Figura 2). Praticare un'incisione paramediana di 10 cm utilizzando una matita per elettrocauterizzazione e sezionare il tessuto sottocutaneo per esporre la vena giugulare esterna destra mediante dissezione smussata.
2. Posizionare due suture di seta 2-0, una nella porzione distale e l'altra nella porzione prossimale del vaso sezionato (Figura 3).
3. Inserire il catetere in modo extracorporeo dal sito del collo alla regione toracica in cui si trova il cuore. Misurare la profondità di inserimento utilizzando i contrassegni sul catetere per raggiungere l'arteria polmonare (PA). Legare la parte distale del vaso e posizionare un doppio anello nella porzione prossimale per fissare il catetere una volta inserito.
4. Praticare un'incisione trasversale di 2 mm sulla porzione ventrale del vaso utilizzando le forbici dell'iride. Aprire i bordi dell'incisione con la pinza emostatica per zanzare di Halsted e inserire il catetere di termodiluizione 5Fr nella vena giugulare destra (Figura 4, Figura 5 e Figura 6). Dirigere il catetere verso l'arteria polmonare (PA) seguendo le curve visualizzate sul monitor.

4. Posizionamento del catetere arterioso

1. Una volta sezionata la vena e posizionate le suture di riferimento, spostare lateralmente il muscolo sternocefalico (equivalente allo sternocleidomastoideo).
2. Sezionare la muscolatura pretracheale (sternoioide) fino a quando l'arteria carotide non è esposta.
3. Cannulare l'arteria carotide in modo simile alla vena giugulare e collegarla al trasduttore di pressione per il monitoraggio della pressione arteriosa sistemica.

5. Valutazione

1. Una volta posizionato il catetere di termodiluizione nella vena giugulare destra e il catetere arterioso nello stesso lato dell'arteria carotide, prelevare campioni per l'analisi dei gas nel sangue.
2. Ottenere i valori dei gas nel sangue e valutare la gittata cardiaca (CO) utilizzando il metodo della termodiluizione, la superficie corporea e il metodo di Fick.
   NOTA: Per le procedure dettagliate, si rimanda ai rapporti ^19-21 precedentemente pubblicati.

6. Analisi statistica

1. Analizza i dati che dimostrano una distribuzione normale utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA) ed esegui il test post hoc di Tukey. Esprimere i valori come media ± errore standard. Considerare i valori p <0,05 come indicativi di significatività statistica.

7. Misura della termodiluizione

1. Iniettare un bolo da 5 mL di SS freddo a 4 °C nel lume prossimale del catetere di termodiluizione in meno di 4 s.
2. Osservare la curva di termodiluizione (temperatura/tempo) sullo schermo del monitor. La curva dovrebbe mostrare una rapida ascesa seguita da una discesa regolare e graduale verso la linea di base, con valori numerici visualizzati con una o due cifre decimali.
3. Ripetere il processo di iniezione del bolo con altri due boli di SS freddo fino a quando le curve sono valide, simili ed entro il 10% del valore medio.
4. Dopo aver confermato la validità e la somiglianza delle curve, calcolare la media dei tre valori e registrarla come valore finale di CO in litri al minuto. Ottenere CO e altri indici dalla curva di termodiluizione utilizzando calcoli basati sull'equazione di Stewart-Hamilton²¹.

8. Determinazione della gittata cardiaca aggiustata per la superficie corporea (BSA) o l'indice cardiaco

1. Per determinare la gittata cardiaca aggiustata (CI), calcolare la superficie corporea (BSA) utilizzando la formula di DuBois-DuBois¹⁹:
   BSA = 0,007184 × (Altezza (cm)^0,725) × (Peso (kg)^0,425).
2. Una volta ottenuta la BSA, calcolare l'IC utilizzando la formula²⁰:
   CI = CO/BSA.
   NOTA: Il CO viene determinato al punto 7.

9. Stima della gittata cardiaca con il metodo di Fick

1. Per calcolare la gittata cardiaca (CO) utilizzando il metodo di Fick, determinare il consumo di ossigeno (VO₂) e la differenza nei livelli di ossigeno ottenuti dai gas ematici arteriosi (SaO₂) e venosi (SvO₂). Calcola il VO₂ utilizzando la formula²¹:
   VO₂ = CO x (SaO₂ - SvO₂).
2. Quindi, determinare la gittata cardiaca utilizzando la formula²¹:
   CO = VO₂ / ([SaO₂ - SvO₂] × 10).

10. Stima della gittata cardiaca per peso corporeo

1. Determinare la gittata cardiaca per peso corporeo degli animali seguendo i rapporti precedenti ^8,15.
   NOTA: Nel protocollo EVLP, vari gruppi hanno riportato che la gittata cardiaca (CO) stimata per peso corporeo nei suini è di 100 ml/kg ^8,15.

11. Eutanasia

1. Eutanasia in tutti gli animali con un sovradosaggio di pentobarbital sodico (150 mg/kg/EV) attraverso la guaina della vena giugulare (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) una volta completate tutte le misurazioni.
2. Continuare l'anestesia generale e il monitoraggio cardiaco fino a quando il tracciato dell'elettrocardiogramma (ECG) non mostra alcuna attività elettrica cardiaca^17,18.

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Risultati

Tutti gli animali sono sopravvissuti alla procedura chirurgica e al tempo di studio. Un animale (4,3%) ha sviluppato una lacerazione della vena giugulare a causa di un'eccessiva trazione durante l'inserimento del catetere. Inoltre, nessuno dei vasi intervenuti mostrava sanguinamento. Negli animali studiati, per raggiungere il PA sono stati necessari in media 25-30 cm di inserimento del catetere. In tre casi (13%), il catetere era diretto verso l'arto superiore destro del maiale. In questi casi, il catetere è stato retra...

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Discussione

L'EVLP nei suini ha una traduzione diretta nella pratica clinica umana, data la comparabilità nelle dimensioni, nella fisiologia e nella sequenza genomica delle due specie²². Secondo il protocollo EVLP selezionato dal ricercatore, la misurazione del CO è essenziale per determinare il flusso necessario per perfondere i polmoni. Inoltre, a seconda delle risorse e delle conoscenze disponibili, si può scegliere il metodo appropriato. Tuttavia, nessuno studio ha confrontato i metodi per valutare con...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	General Electric	Carescape 620
Atropine	Amixteria, Stern Pharma GmbH
Catheter Insyte Autoguard 20 GA	Becton Dickinson	381434
Electrocautery pencil	BBraun Aesculap	GN211
Endotracheal tube with a 7 Fr balloon	Rush	MG 027770 002
Fentanyl	Janssen-Cilag
Iodopovidone	Degasa	NDC6732635208
Laryngoscope	Riester
Lidocaine Spray	Pisa
Pressure transducers	Edwards Lifesciences	PX260
Propofol	Pisa
Sevofluorane	Pisa
Silk sutures 2-0	Covidien	GS833
Sodium pentobarbital	Pfizer
straight blade of laryngoscope #3	Miller; Riester
Swan-Ganz 5Fr thermodilution catheter	Arrow Thermodilution Ballon Catheter	Ref AI-07165
Tiletamine-zolazepam	Virbac
Vecuronium bromide	Pisa