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  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, dimostriamo il metodo di caratterizzazione delle vescicole extracellulari (EV) raccolte da fluidi biologici, come lacrime e saliva, di soggetti umani. Lo scanner utilizzato in questo metodo è in grado di rilevare il fenotipo, le dimensioni e il conteggio totale delle particelle delle vescicole extracellulari a partire da 1 μL del campione.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) sono strutture prodotte dalle cellule e partecipano alla comunicazione intercellulare trasportando biomolecole da una cellula all'altra. È stato dimostrato che le vescicole extracellulari viaggiano su brevi e lunghe distanze nel corpo e sono tessuto-specifiche. Le vescicole extracellulari non si trovano solo nei tessuti, ma possono anche essere trovate praticamente in tutti i fluidi corporei, come lacrime, saliva, liquido cerebrospinale, sangue, ecc. Anche se le vescicole extracellulari possono essere raccolte in modo non invasivo da lacrime e saliva, è possibile raccogliere solo piccoli volumi alla volta, il che può causare problemi nell'ottenere abbastanza vescicole extracellulari per analizzare le proteine. Lo scanner discusso in questo articolo è un analizzatore di nanoparticelle che fornisce una soluzione a questo problema, permettendoci di caratterizzare e studiare il fenotipo, le dimensioni e il numero totale di particelle delle vescicole extracellulari da un minimo di 1 μL di fluido biologico. Questo protocollo amplierà la conoscenza delle vescicole extracellulari da piccoli volumi di campioni difficili da estrarre dai pazienti. Ciò potrebbe migliorare il comfort del paziente e potenzialmente identificare nuovi bersagli terapeutici per una serie di malattie e disturbi.

Introduzione

Le cellule comunicano con le cellule vicine attraverso vari meccanismi di segnalazione, tra cui il rilascio di vescicole extracellulari (EV), che svolgono un ruolo chiave nella comunicazione intercellulare. Le vescicole extracellulari partecipano alla comunicazione intercellulare passando il carico genetico, come DNA, RNA e proteine, da una cellula all'altra 1,2,3,4,5. Attualmente, ci sono tre categorie di vescicole extracellulari: esosomi, microvescicole e corpi apoptotici, che si caratterizzano per le loro dimensioni. Gli esosomi sono i più piccoli, con un diametro di 30-150 nm 6,7,8, e sono formati dal sistema di membrana endosomiale 9,10,11 (Figura 1). Le microvescicole sono più grandi degli esosomi in quanto vanno da 100-1000 nm 12,13,14 e gemma fuori dalla membrana plasmatica 11,12,13 (Figura 1). I corpi apoptotici sono i più grandi delle vescicole extracellulari e vanno da 1000 a 5000 nm 12,14,15, e germogliano anche dalla membrana plasmatica 12,16,17 (Figura 1). Oltre alle dimensioni, le vescicole extracellulari possono essere classificate in base ad altre caratteristiche biofisiche, che includono densità, marcatori molecolari come CD63, CD81, CD9 e anche il meccanismo di biogenesi18. Le vescicole extracellulari possono percorrere brevi distanze tra cellule adiacenti e lunghe distanze in tutto il corpo 19,20,21,22,23. Le vescicole extracellulari possono essere trovate in fluidi biologici come il sangue 24,25,26, il liquido cerebrospinale 27,28,29, le lacrime 30,31,32 e la saliva 33,34,35, solo per citarne alcuni.

Ad oggi, l'ultracentrifugazione è uno dei metodi più noti per isolare le vescicole extracellulari dai campioni 36,37,38. Questo metodo richiede più cicli di centrifugazioni e ultracentrifugazione che possono essere eseguite aumentando la velocità di isolamento delle vescicole extracellulari dalle cellule e dai detriti cellulari. Questo metodo può essere avviato con la bassa velocità con celle a pellet che sarà seguita da una velocità media per eliminare le vescicole più grandi e, infine, una fase di ultracentrifugazione per pellettare EVs18. Sebbene l'ultracentrifugazione sia considerata il metodo migliore per l'isolamento, esistono ancora alcune limitazioni in quanto modifica la morfologia delle vescicole extracellulari 39,40,41. Un'altra tecnica utilizzata per isolare le vescicole extracellulari è la citometria a flusso, che evidenzia i vantaggi della valutazione di più punti temporali e finali e dell'analisi di singole vescicole extracellulari ad alto rendimento. Tuttavia, i limiti della citometria a flusso includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'ostruzione dei pori e i segnali deboli. Un altro approccio utilizzato è la centrifugazione in gradiente, che utilizza materiali con densità diverse da centrifugare con le vescicole extracellulari e consente una migliore separazione delle vescicole extracellulari rispetto all'ultracentrifugazione. Sebbene questa tecnica migliori la separazione, è laboriosa, richiede molto tempo e può portare a una significativa perdita di campione. Inoltre, la precipitazione e la filtrazione possono essere utilizzate anche per isolare le vescicole extracellulari. Entrambe queste tecniche sono semplici e veloci, ma entrambe possono portare alla contaminazione del campione. Sebbene esistano diverse tecniche per isolare le vescicole extracellulari, ciascuna tecnica ha i suoi vantaggi e limiti, che sono elencati di seguito (Tabella 1) 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54, 55, 56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67.

Una volta che le vescicole extracellulari sono state isolate, possono essere eseguiti saggi molecolari per caratterizzarle. I western blot sono un test comune per cercare l'espressione proteica di superficie e cargo 68,69,70 e la reazione a catena della polimerasi (PCR) è utilizzata per l'espressione di miRNA 71,72,73 per le EV 74,75,76. Questi saggi sono consolidati e possono generare risultati intriganti. Un limite di questi metodi è che richiedono una grande quantità di proteine o RNA dalle vescicole extracellulari per ottenere una lettura77, che è un problema per i campioni che hanno un piccolo volume o concentrazione di vescicole extracellulari, per cominciare.

L'analizzatore di nanoparticelle discusso in questo documento consente all'utente di superare molte delle limitazioni indicate nella Tabella 1 e nella Tabella 2 78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90 . Questo metodo non richiede l'utilizzo di tecniche di isolamento, che aiuteranno a superare la ridotta resa delle vescicole extracellulari. Questo metodo consente inoltre all'utente di analizzare le proteine di superficie e di carico, la conta totale delle vescicole extracellulari e le dimensioni delle vescicole extracellulari a partire da un volume di campione di appena 1 μl. Ciò viene fatto utilizzando chip di tetraspanina forniti dall'azienda che utilizza un microarray di anticorpi con anticorpi tetraspanina, CD63, CD81 e CD9, per identificare le vescicole extracellulari in una soluzione, come mostrato nella Figura 2. Gli anticorpi fluorescenti confermano la presenza di vescicole extracellulari e impediscono alle particelle contaminanti di distorcere i risultati.

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di fornire un metodo meno dispendioso in termini di tempo per analizzare le vescicole extracellulari e analizzare le vescicole extracellulari da un piccolo volume di campione. L'utilizzo di questo analizzatore di nanoparticelle consente agli utenti di analizzare le dimensioni, il numero totale di particelle e le proteine di superficie da un minimo di 1 μL di campione, ideale per fluidi biologici come lacrime e saliva.

Protocollo

Tutti gli studi descritti hanno aderito alla Dichiarazione di Helsinki. Il consenso scritto è stato ottenuto da ciascun soggetto prima di essere incluso nello studio. L'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB) da parte dell'Aarhus University Hospital (1-10-72-77-14) e del Dean McGee Institute (1576837-2) è stata ricevuta secondo le linee guida federali e istituzionali. Prima dell'elaborazione, tutti i campioni di lacrime e saliva sono stati resi anonimi. Tutti gli studi sono stati esaminati e approvati dal North Texas Regional Institutional Review Board (#2020-030). Il seguente protocollo aderisce a tutte le linee guida ed è stato approvato, come menzionato sopra.

1. Giorno 1: Preparazione del campione e incubazione

  1. Raccogliere campioni di fluido biologico, ad esempio lacrime e saliva da un soggetto o scongelare i campioni dal congelatore.
    1. Lacrime: Raccogliere passivamente le lacrime dal menisco laterale utilizzando un tubo capillare di vetro.
      1. Posizionare il tubo capillare di vetro sulla palpebra inferiore, facendo attenzione a non toccare la cornea.
      2. Raccogliere un volume di 10 μL di lacrime entro 10 minuti.
      3. Utilizzare immediatamente le lacrime o conservarle a -20 °C.
    2. Saliva: Raccogliere la saliva dalla bava passiva in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml
      1. Consenti al donatore di accumulare saliva in bocca.
      2. Chiedi al donatore di sbavare nel tubo con un imbuto.
      3. Utilizzare immediatamente la saliva o conservare a -20 °C.
  2. Posizionare i chip di tetraspanina nella piastra di lavaggio dei trucioli per 15 minuti prima di aggiungere i campioni per consentire loro di raggiungere la temperatura ambiente. Mentre metti le fiches nel pozzo, assicurati che i numeri siano sul lato inferiore rivolto verso l'alto e che le fiches non tocchino le pareti laterali dei pozzetti.
  3. Registrare il numero ID e il numero di chip nel notebook per tenere traccia dei chip.
  4. Collegare il bus seriale universale (USB) fornito con il kit, quindi estrarre e salvare la cartella con il numero di kit associato in un'area designata a scelta.
  5. Pipettare 99 μl di soluzione B in una provetta da 1,5 mL.
  6. Aggiungere 1 μL di fluido biologico nella provetta da 1,5 mL preparata nel passaggio precedente.
  7. Centrifugare i tubi.
  8. Prelevare 70 μl della soluzione dal passaggio 1.6 e pipettare il chip di tetraspanina.
  9. Posizionare la pellicola sulla piastra di lavaggio dei trucioli per evitare che il campione evapori.
  10. Incubare per 16 ore a temperatura ambiente (RT) su un banco privo di vibrazioni.

2. Giorno 2: Lavaggio dei trucioli

  1. Accendi la lavatrice per trucioli.
  2. Rimuovere la pellicola del passaggio 1.9 dalla piastra.
  3. Posizionare la piastra nella rondella per trucioli, assicurandosi che si blocchi in posizione, e chiudere il coperchio.
    NOTA: La piastra non si muoverà facilmente se bloccata correttamente in posizione.
  4. Premere l'opzione CW-TETRA v0 sulla rondella trucioli.
  5. Selezionare la riga di partenza e il numero di file da lavare.
  6. Premere Continua sulla lavatrice per trucioli.
  7. Durante il lavaggio dei chip, preparare la soluzione bloccante contenente gli anticorpi in una provetta come segue:
    1. Preparare 300 μl di soluzione bloccante per chip.
    2. Aggiungere 0,6 μl o ciascun anticorpo per chip (anticorpi vortex e spin down prima di aggiungerli alla soluzione bloccante)
    3. Vortex la soluzione bloccante + cocktail di anticorpi.
      NOTA: Coprire la soluzione bloccante + il cocktail di anticorpi dalla luce per garantire la stabilità degli anticorpi. Questo deve essere effettuato il giorno dell'uso.
  8. Quando il lavatrucioli emette un segnale acustico, aggiungere 250 μl di soluzione bloccante + cocktail di anticorpi sopra i chip.
  9. Chiudere il coperchio e premere Continua.
    NOTA: La lavatrice per trucioli eseguirà ora un'incubazione di 1–h insieme a diversi cicli aggiuntivi di lavaggio e risciacquo.
  10. Quando la rondella dei trucioli emette un segnale acustico, rimuovere la piastra di lavaggio dei trucioli e spostare i trucioli su per la rampa.
  11. Riposizionare la piastra nella rondella per trucioli, assicurandosi che si blocchi in posizione. Chiudere il coperchio e premere Continua.
  12. Quando la lavatrice per trucioli ha completato il programma, rimuovere la piastra e posizionare i trucioli su un tovagliolo di carta. Coprire le patatine dalla luce.

3. Giorno 2: Scansione del/i chip/i

  1. Accendi lo scanner e apri il software di scansione.
    NOTA: Lo scanner verrà sottoposto a controlli automatici per indicare se sono presenti errori o se la scansione può essere continuata.
  2. Seleziona Salva cartella e scegli la posizione in cui salvare i file.
  3. Seleziona Cartella ChipFile e scegli la cartella salvata nel passaggio 1.4.
  4. Selezionare l'opzione a discesa per scegliere ciascun truciolo e posizionarlo in Posizione truciolo sul mandrino. Ripetere questo passaggio per tutti i chip che devono essere scansionati.
  5. Attiva la fluorescenza facendo clic sui tre quadrati sotto Posizione chip. I quadrati diventeranno rispettivamente gialli, blu e rossi.
  6. Rimuovere il coperchio del mandrino premendo il coperchio verso il basso e tirarlo.
  7. Posizionare i trucioli sul mandrino, assicurandosi che siano ben fissati.
  8. Riposizionare il coperchio del mandrino posizionando i pioli nei fori, premere verso il basso e far scorrere il coperchio per bloccarlo in posizione.
  9. Posizionare il mandrino sul tavolino, assicurandosi che si blocchi in posizione.
  10. Seleziona Scansiona chip.
  11. Selezionare OK.
  12. Una volta che il tavolino si è completamente spostato nella macchina, chiudere lo sportello.
    NOTA: La scansione di un singolo chip richiede circa 12 minuti.
  13. Una volta terminata la scansione dei chip, aprire lo sportello per espellere il controllo del tavolino per vedere se le scansioni sono andate a buon fine.
    1. Se le scansioni hanno avuto esito positivo, scartare i chip e posizionare il set successivo di chip sul mandrino, oppure riportare il mandrino vuoto sul tavolino. Quindi, uscire dal software e spegnere la macchina al termine.
    2. Se le scansioni non sono andate a buon fine, esaminare il codice di errore e correggere l'errore.

4. Trattamento dei dati

  1. Aprire il software di analisi.
  2. Selezionare Prescansione dati e scegliere la cartella che contiene la scansione dal passaggio 3.2 del giorno 2.
  3. Seleziona Avanti.
  4. Etichettare i chip nella colonna Nome campione con il nome del campione facendo clic sulla cella e digitando l'ID del campione.
  5. Quindi, etichettare le tetraspanine nella colonna Nome canale . Rosso = CD63, Verde = CD81 e Blu = CD9.
  6. Seleziona Avanti.
  7. Selezionare CV alto dal gruppo Seleziona spot per esaminare la casella a discesa e disattivare i CV alti per ciascun chip disabilitando uno o due spot.
  8. Quindi, seleziona Conteggio alto e prova a disattivare gli avvisi di conteggio elevato.
    NOTA: Alcuni campioni potrebbero avere un conteggio troppo alto, ma possono comunque essere analizzati.
  9. Selezionare Tutti i punti dal menu a discesa, selezionare Montaggio spot e controllare visivamente ogni scheggiatura per eventuali deformazioni o graffi che potrebbero essere presenti.
  10. Seleziona Avanti.
  11. Nel canale CD63, imposta il minimo su 300 per eliminare i globuli rossi nella riga Media % inclusa; le cellule gialle vanno bene e procedono verso il canale CD81. Se l'impostazione del valore minimo su 300 non modifica la cella rossa in gialla o bianca, procedere al passaggio 4.14 per la risoluzione dei problemi.
  12. Nel canale CD81, impostare il valore minimo su 300 per eliminare i globuli rossi nella riga Media % inclusi; le cellule gialle vanno bene e procedono verso il canale CD9. Se l'impostazione del valore minimo su 300 non modifica la cella rossa in gialla o bianca, procedere al passaggio 4.14 per la risoluzione dei problemi.
  13. Nel canale CD9, imposta il minimo su 400 per eliminare i globuli rossi nella riga Media % inclusa; Le celle gialle vanno bene e procedi al passaggio 4.15. Se l'impostazione del valore minimo su 400 non modifica la cella rossa in gialla o bianca, procedere al passaggio 4.14 per la risoluzione dei problemi.
  14. Risoluzione dei problemi
    1. Aumenta il valore minimo di 100 unità.
    2. Se il passaggio 4.14.1 non ha funzionato, seleziona la nella sezione Scegli fiches su cui lavorare e scegli la. Seleziona Conteggio particelle e disabilita i punti con un numero elevato di particelle. Seleziona Intensità/Dimensione, seleziona Tutte le fiches e verifica se questo risolve il problema.
    3. Se il passaggio 4.14.2 non ha funzionato, selezionare la nella sezione Scegli fiches su cui lavorare e scegli la. Seleziona i tagli a chip singolo e aumenta il minimo di 100 unità. Quindi seleziona Tutte le fiches per vedere se la cella rossa è ora gialla. Se il problema persiste, ripetere questo passaggio fino a quando la cella % media inclusa non diventa gialla o bianca.
  15. Seleziona Avanti.
  16. Deselezionare il canale IM.
  17. Imposta il valore della mappa di calore nell'angolo in basso a destra per includere tutte le particelle e seleziona Aggiungi grafico al rapporto.
    1. Regola il numero massimo nella casella a discesa e inserisci manualmente un valore.
  18. Quindi, selezionare il menu a discesa in alto al centro sotto Sonde di acquisizione e selezionare CD63.
  19. Selezionare Aggiungi grafico al rapporto per aggiungere il conteggio totale delle particelle al rapporto.
  20. Selezionare il menu a discesa in Modalità analisi, scegliere Colocalizzazione e Aggiungi grafico al report.
  21. Quindi, seleziona Dimensione, seleziona Cambia visualizzazione in Grafico e seleziona Aggiungi grafico al rapporto.
  22. Infine, seleziona Immagini e seleziona Aggiungi grafico al rapporto.
  23. Ripetere i passaggi da 4.18 a 4.22 per CD81 e CD9, assicurandosi di deselezionare ogni volta il canale IM.
  24. Una volta aggiunti tutti gli elementi al report, selezionare Esporta report, assicurarsi che venga salvato nel file corretto e selezionare Cartella.
    NOTA: I file Excel e le immagini sono stati generati e ora possono essere utilizzati per ulteriori analisi.

Risultati

Quando si analizzano le macchie sui chip, puntare a una concentrazione ottimale di vescicole extracellulari osservando le vescicole extracellulari marcate in fluorescenza nei canali CD63, CD81 e CD9, e il canale MIgG30,91 dovrebbe rimanere nero, poiché questo è il canale di controllo come mostrato nella Figura 3A. Il CD81 sarà ridotto per i fluidi biologici. Se non c'è fluorescenza nei canali CD63, CD81 e CD9, c'è un'assenza di vescicole extracellulari (Figura 3B). Fare attenzione a non saturare eccessivamente il chip (Figura 3C). Ciò renderà difficile per il software di analisi calcolare l'accuratezza delle dimensioni, del conteggio totale delle particelle e dei fenotipi delle vescicole extracellulari. Dai punti della concentrazione ottimale, il software di analisi sarà in grado di misurare le dimensioni (50-200 nm), il conteggio totale delle particelle e l'espressione della tetraspanina delle vescicole extracellulari (Figura 4) e sarà esportato in singoli fogli di calcolo per ulteriori analisi. L'analisi delle tetraspanine includerà la colocalizzazione delle proteine di superficie sulle vescicole extracellulari. La colocalizzazione sarà rappresentata con una "/", ad esempio "CD63/CD81". Ciò non significa che CD63 e CD81 siano combinati; significa che sia il CD63 che il CD81 si trovano sulla superficie dell'EV.

Questi risultati forniranno preziose informazioni tra campioni sani e malati. Saremo in grado di determinare se i campioni sani o i campioni malati producono più vescicole extracellulari, vescicole extracellulari più grandi o più piccole e il fenotipo delle vescicole extracellulari. Alcune o tutte queste caratteristiche potrebbero svolgere un ruolo nella biogenesi e/o nella progressione della malattia. Con questi risultati, saremo in grado di vedere se c'è un'assenza o un aumento dei livelli di tetraspanina, che possono fornire informazioni sui processi cellulari e sulla formazione di vescicole extracellulari.

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Figura 1: I tipi e le dimensioni dei diversi veicoli elettrici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Schema di come i chip di tetraspanina catturano e rilevano le vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Ottimizzazione delle concentrazioni di EV. (A) Concentrazione ottimale di vescicole extracellulari. (B) Risultato negativo: non sono presenti EV. (C) Sovrasaturazione dei veicoli elettrici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Dati generati dall'analizzatore di nanoparticelle. (A) Dimensione del diametro EV misurata in nanometri. (B) Conteggio totale delle particelle delle vescicole extracellulari. (C) Fenotipo colocalizzato EV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

TecnicaVantaggiLimitazioni
UltracentrifugaElevata purezza42,43Modifiche Morfologia EV42,44
Omogeneità42,45Richiede un grande volume42,44,46
Funzionalità42,43Costoso42,43
Citometria a flussoValutare i campioni in più punti temporali47Segnale debole48,49
Endpoint multipli47,50Pori ostruiti51
Analisi EV singola ad alto rendimento52,53
Centrifugazione in gradiente di densitàProduzione di campioni altamente puri54Manodopera intensiva55,56
Varietà di campioni55,57Richiede tempo55,58 
Perdita di resa significativa54
PrecipitazioneSemplice59,60Contaminazione36,44,61
Veloce61,62Non specifico63
Alta resa44,59,62
pH neutro36
FiltrazioneSemplice64 Esosomi trappola65
Veloce64Danneggia le grandi vescicole36
Economico64Torta filtrante66,67
Intasamento degli esosomi65

Tabella 1: Vantaggi e limiti delle tecniche di isolamento delle vescicole extracellulari. Un elenco dei vari modi per isolare i veicoli elettrici, compresi i loro vantaggi e limiti.

TecnicaVantaggiLimitazioni
Diffusione dinamica della luceMisura di particelle di dimensioni comprese tra 1 nm e 6 μM78 Non adatto per la misurazione di campioni di esosomi complessi con ampio intervallo di dimensioni79 
Il limite inferiore è di 10 nm adatto per sistemi monodispersi79 Non è in grado di distinguere le proteine contaminate dagli esosomi79
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)Osservare la morfologia degli esosomi79,80 Preparazioni complicate dei campioni79 
Osservare la struttura interna81 Non è in grado di distinguere gli esosomi in base alle dimensioni e alla forma a causa di segnali di fluorescenza esagerati82 
Analisi di tracciamento delle nanoparticelleMisurare la concentrazione, le dimensioni e la distribuzione dimensionale degli esosomi nell'intervallo da 10 nm a 2 μM78 Non è possibile differenziare le vescicole extracellulari dagli aggregati proteici e da altri contaminanti83 
Preparazione e misurazione rapide del campione78,84Costoso strumento NTA85 
I campioni possono essere recuperati in forma nativa84 Sensibile alle vibrazioni85
Western Blot (WB)può analizzare qualitativamente e quantitativamente le proteine marcatrici79,86 Complicato e dispendioso in termini di tempo79 
Analisi degli esosomi da terreni di coltura cellulare79 Gli isolati di EV possono contenere lipoproteine e altri contaminanti86 
Citometria a flussoMaggiore sensibilità e imaging ad alta risoluzione perLungo e laborioso con limite di rilevamento di 400 nm79,88 
distinguere gli esosomi colorati dai contenimenti87 
Bassa concentrazione del campione richiesta79 I segnali ottici ostacolano la precisione e la risoluzione88 
ExoviewMisurazione delle tetraspanine (CD9, CD63 e CD81) sugli esosomi89 Non misura veicoli elettrici di dimensioni maggiori75
Misura EV cargo proteine90

Tabella 2: Vantaggi e limiti delle tecniche di caratterizzazione delle vescicole extracellulari.

Discussione

Il passaggio più critico di questo protocollo consiste nell'assicurarsi che venga raggiunta una concentrazione ottimale di vescicole extracellulari. Ci devono essere abbastanza veicoli elettrici presenti per ottenere una lettura, ma non troppi veicoli elettrici che satureranno eccessivamente il chip. Il modo migliore per determinare la concentrazione ottimale di EV è eseguire un'analisi con 1 μL di campione e vedere se la concentrazione deve essere regolata. Un altro passaggio critico è vedere se c'è un'abbondanza di detriti cellulari nel campione, che può essere determinata visualizzando grandi pezzi sui chip nel software di analisi. Se il campione contiene detriti cellulari, una semplice centrifugazione o filtraggio del campione dovrebbe risolvere questo problema.

Un ulteriore passaggio cruciale consiste nell'assicurarsi che i trucioli non tocchino le pareti del pozzetto ed evitare il contatto con l'area centrale dei trucioli quando li si posiziona sulla rampa. Lo scanner leggerà dal quadrato al centro del chip, quindi è essenziale evitare di toccare quell'area con la pinza per evitare di interrompere le EV.

Questo metodo presenta alcune limitazioni, come ad esempio una concentrazione insufficiente di vescicole extracellulari per il rilevamento da parte dello strumento. La concentrazione potrebbe essere migliorata essiccando il campione o utilizzando una provetta concentratrice. Un'altra limitazione è che il software di analisi misura solo le vescicole extracellulari nell'intervallo 50-200 nm, escludendo alcune microvescicole e tutti i corpi apoptotici dalle misure di dimensione75.

Ci sono molti modi per isolare (Tabella 1 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56,57,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67) e analizzare le EV (Tabella 2 78,79,80,81,82,83,84,85, 86,87,88,89,90), e l'attuale gold standard per l'isolamento delle vescicole extracellulari è l'ultracentrifugazione 36,37,38 per pellettare le cellule per saggi come Western Blots 68,69,70 e PCR 71,72,73,74,75,76. Sebbene questo protocollo funzioni bene per campioni di grandi dimensioni 42,44,46, ottenere fluidi biologici può essere difficile e, spesso, è possibile raccogliere solo un piccolo volume di campioni alla volta, il che non è l'ideale per l'ultracentrifugazione. Al contrario, l'utilizzo di questo analizzatore di nanoparticelle consente all'utente di generare dati preziosi, come le dimensioni, il conteggio totale delle particelle e il fenotipo delle vescicole extracellulari, in appena 1 μL di campione, rendendolo ideale per i fluidi biologici. Saremo in grado di ampliare la conoscenza delle vescicole extracellulari a partire da piccoli volumi di campioni difficili da estrarre, che possono aumentare il comfort del paziente e possibilmente trovare potenziali bersagli terapeutici per varie malattie e disturbi.

Divulgazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Ringraziamo gli NIH per il finanziamento (EY031316 e EY034714). Vorremmo anche ringraziare UNTHSC e NTERI per lo spazio del laboratorio.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
ChipWasher 100NanoViewEV-CW100Incubates, washes, rinses and dries the tetraspanin chips. This current model is no longer available. Price at time of purchase: $9,995.00 
ExoView Analyzer softwareNanoViewN/AAnalyzes the chip informations and produces excel files for further analysis. No longer available.
ExoView R100NanoViewEV-R100Used to scan the tetraspanin chips at 3 wavelengths. This current model is no longer available. Price at time of purchase:  $110,000.00
ExoView Scanner softwareNanoViewN/AScans the chips at 3 different wavelengths. No longer available.
Human Tetraspanin KitsUnchained LabsEV-TETRA-CIncludes 8 tetraspanin chips, Incubation Solution, Blocking Solution, CD63 antibody, CD81 antibody, CD9 antibody, Solution A, Solution B, USB, and plate cover.

Riferimenti

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