Vorremmo ringraziare Linus D. Sun e Jeenah Jung, che ha avuto origine l&#39;uso del computer progettato, 3-D unità stampato nel nostro laboratorio per la registrazione da topi. Inoltre, vorremmo ringraziare tutti i membri passati e presenti Lab Wilson per il loro contributo a micro-drive e la tecnologia di sviluppo tetrodo in laboratorio.

<ol><li> Micro-drive array panoramica Un completo micro-drive array è costituito da diversi componenti principali (Fig. 1): <ol><li> Un computer progettato base in plastica che contiene 21 indipendentemente mobili micro-unità. </li><li> Una cannula sul fondo della base in cui sono raccolte una serie di tubi fissi guida tetrodo. </li><li> 21 micro-unità che entrambi portatori di un tetrodo e che possono essere azionati singolarmente con una vite. </li><li> Una scheda di interfaccia di elettrodi per l&#39;interconnessione tra tetrodi e pre-amplificatori. </li><li> Un cono di protezione (non mostrato in Fig. 1). </li><li> In una completamente assemblato micro-drive array, la base in plastica contiene tutte le micro-unità. Ogni micro-drive porta un tetrodo singolo. Il tetrodo è elettricamente collegato alla scheda di interfaccia elettrodo nella parte superiore del micro-drive array, e passa attraverso il tubo di guida stazionario per uscire verso il cervello nella parte inferiore del micro-drive array. Ruotando la vite su ogni micro-drive avanza o si ritrae il tetrodo. </li></ol></li> <li> Progettazione di base in plastica Progettiamo la base di montaggio del micro-drive in un 3-D pacchetto di software CAD (SolidWorks). Il vantaggio di questo in-house processo di progettazione è rapido turnover e la flessibilità del design. Nel laboratorio di Wilson abbiamo progettato molte varianti di questa parte, orientata verso le esigenze specifiche di ogni esperimento. Il 3-D di file modello viene inviato a un ufficio di servizio dove è stampato da un laser-curabile resina liquida tramite stereolitografia. Il tempo di consegna è di soli 2 giorni. La parte che ne risulta è leggero, riutilizzabile e può essere lavorato per tenere un filo. In questo protocollo useremo una base di unità che è stato progettato con un sito di registrazione singolo e che contiene 21 micro-unità. Il file di progettazione SolidWorks è reso disponibile su richiesta. </li> <li> Preparazione di base in plastica La base in plastica è trasformato per ospitare il micro-drive e le viti per fissare la scheda di interfaccia elettrodo e il cono di protezione. Non è possibile stampare affidabile liscia attraverso i fori nella base di plastica, in modo da progettare fori sottodimensionate, quindi espandere loro da foratura. Allineare con cura la punta con l&#39;asse del foro esistente prima di forare a velocità molto bassa. Una variabile di velocità / coppia trapano a mano funziona bene per questo compito. <ol><li> Praticare i fori di 21 per la micro-drive viti (l&#39;anello esterno) con un po &#39;# 61. </li><li> Praticare i 21 fori per il micro-drive tubi di supporto (l&#39;anello interno) con un po &#39;# 65. </li><li> Praticare i fori che verranno utilizzati per collegare la scheda di interfaccia elettrodo e il cono di protezione con un po &#39;1,55 mm. </li><li> Stampa montare un manicotto (5 mm di lunghezza 20 Ga parete sottile tubo di acciaio inox) in ogni dell&#39;anello interno di fori con un paio di pinzette o un paio di pinze in modo che sia a filo con la base in plastica. Le maniche assicurare la facilità del micro-drive tubi di sostegno. Successivamente, tutti i fori che conterrà le viti sono sotto controllo. In plastica stampata, fili che formano risultato rubinetti in più thread durevoli rispetto tipica filettatura rubinetti. Questo stile di rubinetto richiede fori più grandi. Usando un portatile morsa pin per tenere il rubinetto: </li> <li> Toccare i fori per il micro-drive viti utilizzando un rubinetto che corrisponde alla dimensione della vite in uso (M1.2x0.25) e un lubrificante secco. Per allineare il rubinetto con il foro pilota, inserire una lunghezza di 23 tubi Ga nel manicotto accanto ad essa. </li><li> Il nostro progetto base in plastica è dotato di un antipasto rubinetto per ogni micro-drive foro della vite per assicurarsi che i fili iniziali non vengano danneggiati durante il processo di threading. Dopo che tutti i fori sono filettati, questi antipasti rubinetto può essere facilmente spense con una lama di rasoio. </li><li> Toccare i fori che conterrà le viti per la scheda di interfaccia elettrodo e il cono di protezione con un 1-72 rubinetto. </li></ol></li> <li> Inserimento di tubi guida elettrodo <ol> <li> Per rendere la cannula che contiene tutti i fissi tubi guida elettrodo, tagliare un pezzo di 1,5 centimetri di lunghezza di 13 tubi di acciaio inox e Ga irruvidire la superficie con una ruota Dremel rettifica per migliorare l&#39;adesione dal acrilico dentale. </li><li> Inserire questo cannula nel foro sul fondo della base di plastica, verificare che sia co-lineare con l&#39;asse verticale del disco, e fissarlo con acrilico dentale o epossidica. Lasciare 5 a 7 mm della cannula esposti per facilitare l&#39;impianto chirurgico. </li><li> Tagliare 21 stazionarie tubi guida elettrodi (tubi flessibili in poliammide, diametro interno: 0,0071 &quot;, diametro esterno: 0,0116&quot;) con una lama di rasoio per una lunghezza di 6 cm. </li><li> Alimentare i tubi di guida, uno alla volta nelle maniche al vertice della base dell&#39;unità e tutto il percorso attraverso la cannula collettore in basso. Controllare visivamente per pieghe o eccessiva curvatura tubi e sostituirli se necessario. Per facilitare l&#39;inserimento e l&#39;allineamento parallelo di tubi guida del tetrodo, si può iniziare con il primo che alimentano il pacco intero di 21 tubi guida fino alcannula collettore dal basso. Poi, uno alla volta, rimuovere un tubo di guida dal fascio e dei mangimi che dalla parte superiore della base in plastica attraverso il foro che ha lasciato alle spalle nel bundle. </li><li> Spingere il tubo guida fino a quando si estendono solo 1-2 mm dalla parte superiore della base di plastica. Applicare una piccola quantità di colla cianoacrilato sottile ai tubi che fuoriescono dalla cannula collettore, facendo attenzione a non lasciare che il flusso di colla fino alla fine dei tubi guida. </li><li> Utilizzare una lama nuova rasoio per tagliare l&#39;eccesso dal fascio di tubi guida alla base della cannula collettore. </li> </ol></li><li> Fabbricazione di micro-unità Ogni micro-drive è composto da una custom-lavorati a vite e un tubo di supporto vuoto (Fig. 2). La vite e il tubo di supporto sono legati insieme in modo tale che un labbro sulla vite è incorporato in acrilico, lasciando la vite di ruotare liberamente (Fig. 2B). La vite viene infilato nella base di plastica, e il tubo di supporto è poi spinto verso l&#39;alto o verso il basso quando la vite è acceso, avanzando o ritraendo il tetrodo che essa porta. Per la facilità di regolazione del comportamento animale, la testa della vite è a forma di mezzo cilindro. Fare un cacciavite personalizzato per questo vite: <ol><li> Tagliare 5 cm di 15 tubi di acciaio inox Ga. </li><li> Prendete una delle viti personalizzati e macinare fuori dal labbro sporgente. </li><li> Inserire la vite nel tubo fino alla cima della vite è a filo con l&#39;estremità del tubo. </li><li> Schiacciare il tubo intorno al filettature ripetutamente con un paio di pinze di bloccaggio in modo che la vite non può ruotare rispetto alla cannula. </li><li> Utilizzare una morsa perno per tenere il driver personalizzato vite. Per fabbricare il micro-drive usiamo un 3-D stampo stampato in plastica con piccoli pozzi (3 mm x 5 mm, 2 mm di profondità). Ognuno ha ben due fori nella superficie inferiore, distanziate 2 millimetri a parte, per il tubo di supporto e la vite. In alternativa, gli stampi possono essere realizzati da un tecnopolimero come Delrin, usando un trapano a colonna per creare il bene e buchi. </li> <li> Preparare lo stampo eliminando il foro per la cannula di supporto utilizzando un ago di 23 Ga e toccando il foro per la vite come descritto per la base in plastica, di cui sopra. </li><li> Linea all&#39;interno del pozzo con lubrificante teflon o un sottile strato di vaselina per consentire il rilascio di acrilico dentale curato dallo stampo .. </li><li> Applicare lubrificante teflon per una vite e inserirla nello stampo con il cacciavite su misura fino i fili sono appena sotto il fondo del pozzo. </li><li> Irruvidire la parte superiore di 2-3 mm di una 14 mm di lunghezza tubo di supporto (23 Ga tubi di acciaio inossidabile), con una mola per migliorare l&#39;adesione della acrilico dentale. Inserirla nello stampo fino alla cima della cannula è a metà strada tra la parte superiore del pozzo e la parte superiore della vite. </li><li> Versare acrilico dentale nel pozzo. Movimento agitazione è utilizzato per garantire che l&#39;acrilico dentale scorre in tutti gli spazi intorno alla vite e tubo di sostegno. Eliminare eventuali bolle d&#39;aria con un piccolo ago. </li><li> Attendere che la acrilico dentale è completamente guarito (15-30 minuti) e quindi rimuovere il micro-drive dallo stampo girando la vite antiorario. </li><li> E &#39;importante fare un controllo di qualità del micro-unità. Ispezionare la acrilico curato dentale per crepe e / o bolle d&#39;aria, che di solito sono causate da acrilico dentali che era troppo spessa o troppo sottile. Inoltre, assicurarsi che la vite e il tubo di supporto sono paralleli tra loro e che la vite gira senza problemi. Viti e tubi di sostegno delle micro-unità che non soddisfano questi criteri possono essere craccate gratuitamente dal acrilico dentale e riciclati. </li><li> Ripetere i passaggi attraverso 5,6 5,11 fino ad avere 21 micro-unità. </li></ol></li> <li> L&#39;assemblaggio finale di micro-array di unità <ol> <li> Inferiore di ogni micro-drive nella base disco di plastica. Ogni micro-drive tubo di supporto dovrebbe muoversi senza problemi sia all&#39;interno della manica e sul suo tubo di guida stazionaria. Verificare che i tubi guida non deformarne il micro-drive viene abbassato. </li><li> Con il micro-drive completamente abbassato, aggiungere un sottile strato di acrilico dentale verso l&#39;interno della base del disco per fissare i tubi guida elettrodo in posizione. </li><li> Si noti che il mancato abbassare i dischi micro tutta la strada prima di aggiungere l&#39;acrilico dentale si tradurrà in wicking della acrilico tutta la strada le maniche e ostruzione di micro-drive movimento. </li><li> Etichettare il micro-drive 1-21. </li><li> Girare l&#39;array di unità a testa in giù e scatta una foto del fascio di tubi guida. Questo quadro sarà utilizzato per mappare la posizione del tubo di guida corrispondente a ciascun micro-drive. </li><li> Alzare tutte le micro-drive da alcuni mm. </li><li> Inserire un poliimmide tubo portante (0.005 &quot;) in ciascun tubo di guida dalla parte inferiore della base dell&#39;unità. Lasciate che il tubo portante estendere 1-2 mm dalla parte superiore del disco completamente abbassata micro-drive e sulla fotografia e l&#39;identità del corrispondente micro-drive. </li><li> Incollare ilvettore tubo al tubo di micro-drive supporta l&#39;utilizzo di 5 minuti o colla epossidica cianoacrilato. Si noti che la colla epossidica o troppo sottile scorrerà lungo la cannula sostegno e ostacolare il movimento libero del micro-unità o, peggio, fissare alla cannula guida. Se questo accade, quel particolare micro-drive unità non può essere utilizzato. </li><li> Abbassare completamente tutti i micro-unità. Tagliare tutti i tubi di supporto via filo alla base della cannula collettore utilizzando una lama di rasoio fresca. </li><li> Infine, montare la Neuralynx scheda di interfaccia elettrodo a base di guidare con due viti (dimensioni: 1-72, lunghezza: 3 / 16 &quot;). </li></ol></li></ol> A questo punto l&#39;array di unità è pronto per essere caricato con tetrodi. Fabbricazione di tetrodi, come caricarli nel micro-unità, e come preparare l&#39;array di unità per l&#39;impianto chirurgico sono oggetto di un articolo il video successivo. <img src="/files/ftp_upload/1094/Figure1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Modello di finito micro-drive array. Un micro-drive array è costituito da diversi componenti principali: una base di plastica drive; una cannula collezionista da cui il tetrodi entrare nel cervello, 21 micro-unità che ogni unità di un singolo tetrodo; una scheda di interfaccia elettrodo che si connette alla pre-amplificatori. <img src="/files/ftp_upload/1094/Figure2.png" alt="Figura 2" /> Figura 2. Personalizzati micro-drive viti. A. disegni tecnici di progettazione della vite personalizzata. La vite presenta una parte filettata (M1.2x0.25; 1,2 mm di diametro, 0,25 mm / giro)., Una mezza testata che corrisponda al nostro driver personalizzato vite fatte e una parte liscia con le labbra (vedi dettaglio) Modello B. completa di micro-unità. Il tubo di supporto e la vite personalizzati sono collegati con del cemento dentale. Il labbro sulla vite è incorporato nel cemento dentale e consente la rotazione libera durante la guida del tubo di supporto su o giù. File aggiuntivi Abbiamo progettato la base disco stampato, il cono di protezione e lo stampo per la costruzione del micro-drive in SolidWorks 2008 software CAD 3D: <ul style="list-style-type:none;"><li> Scarica il file: <a href="/files/ftp_upload/1094/DriveBase.SLDPRT">DriveBase.sldprt</a> che contiene i modelli della base dell&#39;unità e cono protettivo e cappello. </li><li> Scarica il file: <a href="/files/ftp_upload/1094/MicroDriveMold.SLDPRT">MicroDriveMold.sldprt</a> che contiene il modello del micro-drive stampo </li></ul> Il servizio di stampa 3D ufficio non può gestire file nativi di SolidWorks direttamente, ma richiede piuttosto il file di progetto in formato CAD stereolitografia (STL). Per le persone che non hanno accesso al software Solidworks, ma ancora desidera utilizzare le parti stampate usata nell&#39;articolo video che includono disegni in formato STL anche: <ul style="list-style-type:none;"><li> Scarica il file: <a href="/files/ftp_upload/1094/DriveBase.STL">DriveBase.stl</a> che contiene il modello di base di guidare </li><li> Scarica il file: <a href="/files/ftp_upload/1094/MicroDriveMold.STL">MicroDriveMold.stl</a> che contiene il modello di micro-drive stampo </li><li> Scarica il file: <a href="/files/ftp_upload/1094/ProtectionCap.STL">ProtectionCap.stl</a> che contiene il modello di cap per cono protettivo </li><li> Scarica il file: <a href="/files/ftp_upload/1094/ProtectionCone.STL">ProtectionCone.stl</a> che contiene il modello di cono protettivo </li></ul>

<ol>
	<li>Yamamoto, J., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+chronically+implantable+precision+motorized+microdrive+array+for+freely+behaving+animals.">Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals.</a> J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).</li></ol>

Questo protocollo descrive le caratteristiche generali del micro-drive processo di costruzione. E &#39;stato modificato con successo per la produzione di array di unità di registrazione con obiettivi più o meno gli array per le registrazioni nei topi. Oltre a registrare dalla ippocampo, molti ricercatori utilizzano queste unità per indirizzare le strutture corticali e sub-corticali. L&#39;uso di viti più lunghe può essere richiesto al fine di registrare da strutture cerebrali profonde. Con una sostanziale modifica ...

<table>
<tbody>
	<tr>
<td>3D-printed plastic parts</td>
<td>Material</td>
<td>American Precision Prototyping (www.approto.com)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parts are printed by stereolithography (SLA) using DSM 14120 'ABS-like', DSM 11120 'Watershed' or Accura 55 resins. Request high resolution, no sandblasting.</td>
</tr>
<tr>
<td>stainless steel tubing</td>
<td>Material</td>
<td>Small Parts (www.smallparts.com)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cut to custom length and deburred. Sizes: 13 Ga (1pc @ 10 mm), 15 Ga (1pc @ 50 mm), 20 Ga thin wall (21pcs @ 5 mm), 23 Ga (21pcs @ 14 mm) </td>
</tr>
<tr>
<td>Dental cement powder</td>
<td>Material</td>
<td>A-M Systems (www.a-msystems.com)</td>
<td>525000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dental cement solvent</td>
<td>Material</td>
<td>A-M Systems</td>
<td>526000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Electrode interface board</td>
<td>Material</td>
<td>Neuralynx (www.neuralynx.com)</td>
<td>EIB-81</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>micro-drive screws</td>
<td>Material</td>
<td>Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom made screws with M1.2x0.25 threads (1.2mm major diameter; 0.25 mm thread pitch) </td>
</tr>
<tr>
<td>'Tap-Ease' tapping lubricant </td>
<td>Tool</td>
<td>AGS Company</td>
<td>TA-2</td>
<td>Available from MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com)</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyimide tubing </td>
<td>Material</td>
<td>IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sizes:
30 Ga (outer diam: 0.0071", inner diam: 0.0116") 
5 mil (nominal outer diam: 0.0055", wall: 0.0010") </td>
</tr>
<tr>
<td>Cordless drill/driver </td>
<td>Tool</td>
<td>DeWalt (www.dewalt.com)</td>
<td>DC750KA </td>
<td>Any drill/driver with low-speed setting will do.</td>
</tr>
<tr>
<td>Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft </td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel (www.dremel.com)</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Razor blades </td>
<td>Tool</td>
<td>VWR (www.vwr.com)</td>
<td>55411-050</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Watch glass </td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>66112-107</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tap for custom screws</td>
<td>Tool</td>
<td>Balax</td>
<td>01302</td>
<td>M1.2x0.25 Thredfloer thread-forming tap. Available from MSC Industrial Supply.</td>
</tr>
<tr>
<td>Taps</td>
<td>Tool</td>
<td>Small Parts</td>
<td>HSBT-0172, HSBT-0080 </td>
<td>1-72, 0-80 bottoming taps</td>
</tr>
<tr>
<td>Pin vise</td>
<td>Tool</td>
<td>Vargus</td>
<td>3SHC1--I </td>
<td>To hold taps. Available from MSC Industrial Supply</td>
</tr>
<tr>
<td>Drill bits</td>
<td>Tool</td>
<td>Small Parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sizes: 65, 61, 1.55mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Benchtop vise</td>
<td>Tool</td>
<td>Panavise</td>
<td>301</td>
<td>Available from DigiKey (www.digikey.com).</td>
</tr>
<tr>
<td>No.2 Dumont forceps</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting (www.stoeltingco.com)</td>
<td>52100-27</td>
<td>Used for inserting 20 Ga thin wall sleeves.</td>
</tr>
<tr>
<td>5-minute epoxy</td>
<td>Tool</td>
<td>Allied Electronics (www.alliedelec.com)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers</td>
<td>Tool</td>
<td>Aven (www.aveninc.com)</td>
<td>18768 (Pattern 304)</td>
<td>Used for handling polyimide tubing.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com)</td>
<td>25-1000</td>
<td>Used for cutting polyimide carrier tubes</td>
</tr>
<tr>
<td>Xcelite 378M Pliers</td>
<td>Tool</td>
<td>Newark</td>
<td>96F8903</td>
<td>Used for handling stainless steel tubing and for construction of custom screwdriver.</td>
</tr>
<tr>
<td>mini pin vise</td>
<td>Tool</td>
<td>MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com)</td>
<td>00920314 </td>
<td>Used as a handle for custom made screwdriver.</td>
</tr>		
</tbody>
</table>

micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication

Registrazione cronica di grandi popolazioni di neuroni è una tecnica utile per studiare la funzione dei circuiti neuronali in ratti svegli comportarsi. Dispositivi di registrazione leggero portando una serie ad alta densità di tetrodi consentire il monitoraggio simultaneo dell&#39;attività di decine o centinaia di singoli neuroni. Qui si descrive un protocollo per la realizzazione di un micro-drive array con 21 indipendentemente mobile micro-unità. Questo dispositivo è stato usato con successo per registrare da neuroni corticali e dell&#39;ippocampo nel nostro laboratorio. Mostriamo come preparare un costume disegnato, 3-D di base stampata in plastica che si terrà il micro-drive. Dimostriamo come costruire le singole micro-unità e come assemblare l&#39;intero micro-drive array. Ulteriore preparazione del array di unità per l&#39;impianto chirurgico, come ad esempio la fabbricazione di tetrodi, carico di tetrodi in array di unità e di doratura, è coperto in un articolo il video successivo.

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Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

In questo protocollo dimostriamo come fabbricare un micro-drive array per registrazioni elettrofisiologiche cronica nei ratti.

Micro-drive array per la cronica In vivo</emRegistrazione>: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-drive-fabrication

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

25.2K Views.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. In questo protocollo dimostriamo come fabbricare un micro-drive array per registrazioni elettrofisiologiche cronica nei ratti.

Video: Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Population Replacement Strategies for Controlling Vector Populations and the Use of Wolbachia pipientis for Genetic Drive

In this video, Jason Rasgon discusses population replacement strategies to control vector-borne diseases such as malaria and dengue. "Population replacement" is the replacement of wild vector populations (that are competent to transmit pathogens) with those that are not competent to transmit pathogens. There are several theoretical strategies to accomplish this. One is to exploit the maternally-inherited symbiotic bacteria Wolbachia pipientis. Wolbachia is a widespread reproductive parasite that spreads in a selfish manner at the extent of its host's fitness. Jason Rasgon discusses, in detail, the basic biology of this bacterial symbiont and various ways to use it for control of vector-borne diseases.

In this interview, Jason Rasgon explains the concept of genetic drive and the characteristics of an effective gene drive system. The use of the endosymbiotic bacterium, Wolbachia pipientis, as a means to spread genes through mosquito populations, is hypothesized.

Strategie di ricambio della popolazione per popolazioni di vettori Controllo e l&#39;uso di Wolbachia pipientis per l&#39;unità genetica

In this video, Jason Rasgon discusses population replacement strategies to control vector-borne diseases such as malaria and dengue. "Population ...

Ricerca

Biologia

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Applicazione della Luce cured resina adesiva dentale per montaggio elettrodi o sonde Microdialisi negli esperimenti cronica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunoistochimica su sezioni di paraffina di epidermide mouse utilizzando anticorpi fluorescenti

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A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

Un Chirurgia Procedura Craniotomia per l&#39;imaging cerebrale cronica

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Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential amplitude of action potential signatures over the channels of a tetrode allows for the isolation of single-unit activity from multi-unit signals.  The ability to precisely control the stereotaxic location and depth of the tetrode is critical for studying coordinated neural activity across brain regions.  In combination with a micro-drive array, it is possible to achieve precise placement and stable control of many tetrodes over the course of days to weeks.  In this protocol, we demonstrate how to fabricate and condition tetrodes using basic tools and materials, install the tetrodes into a multi-drive tetrode array for chronic in-vivo recording in the rat, make ground wire connections to the micro-drive array, and attach a protective cone onto the micro-drive array in order to protect the tetrodes from physical contact with the environment.



Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

In this protocol we demonstrate how to fabricate and condition tetrodes for use with a micro-drive array, which was designed for chronic electrophysiological recordings in rats. In addition, we illustrate the final stages of micro-drive array construction, which includes installing ground wires and a protective cone.

Micro-drive array per la cronica In vivo</emRegistrazione>: tetrodo Assemblea

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Micro-drive array per la cronica In vivo: Drive Fabrication

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Strategie di ricambio della popolazione per popolazioni di vettori Controllo e l'uso di Wolbachia pipientis per l'unità genetica