Gostaríamos de agradecer Linus D. Sol e Jeenah Jung, que originou o uso do computador projetado, 3-D unidades impressas em nosso laboratório para a gravação de ratos. Além disso, gostaríamos de agradecer todos os membros Lab passado e do presente Wilson por suas contribuições para micro-drive e desenvolvimento tetrode tecnologia no laboratório.

<ol><li> Micro-drive visão série Uma matriz micro-drive completo é composto por vários componentes principais (Fig. 1): <ol><li> Um computador projetado base de plástico que contém 21 independentemente móveis micro-drives. </li><li> A cânula na parte inferior da base em que um conjunto de tubos de guia estacionário tetrode é coletado. </li><li> 21 micro-unidades que são portadores de um tetrode e que podem ser individualmente controlado através de um parafuso. </li><li> Uma placa de interface eletrodo de interligação entre tetrodes e pré-amplificadores. </li><li> Um cone de proteção (não é mostrado na Figura 1.) </li><li> Em um conjunto totalmente montado micro-drive, a base de plástico detém todas as unidades de micro-. Cada unidade micro-carrega um tetrode único. O tetrode é eletricamente conectada à placa de interface eletrodo no topo da matriz micro-drive, e passa através do tubo de guia estacionário para sair para o cérebro, na parte inferior da matriz drive-micro. Girando o parafuso em cada unidade micro-adiantamentos ou retrai o tetrode. </li></ol></li> <li> Desenho de base de plástico Nós projetamos a base de montagem a unidade de micro-nos um pacote de software 3-D CAD (SolidWorks). A vantagem deste processo de design in-house é rápida rotatividade e flexibilidade de design. No laboratório Wilson criamos muitas variantes desta parte, voltada para as demandas específicas de cada experimento. O arquivo modelo 3-D é enviado para um bureau de serviços, onde é impresso a partir de uma resina líquida laser-curável usando estereolitografia. Tempo de resposta é tão pouco como dois dias. A peça resultante é leve, reutilizável e pode ser usinado a realização de uma discussão. Neste protocolo, vamos utilizar uma base de unidade que é projetado com um site de gravação única e que possui 21 micro-drives. O arquivo de projeto do SolidWorks é disponibilizado mediante solicitação. </li> <li> Preparação de base de plástico A base de plástico é transformado para acomodar as unidades de micro-e os parafusos para fixar a placa de interface eletrodo eo cone de proteção. Não é possível qualidade da impressão suave através de furos na base de plástico, portanto, criamos buracos subdimensionado, então expandi-los por perfuração. Alinhe cuidadosamente a broca com o eixo do furo existente antes de perfurar a uma velocidade muito baixa. A broca de velocidade variável / torque funciona bem para esta tarefa. <ol><li> Faça os furos piloto 21 para a unidade de micro-parafusos (anel externo) usando um pouco # 61. </li><li> Perfurar os 21 buracos para os tubos da unidade micro-suporte (o anel interno), utilizando um pouco # 65. </li><li> Faça os furos que serão utilizados para fixar a placa de interface eletrodo e cone de proteção usando um pouco milímetros 1,55. </li><li> Encaixe uma manga (5 mm de comprimento 20 Ga de parede fina tubos de aço inoxidável) em cada um dos buracos do anel interno usando um par de pinças ou um par de alicates para que ela fique alinhada com a base de plástico. As mangas assegurar um movimento suave dos tubos da unidade micro-apoio. Em seguida, todos os buracos que irá realizar os parafusos são exploradas. Impresso em plásticos, linha de formação de resultado torneiras em mais durável do que o típico tópicos fio de corte de torneiras. Este estilo de tocar requer furos maiores piloto. Usando um torno do pino de mão para segurar a torneira: </li> <li> Toque os buracos para a unidade de micro-parafusos usando uma torneira que corresponde ao tamanho do parafuso a ser utilizado (M1.2x0.25) e um lubrificante seco. Para ajudar a alinhar a torneira com o furo piloto, insira um comprimento de 23 tubos de Ga na manga ao lado dele. </li><li> Nosso projeto base de plástico apresenta um acionador de partida da torneira para cada furo de parafuso micro-drive para garantir que o tópicos iniciais não são danificados durante o processo de segmentação. Depois de todos os buracos são segmentadas, esses iniciantes da torneira pode ser facilmente agarrado fora usando uma lâmina de barbear. </li><li> Toque os buracos que irá realizar os parafusos para a placa de interface eletrodo eo cone de proteção usando um toque 1-72. </li></ol></li> <li> Inserção de tubos de guia eletrodo <ol> <li> Para fazer com que a cânula que contém todos os tubos de guia estacionário eletrodo, corte um pedaço 1,5 centímetros de comprimento de 13 tubos de aço inoxidável e Ga encrespar a superfície com uma roda de moagem dremel para melhorar a adesão pelo acrílico dental. </li><li> Insira este cânula no orifício na parte inferior da base de plástico, verifique se ele é co-linear com o eixo vertical da unidade, e prenda-o com acrílico dental ou epóxi. Deixe 5 a 7 mm da cânula expostos para facilitar implantação cirúrgica. </li><li> Cortar 21 tubos de eletrodo estacionário guia (flexível poliimida diâmetro, a tubulação interna: 0,0071 &quot;, diâmetro externo: 0,0116&quot;) com uma lâmina de barbear para um comprimento de 6 cm. </li><li> Alimentar os tubos de guia um de cada vez nas mangas, na parte superior da base da unidade e todo o caminho através da cânula coletor na parte inferior. Verificar visualmente para torções ou excessiva tubos de flexão e substitua se necessário. Para facilitar a inserção e alinhamento paralelo dos tubos guia tetrode, pode-se começar com a primeira alimentação do pacote inteiro de 21 tubos de guia para dentro docoletor de cânula de baixo. Então, um de cada vez, retire um tubo de guia do conjunto e alimentá-lo a partir do topo da base plástica através do buraco que ele deixou para trás no pacote. </li><li> Empurre a guia para baixo até que os tubos se estendem apenas 1-2 mm do topo da base de plástico. Aplique uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato fina para os tubos como eles saem da cânula coletor, tendo o cuidado de não deixar qualquer fluxo de cola-se na extremidade dos tubos guia. </li><li> Use uma lâmina de barbear fresco para cortar o excesso do feixe de tubos de guia na parte inferior da cânula coletor. </li> </ol></li><li> Fabricação de micro-drives Cada unidade micro-consiste de um parafuso custom-usinado e um tubo de suporte oco (Fig. 2). O parafuso e tubo de apoio são ligados em conjunto de tal forma que um lábio no parafuso é incorporado em acrílico, deixando o parafuso para girar livremente (Fig. 2B). O parafuso é rosqueada na base de plástico, eo tubo de suporte é então conduzido para cima ou para baixo quando o parafuso é girado, avançar ou retrair o tetrode que ele carrega. Para maior facilidade de ajuste no animal se comportando, a cabeça do parafuso é na forma de um meio cilindro. Faça uma chave de fenda personalizado para este parafuso: <ol><li> Corte de 5 cm de 15 tubos de aço inoxidável Ga. </li><li> Pegue um dos parafusos personalizados e moer fora do bordo saliente. </li><li> Insira o parafuso no tubo até o topo do parafuso fique nivelada com a extremidade do tubo. </li><li> Esmagar os tubos ao redor do roscas repetidamente com um par de alicates de travamento de modo que o parafuso não pode girar em relação à cânula. </li><li> Use um torno do pino para segurar a chave de fenda personalizado. Para fabricar os discos micro-usamos um 3-D molde impresso de plástico com pequenos poços (3 mm x 5 mm, 2 mm de profundidade). Cada poço tem dois buracos na superfície inferior, com espaçamento de 2 mm, para o tubo de suporte eo parafuso. Alternativamente, os moldes podem ser fabricados a partir de um plástico de engenharia, como Delrin, usando uma furadeira para criar o bem e buracos. </li> <li> Prepare o molde, limpando o buraco para a cânula de suporte usando uma agulha de 23 Ga e batendo o buraco para o parafuso, conforme descrito para a base de plástico, acima. </li><li> Linha dentro da bem com teflon lubrificante ou uma película fina de vaselina para permitir a liberação do acrílico dental curada do molde .. </li><li> Aplique lubrificante teflon a um parafuso e insira-o molde usando a chave de fenda feitos até os fios estão logo abaixo do fundo do poço. </li><li> Irritar a 2-3 mm topo de um tubo de suporte 14 milímetros de comprimento (23 Ga tubos de aço inoxidável) com um rebolo para melhorar a aderência do acrílico dental. Insira-o no molde até o topo da cânula é metade do caminho entre o topo do poço eo topo do parafuso. </li><li> Despeje acrílica dental dentro do poço. Movimento de agitação é usado para garantir que o acrílico dental flui em todos os espaços ao redor do parafuso e tubo de suporte. Remover quaisquer bolhas de ar com uma pequena agulha. </li><li> Aguarde até que o acrílico dental é completamente curado (15-30 minutos) e remova a unidade micro-do molde, girando o parafuso de contra-relógio sábio. </li><li> É importante fazer um controlo de qualidade das unidades de micro-. Inspecionar o acrílico dental curada por rachaduras e / ou bolhas de ar, que geralmente são causados ​​por acrílico dental que era demasiado grossa ou muito fina. Além disso, certifique-se o parafuso e tubo de suporte são paralelas entre si e que o parafuso gira suavemente. Parafusos e tubos de suporte de micro-unidades que não cumpram estes critérios pode ser quebrada livre do acrílico dental e reciclados. </li><li> Repita os passos 5,6 por 5,11 até que tenha 21 micro-drives. </li></ol></li> <li> Montagem final do micro-drive série <ol> <li> Inferior cada unidade micro-unidade na base de plástico. Cada tubo de suporte micro-drive deve mover-se suavemente dentro de sua luva e sobre o seu tubo de guia estacionário. Certifique-se que os tubos guia não fiquem deformadas como a unidade de micro-está sendo reduzido. </li><li> Com as unidades de micro-totalmente abaixada, adicionar uma camada fina de acrílico dental para o interior da base de unidade para corrigir os tubos guia eletrodo no lugar. </li><li> Que na falta de mais baixa das unidades micro todo o caminho antes de adicionar o acrílico dental irá resultar em absorção do acrílico todo o caminho até as mangas e obstrução da unidade de micro movimento. </li><li> Rotular o micro-drives 21/01. </li><li> Vire a unidade matriz de cabeça para baixo e tirar uma foto do feixe de tubos de guia. Esta imagem será usada para mapear a localização do tubo guia correspondente a cada unidade de micro-. </li><li> Levantar todas as unidades de micro-por vários milímetros. </li><li> Inserir um tubo transportador poliimida (0,005 &quot;) para cada tubo guia da parte inferior da base da unidade. Deixe o tubo transportador estender 1-2 mm do topo do registro totalmente abaixada e drive-micro e na fotografia a identidade do unidade de micro-correspondente. </li><li> Cole astubo transportador para o tubo de suporte micro-drive usando 5 minutos epóxi ou cola de cianoacrilato. Note-se que a cola epóxi ou muito fino fluirá para baixo a cânula de apoio e obstruir o movimento livre da unidade micro-ou, pior, corrigi-lo para a cânula guia. Se isso acontecer, essa unidade micro-drive especial não pode ser usado. </li><li> Abaixe totalmente todas as unidades de micro-. Cortar todos os tubos de descarga transportadora off na parte inferior da cânula coletor usando uma lâmina de barbear fresco. </li><li> Finalmente, montar a placa de interface Neuralynx eletrodo à base da unidade utilizando dois parafusos (tamanho: 1-72, comprimento: 3 / 16 &quot;). </li></ol></li></ol> Neste ponto, a unidade matriz está pronto para ser carregado com tetrodes. Fabricação de tetrodes, como colocá-las no micro-drives, e como preparar a matriz unidade para implantação cirúrgica são os temas de um artigo de vídeo subseqüentes. <img src="/files/ftp_upload/1094/Figure1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Modelo de matriz micro drive-acabados. A unidade matriz micro-consiste de vários componentes principais: uma base de movimentação de plástico, um coletor de cânula que o tetrodes entrar no cérebro, 21 micro-unidades que cada unidade um tetrode único; uma placa de interface eletrodo que conecta a pré-amplificadores. <img src="/files/ftp_upload/1094/Figure2.png" alt="Figura 2" /> Figura 2. Personalizado disco micro-parafusos. A. desenhos técnicos do projeto parafuso personalizado. O parafuso possui uma parte roscada (M1.2x0.25; 1,2 mm de diâmetro, 0,25 mm / volta)., Uma cabeça semi-cilindro que corresponde a nossa chave de fenda feitos e uma parte lisa com lábio (ver detalhe) B. Modelo de unidade de micro-completa. O tubo de suporte e parafusos personalizados são ligados com cimento dental. O lábio no parafuso é incorporado no cimento dental e permite a rotação livre durante a condução do tubo de suporte para cima ou para baixo. Arquivos adicionais Nós projetamos a base da unidade impressa, o cone de proteção eo molde para a construção das unidades de micro-in SolidWorks 2008 software CAD 3D: <ul style="list-style-type:none;"><li> Baixar o arquivo: <a href="/files/ftp_upload/1094/DriveBase.SLDPRT">DriveBase.sldprt</a> que contém os modelos da base de unidade e cone de proteção e gorro. </li><li> Baixar o arquivo: <a href="/files/ftp_upload/1094/MicroDriveMold.SLDPRT">MicroDriveMold.sldprt</a> que contém modelo do molde micro-drive </li></ul> O bureau de serviços de impressão 3D não pode lidar com arquivos nativos Solidworks diretamente, mas sim requer os arquivos de desenho em CAD formato estereolitografia (STL). Para as pessoas que não têm acesso a software Solidworks, mas ainda gostaria de usar as peças impressos utilizados no artigo de vídeo que incluem os desenhos em formato STL também: <ul style="list-style-type:none;"><li> Baixar o arquivo: <a href="/files/ftp_upload/1094/DriveBase.STL">DriveBase.stl</a> que contém modelo de base de disco </li><li> Baixar o arquivo: <a href="/files/ftp_upload/1094/MicroDriveMold.STL">MicroDriveMold.stl</a> que contém modelo de micro-drive de moldes </li><li> Baixar o arquivo: <a href="/files/ftp_upload/1094/ProtectionCap.STL">ProtectionCap.stl</a> que contém modelo de tampa para o cone de proteção </li><li> Baixar o arquivo: <a href="/files/ftp_upload/1094/ProtectionCone.STL">ProtectionCone.stl</a> que contém modelo de cone de proteção </li></ul>

<ol>
	<li>Yamamoto, J., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+chronically+implantable+precision+motorized+microdrive+array+for+freely+behaving+animals.">Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals.</a> J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).</li></ol>

Este protocolo descreve as características gerais do processo de construção micro-drive. Foi com sucesso modificado para produzir matrizes de unidade com metas de gravação múltipla ou matrizes menores para gravações em camundongos. Além da gravação do hipocampo, muitos pesquisadores usam essas unidades para atingir estruturas corticais e sub-cortical. O uso de parafusos mais longos podem ser necessários, a fim de gravar a partir de estruturas mais profundas do cérebro. Com uma ampla modificação na base da...

<table>
<tbody>
	<tr>
<td>3D-printed plastic parts</td>
<td>Material</td>
<td>American Precision Prototyping (www.approto.com)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parts are printed by stereolithography (SLA) using DSM 14120 'ABS-like', DSM 11120 'Watershed' or Accura 55 resins. Request high resolution, no sandblasting.</td>
</tr>
<tr>
<td>stainless steel tubing</td>
<td>Material</td>
<td>Small Parts (www.smallparts.com)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cut to custom length and deburred. Sizes: 13 Ga (1pc @ 10 mm), 15 Ga (1pc @ 50 mm), 20 Ga thin wall (21pcs @ 5 mm), 23 Ga (21pcs @ 14 mm) </td>
</tr>
<tr>
<td>Dental cement powder</td>
<td>Material</td>
<td>A-M Systems (www.a-msystems.com)</td>
<td>525000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dental cement solvent</td>
<td>Material</td>
<td>A-M Systems</td>
<td>526000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Electrode interface board</td>
<td>Material</td>
<td>Neuralynx (www.neuralynx.com)</td>
<td>EIB-81</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>micro-drive screws</td>
<td>Material</td>
<td>Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom made screws with M1.2x0.25 threads (1.2mm major diameter; 0.25 mm thread pitch) </td>
</tr>
<tr>
<td>'Tap-Ease' tapping lubricant </td>
<td>Tool</td>
<td>AGS Company</td>
<td>TA-2</td>
<td>Available from MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com)</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyimide tubing </td>
<td>Material</td>
<td>IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sizes:
30 Ga (outer diam: 0.0071", inner diam: 0.0116") 
5 mil (nominal outer diam: 0.0055", wall: 0.0010") </td>
</tr>
<tr>
<td>Cordless drill/driver </td>
<td>Tool</td>
<td>DeWalt (www.dewalt.com)</td>
<td>DC750KA </td>
<td>Any drill/driver with low-speed setting will do.</td>
</tr>
<tr>
<td>Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft </td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel (www.dremel.com)</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Razor blades </td>
<td>Tool</td>
<td>VWR (www.vwr.com)</td>
<td>55411-050</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Watch glass </td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>66112-107</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tap for custom screws</td>
<td>Tool</td>
<td>Balax</td>
<td>01302</td>
<td>M1.2x0.25 Thredfloer thread-forming tap. Available from MSC Industrial Supply.</td>
</tr>
<tr>
<td>Taps</td>
<td>Tool</td>
<td>Small Parts</td>
<td>HSBT-0172, HSBT-0080 </td>
<td>1-72, 0-80 bottoming taps</td>
</tr>
<tr>
<td>Pin vise</td>
<td>Tool</td>
<td>Vargus</td>
<td>3SHC1--I </td>
<td>To hold taps. Available from MSC Industrial Supply</td>
</tr>
<tr>
<td>Drill bits</td>
<td>Tool</td>
<td>Small Parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sizes: 65, 61, 1.55mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Benchtop vise</td>
<td>Tool</td>
<td>Panavise</td>
<td>301</td>
<td>Available from DigiKey (www.digikey.com).</td>
</tr>
<tr>
<td>No.2 Dumont forceps</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting (www.stoeltingco.com)</td>
<td>52100-27</td>
<td>Used for inserting 20 Ga thin wall sleeves.</td>
</tr>
<tr>
<td>5-minute epoxy</td>
<td>Tool</td>
<td>Allied Electronics (www.alliedelec.com)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers</td>
<td>Tool</td>
<td>Aven (www.aveninc.com)</td>
<td>18768 (Pattern 304)</td>
<td>Used for handling polyimide tubing.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com)</td>
<td>25-1000</td>
<td>Used for cutting polyimide carrier tubes</td>
</tr>
<tr>
<td>Xcelite 378M Pliers</td>
<td>Tool</td>
<td>Newark</td>
<td>96F8903</td>
<td>Used for handling stainless steel tubing and for construction of custom screwdriver.</td>
</tr>
<tr>
<td>mini pin vise</td>
<td>Tool</td>
<td>MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com)</td>
<td>00920314 </td>
<td>Used as a handle for custom made screwdriver.</td>
</tr>		
</tbody>
</table>

micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication

Gravação de crônicas de grandes populações de neurônios é uma técnica valiosa para estudar a função dos circuitos neuronais em ratos acordados comportando. Dispositivos de gravação leve carregando um conjunto de alta densidade de tetrodes permitir o monitoramento simultâneo da atividade de dezenas a centenas de neurônios individuais. Aqui nós descrevemos um protocolo para a fabricação de uma matriz de unidade-micro com 21 independentemente móveis micro-drives. Este dispositivo tem sido usado com sucesso para gravar a partir de neurônios do hipocampo e cortical em nosso laboratório. Vamos mostrar como preparar um design personalizado, 3-D de base impressa de plástico que conterá o micro-drives. Demonstramos como construir o indivíduo micro-unidades e como montar a matriz drive-micro completo. De preparação da matriz unidade para implantação cirúrgica, tal como a fabricação de tetrodes, carregamento de tetrodes na unidade matriz eo excesso de regulamentação, é coberto em um artigo de vídeo subseqüentes.

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Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Neste protocolo, demonstramos como fabricar uma matriz de unidade de micro-crônica para gravações eletrofisiológicas em ratos.

Micro-drive Array para Crônica In vivo</emGravação>: Fabricação Unidade

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-drive-fabrication

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

25.2K visualizações.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. Neste protocolo, demonstramos como fabricar uma matriz de unidade de micro-crônica para gravações eletrofisiológicas em ratos.

Vídeo: Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Population Replacement Strategies for Controlling Vector Populations and the Use of Wolbachia pipientis for Genetic Drive

In this video, Jason Rasgon discusses population replacement strategies to control vector-borne diseases such as malaria and dengue. "Population replacement" is the replacement of wild vector populations (that are competent to transmit pathogens) with those that are not competent to transmit pathogens. There are several theoretical strategies to accomplish this. One is to exploit the maternally-inherited symbiotic bacteria Wolbachia pipientis. Wolbachia is a widespread reproductive parasite that spreads in a selfish manner at the extent of its host's fitness. Jason Rasgon discusses, in detail, the basic biology of this bacterial symbiont and various ways to use it for control of vector-borne diseases.

In this interview, Jason Rasgon explains the concept of genetic drive and the characteristics of an effective gene drive system. The use of the endosymbiotic bacterium, Wolbachia pipientis, as a means to spread genes through mosquito populations, is hypothesized.

População Estratégias de substituição para Populações Vector Controle e Uso de Wolbachia para pipientis Unidade Genética

In this video, Jason Rasgon discusses population replacement strategies to control vector-borne diseases such as malaria and dengue. "Population ...

Biologia

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Aplicação de Light-resina adesivo dental para Eletrodos de montagem ou Sondas microdiálise em Experimentos crônica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Imuno-histoquímica em parafina da epiderme do rato utilizando anticorpos fluorescentes

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

Um procedimento de cirurgia Craniotomia para Brain Imaging crônica

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential amplitude of action potential signatures over the channels of a tetrode allows for the isolation of single-unit activity from multi-unit signals.  The ability to precisely control the stereotaxic location and depth of the tetrode is critical for studying coordinated neural activity across brain regions.  In combination with a micro-drive array, it is possible to achieve precise placement and stable control of many tetrodes over the course of days to weeks.  In this protocol, we demonstrate how to fabricate and condition tetrodes using basic tools and materials, install the tetrodes into a multi-drive tetrode array for chronic in-vivo recording in the rat, make ground wire connections to the micro-drive array, and attach a protective cone onto the micro-drive array in order to protect the tetrodes from physical contact with the environment.



Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

In this protocol we demonstrate how to fabricate and condition tetrodes for use with a micro-drive array, which was designed for chronic electrophysiological recordings in rats. In addition, we illustrate the final stages of micro-drive array construction, which includes installing ground wires and a protective cone.

Micro-drive Array para Crônica In vivo</emGravação>: Assembléia Tetrodo

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo como Cultura Wholemount organotípicas murino da retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Matriz Hibridização Genômica Comparativa (Array CGH) para a detecção de Genomic copiar o número de variantes

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Micro-drive Array para Crônica In vivo: Fabricação Unidade