Fase 1 <ol><li> Piastra mitomicina-C ggrowth inibito (10 mg / ml per 2,5 ore) MS5 cellule ad una densità di 70.000 / cm2 di gelatina rivestita (0,01% per 30 minuti) 6 piastre in α-MEM media. </li><li> Quando le cellule sono collegate e hanno formato un monostrato (oltre crescita notte), passare a SRM. </li><li> Manualmente isolare colonie di cellule ES da colture di cellule ES usando una siringa con un ago 27 ½ G. </li><li> Tritrurate le colonie accuratamente con una punta di 1 ml di blu e la piastra a bassa densità sul MS5 cellule (di solito 2-3 colonie per 6 pozzetti). </li></ol> Nota: Le cellule ES possono anche essere prelevati da propagazione enzimatica con collagenasi e tripsina. Fase 2 <ol><li> Crescere le cellule ES sul MS5 alimentatori per 14-21 giorni fino a rosetta contenenti formano colonie. </li></ol> Nota: i media cambiano spesso. Le rosette sono di solito ai bordi esterni delle colonie e la loro formazione può essere notevolmente migliorata se 300-500 ng / ml Noggin viene aggiunto al SRM (3). In alcuni protocolli di differenziazione, SRM possono essere scambiati con N2-A media e integrata con altri fattori di crescita o di promuovere specifiche cellule (2-5). Fase 3 <ol><li> Isolare e scegliere le rosette con un 27 ½ ago G al microscopio. </li></ol> Nota: Evitare di tagliare e scegliere i MS5 cellule stromali. Se le colonie sono pieni di rosette, si può anche isolare l&#39;intera colonia. Fase 4 <ol><li> Aspirare il cluster di rosette, li tritrurate accuratamente con una punta di 1 ml blu, e la piastra li poli-L-ornitina (0,001%) e fibronectina (1 mg / ml) o laminina (1 mg / ml) rivestita 6 pozzi in N2-Una media di solito integrati con bFGF (20 ng / ml). Le rosette si riforma e si espandono. </li></ol> Nota: per migliorare la sopravvivenza delle cellule, si possono piatto i cluster di piccole gocce di aumentare la densità delle cellule. Questa fase può anche essere modificata, che completa l&#39;N2-A media con un&#39;ulteriore crescita o altri fattori di promuovere la specificazione delle cellule (2-5).

<ol>
	<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li><li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+dopaminergic+neurons.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons.</a> Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).</li><li>Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+and+methods+for+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+cell+populations.">Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations.</a> Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).</li><li>Sonntag, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yield+of+neuroepithelial+precursors+and+midbrain-like+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+using+the+bone+morphogenic+protein+antagonist+noggin.">Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin.</a> Stem Cells. 25, 411-418 (2007).</li><li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopaminergic+neurons+and+pigmented+epithelia+from+primate+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).</li><li>Ko, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors+as+a+continuous,+stable,+and+on-demand+source+for+human+dopamine+neurons.">Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons.</a> J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).</li><li>Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+precursors+derived+from+human+embryonic+stem+cells+maintain+long-term+proliferation+without+losing+the+potential+to+differentiate+into+all+three+neural+lineages,+including+dopaminergic+neurons.">Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons.</a> J Neurochem. , (2007).</li><li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+subtype+specification+from+embryonic+stem+cells.">Neural subtype specification from embryonic stem cells.</a> Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).</li><li>Pankratz, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage.">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+neural+rosettes+from+cloned+bovine+blastocysts:+a+model+of+early+neurulation+events+and+neural+crest+specification+in+vitro.">Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro.</a> Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).</li><li>Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+peripheral+sensory+and+sympathetic+neurons+and+neural+crest+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 923-930 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo protocollo mostra le diverse fasi di generazione e isolare le cellule neuroepiteliale da cellule staminali embrionali umane usando SDIA. L&#39;applicazione di questo metodo è molteplice ed è stato utilizzato in molti protocolli di produrre neuroni specificato (ad esempio 1, 2, 5-9). Le rosette sono pensati per assomigliare a cellule del tubo neurale con un fenotipo anteriore (2, 5, 10) e contengono anche progenitori della cresta neurale (11, 12). Inoltre, essi mantengono un certo grado di plasticità, in quanto possono essere model...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>alpha-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>12571</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>penicillin/streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout-DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10829</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout serum replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM non-essential amino acid solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>12383</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N2-A supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>07152</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>mitomycin-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gelatine type-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1890</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>poly-L-ornithine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4957</td>
<td>0.01 % solution </td>
</tr>
<tr>
<td>laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L-2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F2006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml syringe with 27 1/2 G needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309623</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N2-A media</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DMEM/F12 + 1% N2-A supplement </td>
</tr>
<tr>
<td>Serum replacement media (SRM)</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Knockout-DMEM + 20 % Knockout serum replacement +1% MEM non-essential amino acid solution + 2 mM L-glutamine</td>
</tr>
<tr>
<td>&#x03B1;-MEM media</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&#x03B1;-MEM + 10 % FBS + 2 mM L-glutamine + 1%penicillin/streptomycin</td>
</tr>
<tr>
<td>MS5</td>
<td>cell line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>stromal cells </td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6 well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for tissue culture</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

es cell-derived neuroepithelial cell cultures

Le cellule staminali hanno la potenzialità di differenziarsi in cellule di tutti i foglietti embrionali, che li rende uno strumento interessante per lo sviluppo di nuove terapie. In generale, la differenziazione delle cellule staminali embrionali segue il concetto di generare prime cellule progenitrici immature, che poi possono essere propagate e differenziato in maturo fenotipi cellulari. Ciò vale anche per ES derivati ​​dalle cellule neurogenesi, in cui lo sviluppo delle cellule neurali segue due fasi principali: in primo luogo, la derivazione e l&#39;espansione di precursori immaturi neuroepiteliale e la seconda, la loro differenziazione in cellule nervose mature. Un metodo comune per la produzione di progenitori neurali da cellule staminali embrionali è basato sul corpo (EB) la formazione, che rivela la differenziazione delle cellule germinali da tutti i livelli compresi neuroectoderma. Un metodo alternativo e più efficiente per indurre lo sviluppo neuroepiteliale cella utilizza cellule stromali derivate attività induttiva (SDIA), che può essere raggiunto da co-colture di cellule ES con l&#39;osso del cranio derivate dal midollo cellule stromali (1). Entrambi, formazione EB e SDIA, rivelano lo sviluppo di rosetta-come le strutture, che si pensa ad assomigliare a tubo neurale e / o cresta neurale, come progenitori. I precursori neurali possono essere isolati, ampliato e ulteriormente differenziate in neuroni e cellule gliali specifici utilizzando condizioni di coltura definiti. Qui, descriviamo la generazione e l&#39;isolamento di queste rosette in co-coltura esperimenti con la linea di cellule stromali MS5 (2-5).

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ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

Derivazione di precursori neuroepiteliale da staminali embrionali (ES), le cellule stromali utilizzando cellule derivate attività induttiva (SDIA).

ES Cell-derivati ​​colture cellulari neuroepiteliale

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

es-cell-derived-neuroepithelial-cell-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Views.  Harvard Medical School. Derivazione di precursori neuroepiteliale da staminali embrionali (ES), le cellule stromali utilizzando cellule derivate attività induttiva (SDIA).

ES Cell-derivati ​​colture cellulari neuroepiteliale

ES Cell-derivati colture cellulari neuroepiteliale