저자는 수정 EpiDerm SIT (5 멀티 센터 국제 검증 연구에 참여하기 위해 BfR (독일), BASF SE (독일), IIVS 주식 회사 (미국), Zet - LSL (오스트리아)에서 ZEBET에 감사드립니다 ).

I. 조직 헤어드라 이어 - 주 영 <ol><li> EpiDerm 에피 - 200 - SIT 키트 수령시, 무결성에 대한 모든 키트 구성 요소 (키트 자세한 내용은 특정 시약 및 장비의 표 참조) 확인하십시오. </li><li> 모든 세 EpiDerm 조직 들어, 하나의 무균 6 웰 플레이트 분석 매체의 0.9 ML로 미리 채워진을 준비합니다. </li><li> 무균 조건에서 EpiDerm 조직을 포함하는 24 잘 플레이트가 들어있는 비닐 봉투를 열고 멸균 거즈를 제거합니다. </li><li> EpiDerm 조직을 포함하는 각각의 삽입을 제거하고 빈 24 잘 플레이트에 삽입을 배치 살균 집게를 사용하십시오. 이 단계 동안, 살균 필터 종이에 모래 바닥 부드러운하여 삽입의 바깥 양쪽에 부합하는 나머지 운송 아가로 오스를 제거합니다. </li><li> 다음 5 분 이내, 시각적으로 조직을 검사. 완전히 액체로 덮여 결함이 조직이나 조직을 사용하지 마십시오. </li><li> 멸균 면봉 팁 면봉을 사용하여 조심스럽게 조직의 표면을 건조. 직접 조직을 만지지 마 - 모세관 효과는 조직 표면에서 수분을 제거하기에 충분합니다. </li><li> 조직 표면을 건조 후 6 웰 플레이트 분석 매체의 0.9 ML로 미리 채워진 맨 윗줄 세 조직을 전송하기만하면됩니다. 삽입 아래에 갇혀있는 공기 방울을 릴리스합니다. </li><li> 60 인큐베이터에 삽입을 포함하는 6 자 번호판을 플레이스 ± 37 5 분 사전 부화 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH (상대 습도). </li><li> 60 ± 5 분 사전 잠복기의 끝에, 6 잘 판의 아래쪽 우물에 상단 우물에서 삽입을 전송. 인큐베이터에 다시 접시를 놓고 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH) 사전 부화 (18 ± 3 시간) 하루를 위해. </li><li> 냉장고 (5 ± 3 ° C).로 분석 매체의 나머지 플레이스 사전 부화 하룻밤에 따라 테스트 화학 물질은 EpiDerm 조직에 적용할 수 있습니다. 참고 : 사전에 부화 절차 (조직 화요일 대신에 수요일에 도착하는 경우 예) 늦은 조직 배달의 경우 단축하실 수 있습니다. </li></ol> II. 화학 노출 - 1 일 <ol><li> 전용 0.9 ML로 당 잘 분석 매체의 상단을 작성하여 테스트 화학 당 하나의 6 - 플레이트 잘 준비. </li><li> 약 5 분 화학 물질에 노출되기 전에 계획, 인큐베이터에서 미리 에어컨 조직을 포함하는 6 자 번호판을 제거합니다. </li><li> 조직의 표면을 평가하고 소독면 도움말을 사용하는 수분을 제거합니다. </li><li> 시험 재료 코드 또는 이름을 가진 모든 6 - 웰 플레이트 뚜껑을 라벨. </li><li> 선량 일분 간격으로 테스트 화학 물질과 조직이 노출 후 테스트 화학 물질 rinsing 촉진합니다. 마지막으로 조직이 약을 복용 때까지 멸균 후드에 복용 조직과 접시 보관하십시오. </li><li> 액체 화학 물질을 테스트하려면 직접 조직 위에 솔루션을 30 μL를 분배하여 조직 표면에 나일론 메쉬를 놓습니다. 필요한 경우, 부드럽게 유리 파스퇴르 피펫으로 향하고 전구를 사용하여 메쉬의 위치. 조직 표면에 누르지 마십시오. </li><li> 테스트 semisolids 경우, 직접 조직 위에 30 μL 하는걸 긍정적인 변위 피펫을 사용합니다. 필요한 확산 파스퇴르 피펫으로 화학 물질이 조직 표면에 최대한. 가리면 </li><li> 고체 재료, 곧 시험 물질의 응용 프로그램을하기 전에 멸균 DPBS 25 μL로 조직 표면을 축축하게하다. 이것은 테스트 화학 물질로 조직 표면의 접촉을 향상시킬 것입니다. 잘게 지상 시험 물질의 약 25 MG와 25 MG 보정 날카로운 응용 프로그램 숟가락을 (또는 다른 적절한 도구를) 입력합니다. 조직 표면에 고체 테스트 화학을 적용합니다. 필요한 경우, 완전히 숟가락을 비우 파스퇴르 피펫으로 향하고 전구를 사용합니다. 부드럽게 표면에 고체의 확산을 개선하기 위해 삽입을 흔들. </li><li> 밀랍 일관성과 시험 물질의 경우, 직경 8mm에 대한 조각 평면 &quot;같은 쿠키&quot;를 형성하고 이전 살균 DPBS로 침수 있던 조직, 위에 그것을 배치하십시오. 시험 물질과 조직 사이의 연락을 개선하기 위해서, 스테인리스 스틸 또는 플라스틱 구호로 &quot;쿠키&quot;를 누르다. </li><li> 부정적인 제어 및 관리 조직에 대한 긍정적인 제어로 5% SDS와 같은 DPBS을 적용합니다. </li><li> 마지막으로 조직을 먹이지 후, humidified 인큐베이터 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH). 35에 대한 모든 접시 ± 1 분 전송 </li><li> 35 후 37 ± 1 분 보육 ° C 배양기에서 모든 접시를 제거하십시오. 멸균 후드에 접시를 놓고 60 분 화학 노출의 기간이 가장 먼저 약을 복용 조직에 대한 완료될 때까지 기다립니다. </li><li> 후 (insur하는 분 시간 간격마다 하나 삽입을 사용하여 세척 절차를 시작모든 삽입에 대한 총 노출 시간이) 60 분입니다 전자. </li><li> 무균 DPBS과 조직을 씻어 수있는 세척​​ 병을 사용합니다. DPBS의 지속적인 흐름을 이용하여 15 배 삽입 조직을 입력하고 (참고 그것을 빈 :. 나일론 메쉬와 조직을 위해, 조직의 표면, 5 번 세척하고 지적, 날카로운 집게와 함께 신중하게 메쉬를 제거 후, ​​나머지를 계속 10 씻는다). </li><li> 15 150 ML의 DPBS 완전히 잠수함, 삽입 3 번 씻어 병을 사용하여 씻어 시험 자료의 나머지 부분을 제거 흔들 후. </li><li> 마지막으로, 내부로부터 한번 조직 삽입을 씻어 한번 살균 DPBS와 함께 밖에서. </li><li> 부드럽게 삽입을 흔들림과 멸균 압지에 모래 바닥하여 조직에서 DPBS의 초과를 제거합니다. </li><li> 이전에 분석 매체로 미리 채워진 새로운 6 - 잘 판에 blotted 조직 삽입을 전송합니다. 다음 단계의 모든 (14-18)는 각각의 삽입을위한 1 분 이내에 이루어져야합니다. </li><li> 마지막으로 조직 씻어서 후 멸균 면봉 각 조직의 표면을 조심스럽게 건조 면봉 스쳐. </li><li> 24 ± 2 시간 동안 인큐베이터에서 조직을 품어 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH). 참고 : 각 분석 기술자는 아래 설명된대로 프로토콜을 따라 수 있도록, 단일 테스트 실행 (세트)의 부정과 긍정적인 컨트롤을 포함하여 6 개 이상의 시험 물질을 시험하지 말아야 </li></ol> III. 중간 교류 - 주 2 <ol><li> 24 후 ± 이시간 이후 부화는 6 자 판, 미디어 0.9 ML로 미리 채워진 하단 부분에 삽입을 전송하기만하면됩니다. 상단 행에서 미디어는 추가 끝점 (크린 시토킨, chemokines 등)의 분석을 위해 수집하실 수 있습니다. 보조 종점의 분석은 선택 사항입니다. </li><li> 이후 부화를 계속 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH) 또 다른 18 ± 3 시간. </li></ol> IV. MTT의 생존 분석 - 3 일 <ol><li> 화학 이름이나 코드와 함께 레이블이 24 잘 접시. 하나의 플레이트는 MTT와 조직 배양을 위해 봉사하고 추출 단계에 대한 다른 것입니다. </li><li> MTT 집중 (5 MG / ML)를 해동 및 MTT의 희석제로 diluting하여 MTT 솔루션을 준비합니다. MTT 용액의 최종 농도는 1 MG / ML입니다. </li><li> 24 잘 판의 각 우물에 MTT 용액 피펫 300 μL. </li><li> 인큐베이터에서 6 자 번호판을 제거 압지에 삽입의 바닥 얼룩하고, MTT 사전 채워진 24 잘 판에 그들을 전송합니다. </li><li> 인큐베이터에서 24 잘 플레이트 플레이스 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH)와 3 시간 동안 품어 ± 5 분. 엄밀히 3 시간 준수 ± 다른 MTT의 수치 사이의 편차를 피하기 위해 5 분 배양 시간을. </li><li> MTT 보육이 완료되면 부드럽게 모든 우물에서 MTT 매체 대기음하는 흡입 펌프를 사용합니다. </li><li> 리필 DPBS와 우물과 다시 대기음. 이 rinsing 두 번 더 반복하고 조직은 지난 흡인 후 건조되었는지 확인합니다. </li><li> 세척은 새로운 24 잘 판에 삽입을 전송 후. 부드럽게 각 삽입이 ML의 extractant 솔루션 (이소프로판올)를 pipetting하여 삽입 젖어. 수준은 따라서 완전히 조직을 잠수함이 잠수, 삽입의 위쪽 가장자리 극복할 것입니다. </li><li> extractant 증발을 억제하기 위해 24 잘 플레이트 (Parafilm 또는 씰링 봉투를 사용하는 예) 인감. 접시 흔드는 (~ 120 RPM)에 부드러운 잡고 실온에서 최소 2 시간 동안 조직에서 MTT의 압축을 풉니다. 떨지 않고 숙박 추출도 사용할 수 있습니다. </li><li> 추출 기간이 완료되면, 피어스 주사 바늘이나 전구 파스퇴르 피펫을 페르시와 추출물이 삽입이 수행된하는 잘으로 실행할 수 있도록 함께 삽입합니다. </li><li> 구멍 삽입을 취소하고 동질 때까지 깨끗이 아래 세 번에서 솔루션을 피펫. </li><li> 각 조직의 경우, 96 - 웰 플랫 바텀 microtiter 접시에 보라색 formazan 솔루션의 두 200 μL aliquots를 전송. 이 비디오 프로토콜을 함께 스프레드 시트에 지정된 고정 플레이트 디자인에 따라 복사본을 전송합니다. 공백 들어, 이소프로판올를 사용합니다. </li><li> 참조 필터없이 570 NM (540-580)의 파장을 사용하여 96 - 웰 플레이트 분광 광도계에서 MTT 추출물의 광학 밀도 (OD)를 참조하십시오. </li><li> 결과 자동 계산 (그림 1)의 스프레드 시트에 결과를 입력합니다. </li><li> MTT 분석에 의해 결정 %의 조직 생존이 대조군에 비해 &lt;50 %면 시험 화학은 &#39;자극&#39;을 (R38 또는 GHS 분류 2) 표시됩니다. 참고 : MTT는 유독하므로 취급시 보호 장갑을 착용해야합니다. MTT와 정도 보호빛과, MTT 이후 lutions 구분 빛입니다. 그것이 시간이 지남에 따라 저하하기 때문에 준비 후 몇 시간 이내에 MTT 솔루션을 사용합니다. </li></ol> V. 분석 품질 컨트롤 <ul><li> EpiDerm 에피 - 200 - SIT 키트 접수 기준 : 체외 RHE 모델에서뿐 아니라 검증 프로세스 (8) 중에, 시간이 지남에 따라 일관성있는 고품질의 데이터를 제공해야합니다. 장기 분석 재현성과 성능을 보장하기 위해 권장 지침 &quot;은 성능을위한 각 많은 샘플링 세포 또는 조직의 전체 특성 ... 및 분석 성능의 일관성 보장을 제공하는 컨트롤 및 벤치마킹 화학 물질의 일반적인 사용&quot;(9) 포함 . 아래에 설명된 검정 합격 기준 이외에, EpiDerm 각 생산 많이 (1 % 트리톤 X - 100) 추가 벤치 마크에 대한 화학 물질 제조 업체에서 품질 테스트를 컨트롤입니다. 노출 시간은 트리톤 Triton X - 100이 결정되는 50 % (동부 표준시 - 50)에 조직 생존을 줄이기 위해 필요. EpiDerm 들어, 연간 평균 동부 표준시 - 50 값은 5.9 시간에서 7.5 시간으로 원거리있다. 부정적인 제어 조직에 대한 많은 정보 CV (베이스 라인 생존의 다양성 즉,)로 많은 1996 년부터 매년 7.5 % 이하 평균 있습니다. 위해 각 생산 많이 ET50 값은 1996 (;; 로우어 수용 한도 = 4.8h 상위 수용 한도 = 8.7h 즉, 동부 표준시 - 50 = 6.7 시간)의 설립 역사적인 평균 트리톤 X - 100 ET50의 2 표준 편차 이내에 가을에해야합니다 제조 업체에서 사용하기 위해 공개합니다. </li><li> 에피 - 200 - SIT 분석 접수 기준 1 : 대조군 : MTT - 시험에서 대조군 (NC) 조직 (멸균 DPBS 대우)의 절대 OD이 절차를 운송 및 저장 후 사용 특정 조건 하에서 테스트 실험실에서 얻은 조직 생존의 지표이다. NC 조직의 평균 OD 570이 ≥ 1.0 ≤ 2.5 경우 검정의 합격 기준을 준수합니다. </li><li> 에피 - 200 - SIT 어세이 접수 기준 2 : 긍정적인 제어 5 % SDS (H 2 O)을 솔루션은 긍정적인 제어 (PC)로 사용 테스트 화학 물질과 동시에 테스트합니다. PC 각 분석에서 테스트하기 위해 아니지만 하나 이상의 PC가 일 당 테스트가 필요합니다 있다고 동시 의미합니다. 긍정적인 통제의 생존은 역사적 데이터의 95 % 신뢰 구간 내에 있어야합니다. 부정적인 통제 조직의 %가 20 %로 PC의 조직의 평균 생존이 표현하는 경우 분석은 수용 기준을 만족합니다. </li><li> 에피 - 200 - SIT 분석 접수 기준 3 표준 편차 (SD) 피부 irritancy 3 단일 조직 결정 평균 생존의 예측 따라서 조직의 다양성은 acceptably 낮은되어야 복제됩니다. 동일 취급 3의 개별 %의 조직 viabilities에서 계산 SD가 &lt;18 %예요 복제하는 경우 분석은 수용 기준을 만족합니다. </li></ul> 대표 결과 <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="그림 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="그림 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="그림 3" /> </div> 그림 1 6 시험 기사, NC 및 PC ​​컨트롤에 대한 얻은 결과 -. 결과의 계산을위한 자동 스프레드 시트의 일부. NC에 참조 50% 아래 조직 생존을 감소 테스트 화학은 irritants으로 분류됩니다. 테스트는 충분히 멀리 따라서 분석의 견고를 증가 분류 컷 - 오프 (50 % 생존)에서 아르 결과를 제공하기 위해 최적화되어 있습니다. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> 자료 </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="자료 목록" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

이 비디오에서는, 우리는 EpiDerm의 피부 자극 시험 (EpiDerm SIT) 개발 및 미용 및 제약 원료를 포함한 화학 물질의 체외의 피부 자극 시험에 대한 확인을 증명하고있다. 이 방법을 수행할 때, 그것은 프로토콜의 편차가 다른 결과를 일으킬 수 있기 때문에, 무균 조건에서 작동하고 엄격하게 검증 프로토콜을 수행하는 것이 중요합니다. 검정의 일부 수정이 가능하지만, 프로토콜 변경 사항은 저자와 직접 논의해야합니다. 이 방법의 유일한 한계는 MTT의 종점과 시험 물질의 가능한 간섭이다. 직접 MTT을 감소 색의 시험 물질 혹은 (그리고 따라서 세포 mitochondria 탈수소 효소의 활동을 모방)은 MTT 끝점를 방해할 수 있습니다. 그러나 이러한 시험 물질이 계속 (또는)에 조직을 제시하는 경우에만 MTT 검사 (예 : 42시간 시험 물질에 노출된 후) 시험 물질의 충분한 양을 시점에있다면 문제가 있습니다. 이 가능성 이벤트 (True)로 신진 대사 MTT 감소 및 기여 색깔 시험 자료 또는 제공한 분석 표준 작업 절차에 자세히 설명되어있는 절차에 의해 계량 수있는 시험 자료에 의해 (FALSE) 직접 MTT 감소의 경우 MatTek 주식 회사

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

EpiDerm의 피부 자극 시험 (EpiDerm SIT)이 개발되었습니다<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; 및 확인<sup&gt; (4,5)</sup&gt;에 대한<em&gt; 체외에서</em화장품 및 제약 원료를 포함한 화학 물질&gt; 피부 자극 테스트. EpiDerm에 앉아는 3D를 활용<em&gt; 체외에서</em&gt; 재건축 인간 표피 (RHE) 모델 EpiDerm. 이 프로토콜에서 설명하는 절차는 GHS 분류의 irritants 2 비 irritants 사이의 차별을 허용<sup&gt; (6)</sup&gt;. 시험은 사전 부화, 60 분 노출, 42 시간 후 부화 및 MTT의 생존 분석 구성된, 4 일 기간 동안 수행됩니다. 조직 영수증과 하룻밤 사전 부화 (주 0) 후, 조직은 몸에 붙이기도 액체, 반 고체, 고체 또는 왁스 수있는 테스트 화학 물질 (1 일)에 노출되어 있습니다. 세 조직은 각각의 시험 화학뿐만 아니라 긍정적인 컨트롤 (5 % AQ. SDS 솔루션), 그리고 대조군 (DPBS)에 사용됩니다. 화학 노출은 조직이 37 인큐베이터에 보관 35 분 중 60 분 ° C. 지속 시험 물질은 다음 광범위한 세척 절차에 의해 조직 표면에서 제거됩니다. 조직의 삽입은 blotted 신선한 매체로 전송됩니다. 24 시간의 잠복기 (2 일) 후, 매체 교환됩니다. 매체 크린 시토킨 또는 관심사의 다른 끝점의 자세한 분석을 위해 저장할 수 있습니다. 매체 교환 후, 조직은 추가 18 시간 동안 incubated 수 있습니다. 포스트 부화 (3 일) 전체 42h의 끝에서, 조직은 노란색 MTT 용액으로 전송하고 3 시간 동안 incubated. mitochondrial 신진 대사에 의해 주로 형성 결과 보라색 - 블루 formazan 소금은, 이소프로판올를 사용하여 2 시간 동안 추출됩니다. 압축을 푼 formazan의 광학 밀도는 분광 광도계를 사용하여 결정됩니다. 화학 물질은 대조군 처리 조직에 상대적인 조직 생존가 50 % 이하로 감소하는 경우 자극으로 분류됩니다. 이 절차는 EU 규정에 맞게 화학 물질의 위험 식별 및 라벨에 대한 생체내 래빗 피부 자극 시험에 가득 교체로 사용될 수<sup&gt; (7)</sup&gt;.

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An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

이 비디오에서는, 우리는 EpiDerm의 피부 자극 시험 (EpiDerm SIT) 개발에 대한 검증을 보여주<em&gt; 체외에서</em화장품 및 제약 원료를 포함한 화학 물질&gt; 피부 자극 테스트.

체외에서</emEpiDerm를 사용하여> 피부 자극 시험 (SIT)는 인간 표피 (RHE) 모델 재구성

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

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Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

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비디오: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

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연구

생물학

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EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

마우스 표피 신경 크레스트 줄기 세포 (에피 NCSC) 문화

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An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

마우스 표피 각질 세포와 체외 클로노겐 문화의 격리

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

체외에서 피부 자극 시험 (SIT)는 인간 표피 (RHE) 모델 재구성