Name: an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model
Uploaded: 2009-07-13T21:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model at JoVE.com

저자는 수정 EpiDerm SIT (5 멀티 센터 국제 검증 연구에 참여하기 위해 BfR (독일), BASF SE (독일), IIVS 주식 회사 (미국), Zet - LSL (오스트리아)에서 ZEBET에 감사드립니다 ).

I. 조직 헤어드라 이어 - 주 영 <ol><li> EpiDerm 에피 - 200 - SIT 키트 수령시, 무결성에 대한 모든 키트 구성 요소 (키트 자세한 내용은 특정 시약 및 장비의 표 참조) 확인하십시오. </li><li> 모든 세 EpiDerm 조직 들어, 하나의 무균 6 웰 플레이트 분석 매체의 0.9 ML로 미리 채워진을 준비합니다. </li><li> 무균 조건에서 EpiDerm 조직을 포함하는 24 잘 플레이트가 들어있는 비닐 봉투를 열고 멸균 거즈를 제거합니다. </li><li> EpiDerm 조직을 포함하는 각각의 삽입을 제거하고 빈 24 잘 플레이트에 삽입을 배치 살균 집게를 사용하십시오. 이 단계 동안, 살균 필터 종이에 모래 바닥 부드러운하여 삽입의 바깥 양쪽에 부합하는 나머지 운송 아가로 오스를 제거합니다. </li><li> 다음 5 분 이내, 시각적으로 조직을 검사. 완전히 액체로 덮여 결함이 조직이나 조직을 사용하지 마십시오. </li><li> 멸균 면봉 팁 면봉을 사용하여 조심스럽게 조직의 표면을 건조. 직접 조직을 만지지 마 - 모세관 효과는 조직 표면에서 수분을 제거하기에 충분합니다. </li><li> 조직 표면을 건조 후 6 웰 플레이트 분석 매체의 0.9 ML로 미리 채워진 맨 윗줄 세 조직을 전송하기만하면됩니다. 삽입 아래에 갇혀있는 공기 방울을 릴리스합니다. </li><li> 60 인큐베이터에 삽입을 포함하는 6 자 번호판을 플레이스 ± 37 5 분 사전 부화 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH (상대 습도). </li><li> 60 ± 5 분 사전 잠복기의 끝에, 6 잘 판의 아래쪽 우물에 상단 우물에서 삽입을 전송. 인큐베이터에 다시 접시를 놓고 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH) 사전 부화 (18 ± 3 시간) 하루를 위해. </li><li> 냉장고 (5 ± 3 ° C).로 분석 매체의 나머지 플레이스 사전 부화 하룻밤에 따라 테스트 화학 물질은 EpiDerm 조직에 적용할 수 있습니다. 참고 : 사전에 부화 절차 (조직 화요일 대신에 수요일에 도착하는 경우 예) 늦은 조직 배달의 경우 단축하실 수 있습니다. </li></ol> II. 화학 노출 - 1 일 <ol><li> 전용 0.9 ML로 당 잘 분석 매체의 상단을 작성하여 테스트 화학 당 하나의 6 - 플레이트 잘 준비. </li><li> 약 5 분 화학 물질에 노출되기 전에 계획, 인큐베이터에서 미리 에어컨 조직을 포함하는 6 자 번호판을 제거합니다. </li><li> 조직의 표면을 평가하고 소독면 도움말을 사용하는 수분을 제거합니다. </li><li> 시험 재료 코드 또는 이름을 가진 모든 6 - 웰 플레이트 뚜껑을 라벨. </li><li> 선량 일분 간격으로 테스트 화학 물질과 조직이 노출 후 테스트 화학 물질 rinsing 촉진합니다. 마지막으로 조직이 약을 복용 때까지 멸균 후드에 복용 조직과 접시 보관하십시오. </li><li> 액체 화학 물질을 테스트하려면 직접 조직 위에 솔루션을 30 μL를 분배하여 조직 표면에 나일론 메쉬를 놓습니다. 필요한 경우, 부드럽게 유리 파스퇴르 피펫으로 향하고 전구를 사용하여 메쉬의 위치. 조직 표면에 누르지 마십시오. </li><li> 테스트 semisolids 경우, 직접 조직 위에 30 μL 하는걸 긍정적인 변위 피펫을 사용합니다. 필요한 확산 파스퇴르 피펫으로 화학 물질이 조직 표면에 최대한. 가리면 </li><li> 고체 재료, 곧 시험 물질의 응용 프로그램을하기 전에 멸균 DPBS 25 μL로 조직 표면을 축축하게하다. 이것은 테스트 화학 물질로 조직 표면의 접촉을 향상시킬 것입니다. 잘게 지상 시험 물질의 약 25 MG와 25 MG 보정 날카로운 응용 프로그램 숟가락을 (또는 다른 적절한 도구를) 입력합니다. 조직 표면에 고체 테스트 화학을 적용합니다. 필요한 경우, 완전히 숟가락을 비우 파스퇴르 피펫으로 향하고 전구를 사용합니다. 부드럽게 표면에 고체의 확산을 개선하기 위해 삽입을 흔들. </li><li> 밀랍 일관성과 시험 물질의 경우, 직경 8mm에 대한 조각 평면 &quot;같은 쿠키&quot;를 형성하고 이전 살균 DPBS로 침수 있던 조직, 위에 그것을 배치하십시오. 시험 물질과 조직 사이의 연락을 개선하기 위해서, 스테인리스 스틸 또는 플라스틱 구호로 &quot;쿠키&quot;를 누르다. </li><li> 부정적인 제어 및 관리 조직에 대한 긍정적인 제어로 5% SDS와 같은 DPBS을 적용합니다. </li><li> 마지막으로 조직을 먹이지 후, humidified 인큐베이터 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH). 35에 대한 모든 접시 ± 1 분 전송 </li><li> 35 후 37 ± 1 분 보육 ° C 배양기에서 모든 접시를 제거하십시오. 멸균 후드에 접시를 놓고 60 분 화학 노출의 기간이 가장 먼저 약을 복용 조직에 대한 완료될 때까지 기다립니다. </li><li> 후 (insur하는 분 시간 간격마다 하나 삽입을 사용하여 세척 절차를 시작모든 삽입에 대한 총 노출 시간이) 60 분입니다 전자. </li><li> 무균 DPBS과 조직을 씻어 수있는 세척​​ 병을 사용합니다. DPBS의 지속적인 흐름을 이용하여 15 배 삽입 조직을 입력하고 (참고 그것을 빈 :. 나일론 메쉬와 조직을 위해, 조직의 표면, 5 번 세척하고 지적, 날카로운 집게와 함께 신중하게 메쉬를 제거 후, ​​나머지를 계속 10 씻는다). </li><li> 15 150 ML의 DPBS 완전히 잠수함, 삽입 3 번 씻어 병을 사용하여 씻어 시험 자료의 나머지 부분을 제거 흔들 후. </li><li> 마지막으로, 내부로부터 한번 조직 삽입을 씻어 한번 살균 DPBS와 함께 밖에서. </li><li> 부드럽게 삽입을 흔들림과 멸균 압지에 모래 바닥하여 조직에서 DPBS의 초과를 제거합니다. </li><li> 이전에 분석 매체로 미리 채워진 새로운 6 - 잘 판에 blotted 조직 삽입을 전송합니다. 다음 단계의 모든 (14-18)는 각각의 삽입을위한 1 분 이내에 이루어져야합니다. </li><li> 마지막으로 조직 씻어서 후 멸균 면봉 각 조직의 표면을 조심스럽게 건조 면봉 스쳐. </li><li> 24 ± 2 시간 동안 인큐베이터에서 조직을 품어 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH). 참고 : 각 분석 기술자는 아래 설명된대로 프로토콜을 따라 수 있도록, 단일 테스트 실행 (세트)의 부정과 긍정적인 컨트롤을 포함하여 6 개 이상의 시험 물질을 시험하지 말아야 </li></ol> III. 중간 교류 - 주 2 <ol><li> 24 후 ± 이시간 이후 부화는 6 자 판, 미디어 0.9 ML로 미리 채워진 하단 부분에 삽입을 전송하기만하면됩니다. 상단 행에서 미디어는 추가 끝점 (크린 시토킨, chemokines 등)의 분석을 위해 수집하실 수 있습니다. 보조 종점의 분석은 선택 사항입니다. </li><li> 이후 부화를 계속 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH) 또 다른 18 ± 3 시간. </li></ol> IV. MTT의 생존 분석 - 3 일 <ol><li> 화학 이름이나 코드와 함께 레이블이 24 잘 접시. 하나의 플레이트는 MTT와 조직 배양을 위해 봉사하고 추출 단계에 대한 다른 것입니다. </li><li> MTT 집중 (5 MG / ML)를 해동 및 MTT의 희석제로 diluting하여 MTT 솔루션을 준비합니다. MTT 용액의 최종 농도는 1 MG / ML입니다. </li><li> 24 잘 판의 각 우물에 MTT 용액 피펫 300 μL. </li><li> 인큐베이터에서 6 자 번호판을 제거 압지에 삽입의 바닥 얼룩하고, MTT 사전 채워진 24 잘 판에 그들을 전송합니다. </li><li> 인큐베이터에서 24 잘 플레이트 플레이스 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 95 % RH)와 3 시간 동안 품어 ± 5 분. 엄밀히 3 시간 준수 ± 다른 MTT의 수치 사이의 편차를 피하기 위해 5 분 배양 시간을. </li><li> MTT 보육이 완료되면 부드럽게 모든 우물에서 MTT 매체 대기음하는 흡입 펌프를 사용합니다. </li><li> 리필 DPBS와 우물과 다시 대기음. 이 rinsing 두 번 더 반복하고 조직은 지난 흡인 후 건조되었는지 확인합니다. </li><li> 세척은 새로운 24 잘 판에 삽입을 전송 후. 부드럽게 각 삽입이 ML의 extractant 솔루션 (이소프로판올)를 pipetting하여 삽입 젖어. 수준은 따라서 완전히 조직을 잠수함이 잠수, 삽입의 위쪽 가장자리 극복할 것입니다. </li><li> extractant 증발을 억제하기 위해 24 잘 플레이트 (Parafilm 또는 씰링 봉투를 사용하는 예) 인감. 접시 흔드는 (~ 120 RPM)에 부드러운 잡고 실온에서 최소 2 시간 동안 조직에서 MTT의 압축을 풉니다. 떨지 않고 숙박 추출도 사용할 수 있습니다. </li><li> 추출 기간이 완료되면, 피어스 주사 바늘이나 전구 파스퇴르 피펫을 페르시와 추출물이 삽입이 수행된하는 잘으로 실행할 수 있도록 함께 삽입합니다. </li><li> 구멍 삽입을 취소하고 동질 때까지 깨끗이 아래 세 번에서 솔루션을 피펫. </li><li> 각 조직의 경우, 96 - 웰 플랫 바텀 microtiter 접시에 보라색 formazan 솔루션의 두 200 μL aliquots를 전송. 이 비디오 프로토콜을 함께 스프레드 시트에 지정된 고정 플레이트 디자인에 따라 복사본을 전송합니다. 공백 들어, 이소프로판올를 사용합니다. </li><li> 참조 필터없이 570 NM (540-580)의 파장을 사용하여 96 - 웰 플레이트 분광 광도계에서 MTT 추출물의 광학 밀도 (OD)를 참조하십시오. </li><li> 결과 자동 계산 (그림 1)의 스프레드 시트에 결과를 입력합니다. </li><li> MTT 분석에 의해 결정 %의 조직 생존이 대조군에 비해 &lt;50 %면 시험 화학은 &#39;자극&#39;을 (R38 또는 GHS 분류 2) 표시됩니다. 참고 : MTT는 유독하므로 취급시 보호 장갑을 착용해야합니다. MTT와 정도 보호빛과, MTT 이후 lutions 구분 빛입니다. 그것이 시간이 지남에 따라 저하하기 때문에 준비 후 몇 시간 이내에 MTT 솔루션을 사용합니다. </li></ol> V. 분석 품질 컨트롤 <ul><li> EpiDerm 에피 - 200 - SIT 키트 접수 기준 : 체외 RHE 모델에서뿐 아니라 검증 프로세스 (8) 중에, 시간이 지남에 따라 일관성있는 고품질의 데이터를 제공해야합니다. 장기 분석 재현성과 성능을 보장하기 위해 권장 지침 &quot;은 성능을위한 각 많은 샘플링 세포 또는 조직의 전체 특성 ... 및 분석 성능의 일관성 보장을 제공하는 컨트롤 및 벤치마킹 화학 물질의 일반적인 사용&quot;(9) 포함 . 아래에 설명된 검정 합격 기준 이외에, EpiDerm 각 생산 많이 (1 % 트리톤 X - 100) 추가 벤치 마크에 대한 화학 물질 제조 업체에서 품질 테스트를 컨트롤입니다. 노출 시간은 트리톤 Triton X - 100이 결정되는 50 % (동부 표준시 - 50)에 조직 생존을 줄이기 위해 필요. EpiDerm 들어, 연간 평균 동부 표준시 - 50 값은 5.9 시간에서 7.5 시간으로 원거리있다. 부정적인 제어 조직에 대한 많은 정보 CV (베이스 라인 생존의 다양성 즉,)로 많은 1996 년부터 매년 7.5 % 이하 평균 있습니다. 위해 각 생산 많이 ET50 값은 1996 (;; 로우어 수용 한도 = 4.8h 상위 수용 한도 = 8.7h 즉, 동부 표준시 - 50 = 6.7 시간)의 설립 역사적인 평균 트리톤 X - 100 ET50의 2 표준 편차 이내에 가을에해야합니다 제조 업체에서 사용하기 위해 공개합니다. </li><li> 에피 - 200 - SIT 분석 접수 기준 1 : 대조군 : MTT - 시험에서 대조군 (NC) 조직 (멸균 DPBS 대우)의 절대 OD이 절차를 운송 및 저장 후 사용 특정 조건 하에서 테스트 실험실에서 얻은 조직 생존의 지표이다. NC 조직의 평균 OD 570이 ≥ 1.0 ≤ 2.5 경우 검정의 합격 기준을 준수합니다. </li><li> 에피 - 200 - SIT 어세이 접수 기준 2 : 긍정적인 제어 5 % SDS (H 2 O)을 솔루션은 긍정적인 제어 (PC)로 사용 테스트 화학 물질과 동시에 테스트합니다. PC 각 분석에서 테스트하기 위해 아니지만 하나 이상의 PC가 일 당 테스트가 필요합니다 있다고 동시 의미합니다. 긍정적인 통제의 생존은 역사적 데이터의 95 % 신뢰 구간 내에 있어야합니다. 부정적인 통제 조직의 %가 20 %로 PC의 조직의 평균 생존이 표현하는 경우 분석은 수용 기준을 만족합니다. </li><li> 에피 - 200 - SIT 분석 접수 기준 3 표준 편차 (SD) 피부 irritancy 3 단일 조직 결정 평균 생존의 예측 따라서 조직의 다양성은 acceptably 낮은되어야 복제됩니다. 동일 취급 3의 개별 %의 조직 viabilities에서 계산 SD가 &lt;18 %예요 복제하는 경우 분석은 수용 기준을 만족합니다. </li></ul> 대표 결과 <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="그림 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="그림 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="그림 3" /> </div> 그림 1 6 시험 기사, NC 및 PC ​​컨트롤에 대한 얻은 결과 -. 결과의 계산을위한 자동 스프레드 시트의 일부. NC에 참조 50% 아래 조직 생존을 감소 테스트 화학은 irritants으로 분류됩니다. 테스트는 충분히 멀리 따라서 분석의 견고를 증가 분류 컷 - 오프 (50 % 생존)에서 아르 결과를 제공하기 위해 최적화되어 있습니다. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> 자료 </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="자료 목록" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

이 비디오에서는, 우리는 EpiDerm의 피부 자극 시험 (EpiDerm SIT) 개발 및 미용 및 제약 원료를 포함한 화학 물질의 체외의 피부 자극 시험에 대한 확인을 증명하고있다. 이 방법을 수행할 때, 그것은 프로토콜의 편차가 다른 결과를 일으킬 수 있기 때문에, 무균 조건에서 작동하고 엄격하게 검증 프로토콜을 수행하는 것이 중요합니다. 검정의 일부 수정이 가능하지만, 프로토콜 변경 사항은 저자와 직접 논의해야합니다. 이 방법의 유일한 한계는 MTT의 종점과 시험 물질의 가능한 간섭이다. 직접 MTT을 감소 색의 시험 물질 혹은 (그리고 따라서 세포 mitochondria 탈수소 효소의 활동을 모방)은 MTT 끝점를 방해할 수 있습니다. 그러나 이러한 시험 물질이 계속 (또는)에 조직을 제시하는 경우에만 MTT 검사 (예 : 42시간 시험 물질에 노출된 후) 시험 물질의 충분한 양을 시점에있다면 문제가 있습니다. 이 가능성 이벤트 (True)로 신진 대사 MTT 감소 및 기여 색깔 시험 자료 또는 제공한 분석 표준 작업 절차에 자세히 설명되어있는 절차에 의해 계량 수있는 시험 자료에 의해 (FALSE) 직접 MTT 감소의 경우 MatTek 주식 회사

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

EpiDerm의 피부 자극 시험 (EpiDerm SIT)이 개발되었습니다<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; 및 확인<sup&gt; (4,5)</sup&gt;에 대한<em&gt; 체외에서</em화장품 및 제약 원료를 포함한 화학 물질&gt; 피부 자극 테스트. EpiDerm에 앉아는 3D를 활용<em&gt; 체외에서</em&gt; 재건축 인간 표피 (RHE) 모델 EpiDerm. 이 프로토콜에서 설명하는 절차는 GHS 분류의 irritants 2 비 irritants 사이의 차별을 허용<sup&gt; (6)</sup&gt;. 시험은 사전 부화, 60 분 노출, 42 시간 후 부화 및 MTT의 생존 분석 구성된, 4 일 기간 동안 수행됩니다. 조직 영수증과 하룻밤 사전 부화 (주 0) 후, 조직은 몸에 붙이기도 액체, 반 고체, 고체 또는 왁스 수있는 테스트 화학 물질 (1 일)에 노출되어 있습니다. 세 조직은 각각의 시험 화학뿐만 아니라 긍정적인 컨트롤 (5 % AQ. SDS 솔루션), 그리고 대조군 (DPBS)에 사용됩니다. 화학 노출은 조직이 37 인큐베이터에 보관 35 분 중 60 분 ° C. 지속 시험 물질은 다음 광범위한 세척 절차에 의해 조직 표면에서 제거됩니다. 조직의 삽입은 blotted 신선한 매체로 전송됩니다. 24 시간의 잠복기 (2 일) 후, 매체 교환됩니다. 매체 크린 시토킨 또는 관심사의 다른 끝점의 자세한 분석을 위해 저장할 수 있습니다. 매체 교환 후, 조직은 추가 18 시간 동안 incubated 수 있습니다. 포스트 부화 (3 일) 전체 42h의 끝에서, 조직은 노란색 MTT 용액으로 전송하고 3 시간 동안 incubated. mitochondrial 신진 대사에 의해 주로 형성 결과 보라색 - 블루 formazan 소금은, 이소프로판올를 사용하여 2 시간 동안 추출됩니다. 압축을 푼 formazan의 광학 밀도는 분광 광도계를 사용하여 결정됩니다. 화학 물질은 대조군 처리 조직에 상대적인 조직 생존가 50 % 이하로 감소하는 경우 자극으로 분류됩니다. 이 절차는 EU 규정에 맞게 화학 물질의 위험 식별 및 라벨에 대한 생체내 래빗 피부 자극 시험에 가득 교체로 사용될 수<sup&gt; (7)</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model at JoVE.com

An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

이 비디오에서는, 우리는 EpiDerm의 피부 자극 시험 (EpiDerm SIT) 개발에 대한 검증을 보여주<em&gt; 체외에서</em화장품 및 제약 원료를 포함한 화학 물질&gt; 피부 자극 테스트.

체외에서</emEpiDerm를 사용하여> 피부 자극 시험 (SIT)는 인간 표피 (RHE) 모델 재구성

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

67.6K 조회수.  MatTek Corporation.  日本語 

비디오: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

3 차원의 인간 피부 모델을 재구성 : 도구는 일반 피부와 흑색증의 진행을 공부하기

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

연구

생체공학

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

인간 Ex 생체 내 상처 모델 및 피부 수리를 정확하게 평가하기 위한 전산 염색 접근법

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

발생학

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

<meta charset="utf8"></head><body>유연한 연구 응용을 위한 효율적인 3D 피부 모델

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 비용 효율적인 3D 세포 모델을 통한 피부 모델 다양성 향상

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

체외에서 피부 자극 시험 (SIT)는 인간 표피 (RHE) 모델 재구성

필기록

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

3 차원의 인간 피부 모델을 재구성 : 도구는 일반 피부와 흑색증의 진행을 공부하기

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

개선 2D 및 3D 스킨

인간 Ex 생체 내 상처 모델 및 피부 수리를 정확하게 평가하기 위한 전산 염색 접근법

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축