Die Autoren danken an der BfR (Deutschland), BASF SE (Deutschland), IIVS Inc. (USA), zet-LSL (Österreich) ZEBET für die Teilnahme an Multi-center internationalen Validierungsstudie der Modified EpiDerm SIT (5 ).

I. Tissue Klimaanlage - Tag 0 <ol><li> Nach Erhalt der EpiDerm EPI-200-SIT-Kit, überprüfen Sie alle Komponenten des Kits für Integrität (für Kit Details siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte). </li><li> Für alle drei EpiDerm Gewebe, bereiten ein steriles 6-well-Platte mit 0,9 ml Assay-Medium vorgefüllt. </li><li> Unter sterilen Bedingungen, öffnen Sie den Plastikbeutel mit dem 24-Well-Platte mit den EpiDerm Gewebe und entfernen Sie die sterile Gaze. </li><li> Verwenden einer sterilen Pinzette zu jeder Einsatz mit den EpiDerm Gewebe zu entfernen und den Einsatz in den leeren 24-Well-Platte. In diesem Schritt entfernen Sie alle verbleibenden Versand Agarose, dass an den Außenseiten des Einsatzes haftet durch sanfte Blotting auf sterilem Filterpapier. </li><li> Innerhalb der nächsten 5 Minuten, visuell den Geweben. Verwenden Sie keine defekten Gewebe oder Gewebe, die vollständig mit Flüssigkeit bedeckt sind. </li><li> Mit einem sterilen Wattestäbchen Wattestäbchen sorgfältig trocknen die Oberfläche des Gewebes. Versuchen Sie nicht, das Gewebe direkt berühren - Kapillare Effekte sind ausreichend, um die Feuchtigkeit aus dem Gewebe Oberfläche zu entfernen. </li><li> Nach dem Trocknen der Gewebeoberfläche, Transfer drei Gewebe der oberen Reihe der 6-well-Platten mit 0,9 ml Assay-Medium vorgefüllt. Veröffentlichung Luftblasen unter der Einsätze gefangen. </li><li> Legen Sie die 6-well-Platten, die die Einsätze in den Inkubator für 60 ± 5 min Vorinkubation bei 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH (relative Luftfeuchtigkeit). </li><li> Am Ende der 60 ± 5 min Vorinkubation Zeitraum speichern, übertragen die Einsätze aus dem oberen Brunnen in den unteren Vertiefungen der 6-Well-Platte. Legen Sie die Platten wieder in den Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) für eine Übernachtung Vorinkubation (18 ± 3 h). </li><li> Platzieren Sie den Rest der Assay-Medium in den Kühlschrank (5 ± 3 ° C). Nach der Übernachtung Vorinkubation, kann der Test Chemikalien für die EpiDerm Gewebe aufgetragen werden. Hinweis: Die Vorinkubation Verfahren kann im Falle einer verspäteten Lieferung Gewebe verkürzt werden (zB wenn Gewebe am Mittwoch anreisen, statt Dienstag). </li></ol> II. Chemische Beanspruchung - Tag 1 <ol><li> Bereiten Sie ein 6-Well-Platte je Testchemikalie, indem die obere Reihe nur mit 0,9 ml pro Vertiefung der Assay-Medium. </li><li> Etwa 5 Minuten vor der geplanten Exposition gegenüber chemischen Stoffen, entfernen Sie die 6-well Platten mit den vorkonditioniert Gewebe aus dem Inkubator. </li><li> Beurteilen Sie die Oberfläche von Geweben und entfernen Sie alle Feuchtigkeit mit sterilem Baumwolle Tipps. </li><li> Kennzeichnen Sie alle 6-Well-Platte Deckel mit dem Testmaterial Codes oder Namen. </li><li> Dosieren Sie das Gewebe mit dem Test-Chemikalien in Intervallen von 1 Minute zu erleichtern Spülen der Testsubstanzen nach der Exposition. Halten Sie die Platten mit dosierten Gewebe in die sterile Haube, bis der letzte Gewebe dosiert wird. </li><li> Um zu testen, flüssige Chemikalien, verzichten 30 ul der Lösung direkt oben auf das Gewebe und setzen Sie die Nylon-Mesh-Gewebe auf der Oberfläche. Wenn nötig, vorsichtig Position des Netzes mit der Glühbirne geleitet Glas Pasteur Pipette. Drücken Sie nicht auf der Gewebeoberfläche. </li><li> Für die Prüfung semisolids, verwenden Sie eine positive Verschiebung Pipette auf 30 ul direkt oben auf das Gewebe zu verzichten. Bei Bedarf verteilt die Chemikalie mit Pasteurpipette zur Deckung der Gewebeoberfläche so viel wie möglich. </li><li> Für feste Materialien, kurz vor der Applikation der Testsubstanz, befeuchten Sie die Gewebeoberfläche mit 25 &amp;mgr; l sterilem DPBS. Dies verbessert die Berührung der Gewebeoberfläche mit der Testchemikalie. Füllen Sie eine 25 mg kalibriert scharfe Anwendung Löffel (oder einem anderen geeigneten Werkzeug) mit ca. 25 mg fein gemahlenes Probenmaterial. Übernehmen Sie die feste Testchemikalie auf der Gewebeoberfläche. Falls erforderlich, eine Glühbirne geleitet Pasteur Pipette, um den Löffel komplett leer. Schütteln Sie die Einsätze, um die Ausbreitung der Feststoff auf der Oberfläche zu verbessern. </li><li> Für Testsubstanzen mit wachsartiger Konsistenz, versuchen Sie, eine flache &quot;Cookie wie&quot; Stück ca. 8 mm Durchmesser in Form und legen Sie es oben auf das Gewebe, die zuvor mit sterilem DPBS benetzt. Zur Verbesserung des Kontaktes zwischen Prüfsubstanz und Gewebe, wiegen Sie die &quot;Cookie&quot; mit einer Edelstahl oder Kunststoff zu helfen. </li><li> Bewerben DPBS als negative Kontrolle und 5% SDS als positive Kontrolle, die Kontrolle Gewebe. </li><li> Nach der Dosierung der letzten Gewebe, übertragen alle Platten für 35 ± 1 Minuten, um die befeuchteten Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH). </li><li> Nach dem 35 ± 1 Minuten Inkubation bei 37 ° C entfernen Sie alle Platten aus dem Inkubator. Legen Sie die Platten in die sterile Haube und warten, bis ein Zeitraum von 60 Minuten Exposition gegenüber chemischen Stoffen zum ersten dosiert Gewebe abgeschlossen ist. </li><li> Anschließend starten Sie den Waschvorgang mit der ein Einsatz pro Minute Zeitintervall (zum Versichee, dass die gesamte Belichtungszeit für jeden Einsatz 60 Minuten). </li><li> Verwenden Sie eine Waschflasche, um das Gewebe mit einer sterilen DPBS spülen. Füllen Sie das Gewebe einfügen 15 Mal mit einem konstanten Strom von DPBS und leeren Sie ihn. (Hinweis: für Gewebe mit einer Nylon-Mesh, waschen Sie die Gewebeoberfläche 5 Mal und entfernen Sie das Netz vorsichtig mit der spitzen, scharfen Zangen Danach die restlichen weiter 10 Wäschen). </li><li> Nach dem 15. Spülen mit der Waschflasche, komplett versenken den Einsatz 3-mal in 150 ml DPBS und schütteln, um den Rest des Tests Material zu entfernen. </li><li> Schließlich spülen die Gewebe einfügen einmal von innen und einmal von außen mit einer sterilen DPBS. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges von DPBS aus dem Gewebe durch leichtes Schütteln des Einsatzes und Blotting auf die sterile Löschpapier. </li><li> Übertragen Sie die ausgelöscht Gewebe fügt dem neuen 6-Well-Platte zuvor mit Assay-Medium vorgefüllt. Alle diese Schritte (14-18) muss innerhalb von 1 min für jeden Einsatz durchgeführt werden. </li><li> Nach dem letzten Gewebe gespült, sorgfältig trocknen die Oberfläche jedes Gewebe mit einem sterilen Wattestäbchen Wattestäbchen. </li><li> Inkubieren des Gewebes in den Inkubator für die nächsten 24 ± 2 Stunden (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH). Hinweis: Jeder Test Techniker sollte nicht testen mehr als 6 Testsubstanzen einschließlich der negativen und positiven Kontrollen in einem einzigen Testlauf (set), in der Lage sein zu folgen das Protokoll, wie unten beschrieben </li></ol> III. Medium Austausch - Tag 2 <ol><li> Nach dem 24 ± 2 Stunden nach der Inkubation, übertragen Sie die Einsätze in den unteren Teil der 6-Well-Platte mit 0,9 ml Medium vorgefüllt. Medien aus dem oberen Zeilen können für die Analyse der zusätzlichen Endpunkten (Zytokine, Chemokine etc.) gesammelt werden. Die Analyse der sekundären Endpunkte ist optional. </li><li> Fahren Sie mit dem Post-Inkubation (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) für weitere 18 ± 3 Stunden. </li></ol> IV. MTT Viability Assay - Tag 3 <ol><li> Label zwei 24-Well-Platten mit dem chemischen Namen oder Codes. Eine Platte wird für die Gewebe-Inkubation mit MTT dienen und die andere für die Extraktion. </li><li> Bereiten Sie die MTT-Lösung durch Auftauen des MTT-Konzentrat (5 mg / ml) und Verdünnung mit dem MTT Verdünnungsmittel. Endkonzentration von MTT-Lösung ist 1 mg / ml. </li><li> Pipette 300 ul MTT-Lösung in jedes Well der 24 Well-Platte. </li><li> Entfernen Sie die 6-well Platten aus Inkubator, trocknen Sie die Unterseite der Einlagen auf einem Löschpapier, und übertragen sie in die 24-Well-Platte vorgefüllt mit MTT. </li><li> Platzieren Sie den 24-Well-Platte in den Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) und Inkubation für 3 Stunden ± 5 min. Strikt an die 3 Stunden halten ± 5 min Inkubationszeit auf Abweichung zwischen verschiedenen MTT Lesungen zu vermeiden. </li><li> Wenn die MTT Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie eine Saugpumpe vorsichtig absaugen MTT-Medium in allen Bohrungen. </li><li> Füllen Sie den Brunnen mit DPBS und wieder absaugen. Dieser Spülvorgang noch zweimal und stellen Sie sicher, dass die Gewebe trocken sind nach der letzten Aspiration. </li><li> Nach dem Waschen Transfer der Einsätze, um eine neue 24-Well-Platte. Tauchen Sie die Einsätze durch vorsichtiges Pipettieren 2 mL Extraktionsmittel-Lösung (Isopropanol) in jedes einzufügen. Der Pegel wird über den oberen Kanten des Einsatzes steigen, damit Notlaufeigenschaften Gewebe. </li><li> Seal der 24-Well-Platte (zB mit Parafilm oder mit Dichtkissen) zu Extraktionsmittel Verdunstung zu hemmen. Entpacken Sie die MTT aus dem Gewebe, das für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln auf einem Schüttler (ca. 120 rpm). Übernachtung Extraktion ohne Schütteln kann auch verwendet werden. </li><li> Nach der Extraktion Zeitraum abgeschlossen ist, dringen die Einsätze mit einer Injektionsnadel oder Birne Perlen Pasteurpipette und lassen Sie den Auszug in die Brunnen, aus dem das Insert getroffen wird. </li><li> Entsorgen Sie die punktierten einfügen und Pipette die Lösung in der auch oben und unten drei Mal, bis sie homogen ist. </li><li> Für jedes Gewebe, übertragen zwei 200 ul Aliquots der violetten Formazan-Lösung in eine 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte. Übertragen Sie die Duplikate nach der festen Platte Design in der Tabelle zu dieser Video-Protokoll gegeben. Für Rohlinge verwenden Isopropanol. </li><li> Lesen Sie die optische Dichte (OD) des MTT-Extrakte in einem 96-Well-Platte Spektralphotometer mit einer Wellenlänge von 570 nm (540-580), ohne eine Referenz zu filtern. </li><li> Geben Sie die Ergebnisse in die Tabelle für die automatische Berechnung der Ergebnisse (Abb. 1). </li><li> Ein Testchemikalie &quot;reizend&quot; (R38 oder GHS Kategorie 2) gekennzeichnet werden, wenn die prozentuale Lebensfähigkeit des Gewebes durch MTT-Assay bestimmt ist &lt;50% bezogen auf das negative Kontrolle. Hinweis: MTT ist giftig, so achten Sie darauf, Schutzhandschuhe zu tragen beim Umgang. Schützen MTT und seine sosungen aus Licht, da MTT ist lichtempfindlich. Verwenden MTT-Lösung innerhalb weniger Stunden nach der Zubereitung, weil es im Laufe der Zeit verschlechtert. </li></ol> V. Assay Qualitätskontrollen <ul><li> EpiDerm EPI-200-SIT-Kit Annahmebedingungen: In-vitro-RHE-Modellen sollten einheitliche, qualitativ hochwertige Daten über die Zeit geben, nicht nur bei der Validierung (8). Empfohlene Richtlinien zur langfristigen Assay-Reproduzierbarkeit und Leistung zu gewährleisten sind &quot;vollständige Charakterisierung von Zellen oder Geweben, Probenahme jeder Partie ... für Leistung und regelmäßigen Gebrauch von Kontrollen und Benchmark Chemikalien, um Gewissheit über die Konsistenz der Assay-Leistung bieten&quot; (9) . Neben Assay Akzeptanzkriterien unten dargelegt, ist jede Produktion viel EpiDerm Qualitätskontrolle durch den Hersteller gegen eine zusätzliche Benchmark chemische getestet (1% Triton X-100). Die Belichtungszeit benötigt, um Gewebeviabilität zu 50% (ET-50) für Triton X-100 ist bestimmt zu reduzieren. Für EpiDerm haben Jahresdurchschnitt ET-50-Werte von 5,9 Stunden auf 7,5 Stunden lag. Die Charge zu Charge CV für negative Kontrolle Gewebe (dh die Variabilität in Baseline Lebensfähigkeit) hat unter 7,5% für jedes Jahr seit 1996 gemittelt. Um die ET50 Wert jeder Produktionscharge müssen innerhalb von 2 Standardabweichungen von dem historischen Durchschnitt Triton X-100 ET50 in 1996 (;; geringere Akzeptanz limit = 4.8h oberen Akzeptanz limit = 8.7h dh ET-50 = 6,7 Stunden) gegründet fallen für die Verwendung durch den Hersteller freigegeben werden. </li><li> EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 1: Negative Kontrolle: Die absolute OD der negativen Kontrolle (NC) Gewebe (Behandlung mit sterilen DPBS) im MTT-Test ist ein Indikator für die Lebensfähigkeit des Gewebes im Prüflabor nach Transport und die Lagerung Verfahren und unter bestimmten Bedingungen für die Verwendung erhalten. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die mittlere OD 570 von der NC Gewebe ist ≥ 1,0 und ≤ 2,5. </li><li> EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 2: Positive Control A 5% SDS (in H 2 O)-Lösung wird als positive Kontrolle (PC) verwendet werden und gleichzeitig mit dem getesteten Chemikalien getestet. Concurrent bedeutet, dass der PC in jedem Assay getestet werden, aber nicht mehr als ein PC pro Testtag erforderlich ist. Die Lebensfähigkeit der positiven Kontrolle sollte innerhalb von 95% Konfidenzintervall der historischen Daten. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die mittlere Lebensfähigkeit der PC Geweben exprimiert in% der negativen Kontrolle Gewebe beträgt 20%. </li><li> EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 3: Standardabweichung (SD) Die Hautreizung wird aus der mittleren Tragfähigkeit auf 3 Einzel-Geweben bestimmt vorhergesagt und somit die Variabilität der Gewebe repliziert werden sollte akzeptabel niedrig. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die SD von einzelnen% Gewebe Bewohnbarkeit der 3 gleich behandelt berechnet repliziert ist &lt;18%. </li></ul> Repräsentative Ergebnisse <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Abbildung 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Abbildung 3" /> </div> Abbildung 1 Ergebnisse für 6 Test Artikel, NC und PC-Steuerung erhalten -. Ein Teil der automatisierten Tabellenkalkulation für die Berechnung der Ergebnisse. Testen Sie Chemikalien, die Lebensfähigkeit des Gewebes unter 50% bezogen auf NC reduziert werden als reizend eingestuft. Der Test ist optimiert, um Ergebnisse, die weit genug von der Einstufung cut-off (50% Rentabilität) erhöht so die Stabilität des Assays bieten. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Materialien </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Material-Liste" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

In diesem Video haben wir die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) entwickelt und validiert für die in vitro Hautreizungen Prüfung von Chemikalien, darunter kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe nachgewiesen. Bei der Durchführung dieser Methode ist es wichtig, in aseptischen Bedingungen zu arbeiten und sich streng an den validierten Protokoll, da Abweichung vom Protokoll unterschiedlichen Ergebnissen führen können. Einige Modifikationen des Tests sind möglich, jedoch sollten Änderungen an dem Protokoll direkt mit den Autoren diskutiert werden. Die einzige Einschränkung dieser Methode ist, eine mögliche Störung der Testsubstanz mit dem MTT-Endpunkt. Eine farbige Prüfsubstanz oder eine, die direkt reduziert MTT (und damit imitiert Dehydrogenase-Aktivität der Mitochondrien) können mit dem MTT Endpunkt stören. Allerdings sind diese Testsubstanz nur ein Problem, wenn zum Zeitpunkt des MTT-Test (dh 42 Stunden nach der Testsubstanz Exposition) ausreichende Mengen der Testsubstanz sind immer noch auf den heutigen (oder in) der Gewebe. Bei dieser unwahrscheinlichen Fall, die (wahre) metabolische MTT-Reduktion und der Beitrag durch eine farbige Testmaterial oder (false) direkten MTT-Reduktion durch das Testmaterial kann durch ein Verfahren im Detail in dem Test Standard Operation Procedure bereitgestellt durch beschrieben quantifiziert werden MatTek Corp

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

Die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) wurde entwickelt,<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; Und validiert<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Hautreizungen Prüfung von Chemikalien, darunter kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe. Die EpiDerm SIT nutzt die 3D-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Rekonstruierten humanen epidermalen (RHE) Modell EpiDerm. Das Verfahren in diesem Protokoll beschriebenen ermöglicht Diskriminierung zwischen Reizstoffe der Kategorie 2 des GHS-und Nicht-Reizstoffe<sup&gt; (6)</sup&gt;. Der Test wird im Laufe eines 4 Tage Zeitraum durchgeführt, bestehend aus Vor-Inkubation, 60 Minuten Exposition, 42 Stunden post-Inkubation und MTT-Assay Lebensfähigkeit. Nach Erhalt Gewebe und Übernachtung Vorinkubation (Tag 0), sind Gewebe topisch auf die Prüfsubstanz (Tag 1), die flüssige, halbfeste, feste oder Wachs werden ausgesetzt. Drei Gewebe sind für jede Testchemikalie, sowie für die positive Kontrolle (5% aq. SDS-Lösung), und eine negative Kontrolle (DPBS) verwendet. Chemische Belastung dauert 60 Minuten, 35 min, von denen das Gewebe in einem Inkubator bei 37 ° C gehalten Die Testsubstanzen werden dann von der Gewebeoberfläche durch ein umfangreiches Waschvorgang entfernt. Das Gewebe-Einsätze sind ausgelöscht und in frischem Medium. Nach einem 24 Stunden Inkubationszeit (Tag 2), ist das Medium ausgetauscht. Das Medium kann für die weitere Analyse von Zytokinen oder anderen Endpunkte von Interesse gespeichert werden. Nachdem das Medium austauschen, sind Gewebe für weitere 18 Stunden inkubiert. Am Ende des gesamten 42h post-Inkubation (Tag 3), sind die Gewebe in gelben MTT-Lösung überführt und für 3 Stunden. Der resultierende violett-blauen Formazan-Salz, vor allem von mitochondrialen Stoffwechsels gebildet wird, ist für 2 Stunden mit Isopropanol extrahiert. Die optische Dichte der extrahierten Formazan wird mit einem Spektralphotometer. Eine Chemikalie wird als reizend, wenn die Lebensfähigkeit des Gewebes in Bezug auf die negative Kontrolle behandelten Gewebe unter 50% reduziert eingestuft. Dieses Verfahren kann als voller Ersatz der in vivo Kaninchen auf Hautreizungen getestet Gefahrenerkennung und Kennzeichnung von Chemikalien im Einklang mit EU-Vorschriften eingesetzt werden<sup&gt; (7)</sup&gt;.

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An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

In diesem Video zeigen wir die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) entwickelt und validiert<em&gt; In-vitro-</em&gt; Hautreizungen Prüfung von Chemikalien, darunter kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe.

Ein In Vitro Skin Irritation Test (SIT) mit dem EpiDerm Rekonstruierte Human Epidermal (RHE) Model

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

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Serie: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Forschung

Biotechnik

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests phase of drug developing process because they are genetically human and recapitulate the interplay among tissues. In this study, the human intestinal barrier (emulated by a co-culture of Caco-2 and HT-29 cells) and the liver equivalent (emulated by spheroids made of differentiated HepaRG cells and human hepatic stellate cells) were integrated into a two-organ chip (2-OC) microfluidic device to assess some acetaminophen (APAP) pharmacokinetic (PK) and toxicological properties. The MPS had three assemblies: Intestine only 2-OC, Liver only 2-OC, and Intestine/Liver 2-OC with the same media perfusing both organoids. For PK assessments, we dosed the APAP in the media at preset timepoints after administering it either over the intestinal barrier (emulating the oral route) or in the media (emulating the intravenous route), at 12 &#181;M and 2 &#181;M respectively. The media samples were analyzed by reversed-phase high-pressure liquid chromatography (HPLC). Organoids were analyzed for gene expression, for TEER values, for protein expression and activity, and then collected, fixed, and submitted to a set of morphological evaluations. The MTT technique performed well in assessing the organoid viability, but the high content analyses (HCA) were able to detect very early toxic events in response to APAP treatment. We verified that the media flow does not significantly affect the APAP absorption whereas it significantly improves the liver equivalent functionality. The APAP human intestinal absorption and hepatic metabolism could be emulated in the MPS. The association between MPS data and in silico modeling has great potential to improve the predictability of the in vitro methods and provide better accuracy than animal models in pharmacokinetic and toxicological studies.

We exposed a microphysiological system (MPS) with intestine and liver organoids to acetaminophen (APAP). This article describes the methods for organoid production and APAP pharmacokinetic and toxicological property assessments in the MPS. It also describes the tissue functionality analyses necessary to validate the results.

Ein Mikrophysiologisches System für die pharmakokinetische und toxikologische Beurteilung von Arzneimitteln/Leber

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests ...

Chemie

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Entwicklungsbiologie

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

Humanes Ex-vivo-Wundmodell und Whole-Mount-Färbeansatz zur genauen Bewertung der Hautreparatur

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Generierung eines vereinfachten dreidimensionalen Skin-on-a-Chip-Modells in einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Effiziente 3D-Hautmodelle für flexible Forschungsanwendungen

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Vielfalt von Hautmodellen mit kostengünstigen 3D-Zellmodellen

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

Aufbau von Hautmodellen für zahlreiche Anwendungen - von der zweidimensionalen (2D) Monokultur bis zur dreidimensionalen (3D) Multikultur

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

Ein In Vitro Skin Irritation Test (SIT) mit dem EpiDerm Rekonstruierte Human Epidermal (RHE) Model

Transkript

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

Ein Mikrophysiologisches System für die pharmakokinetische und toxikologische Beurteilung von Arzneimitteln/Leber

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Humanes Ex-vivo-Wundmodell und Whole-Mount-Färbeansatz zur genauen Bewertung der Hautreparatur

Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

Generierung eines vereinfachten dreidimensionalen Skin-on-a-Chip-Modells in einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform

Aufbau von Hautmodellen für zahlreiche Anwendungen - von der zweidimensionalen (2D) Monokultur bis zur dreidimensionalen (3D) Multikultur

Aufbau von Hautmodellen für zahlreiche Anwendungen - von der zweidimensionalen (2D) Monokultur bis zur dreidimensionalen (3D) Multikultur