著者らは、変性表皮SIT（5の多施設国際検証研究に参加するためBfRは（ドイツ）、BASF SE（ドイツ）、IIVS社（米国）、ゼットイン- LSL（オーストリア）でZEBETに感謝したいと思います）。

I.ティッシュコンディショナー - 0日目<ol><li>表皮EPI - 200 - SITのキットを受け取ると、（キットの詳細については、特定の試薬と機器の表を参照）整合性のためにすべてのキットコンポーネントを確認してください。 </li><li> 、3表皮組織、ある滅菌6ウェルプレートアッセイ培地0.9 mlをあらかじめ入力して準備する。 </li><li>無菌条件下で、表皮の組織を含む24ウェルプレートを含むビニール袋を開いて、滅菌ガーゼを取り除く。 </li><li>表皮の組織を含む各インサートを削除し、空の24ウェルプレートのインサートを配置するために滅菌ピンセットを使用してください。このステップの間、滅菌濾紙上にブロッティング穏やかでインサートの外側に付着している残りの出荷アガロースを削除します。 </li><li>次の5分以内に、視覚的に組織を検査する。完全に液体で覆われている欠陥のある組織や組織を使用しないでください。 </li><li>滅菌綿棒の綿棒を使用して、慎重に組織の表面を乾燥させる。直接組織に触れないようにしてみてください - 毛細管効果は、組織表面から水分を除去するのに十分です。 </li><li>組織表面を乾燥した後、6ウェルプレートアッセイ培地0.9 mLであらかじめ入力の一番上の行に3つの組織を移す。インサートの下に閉じ込められた気泡を離します。 </li><li> 60用インキュベータへの挿入を含む6ウェルプレートを置き± 37℃で5分間プレインキュベーション± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH（相対湿度）。 </li><li> 60 ± 5分間プレインキュベーション期間の終了時に、6ウェルプレートの下側​​のウェルに上限井戸から挿入して転送する。バック一晩プレインキュベーション（18 ± 3時間）のためのインキュベーター（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）にプレートを置きます。 </li><li>冷蔵庫（5 ± 3℃）にアッセイ培地の残りを置きます。プレインキュベーション一晩続いて、被験物質は、表皮の組織に適用することができます。 注：プレインキュベーションの手順は、後半に組織の配信の場合（組織が ​​水曜日の代わりに火曜日に到着する場合など）に短縮することができます。 </li></ol> II。化学物質の曝露 - 1日目<ol><li>わずか0.9 mlあたりウェルのアッセイ培地で上段を充填することにより被験物質ごとに、6ウェルプレートを準備します。 </li><li>約5分の化学物質への計画的な露出の前に、インキュベーターからプリエアコン組織を含む6ウェルプレートを取り外します。 </li><li>組織の面を評価し、滅菌綿のヒントを使用して水分を取り除く。 </li><li>試験物質のコードや名前を持つすべての6ウェルプレートの蓋にラベルを付けます。 </li><li>投与量1分間隔で被験物質を有する組織は、曝露後の被験物質の洗浄容易にする。最後の組織が投与されるまで、無菌フード内投与された組織でプレートを保管してください。 </li><li>液体化学薬品をテストするには、直接組織の上に溶液30μLを分注し、組織の表面にナイロンメッシュを配置。必要に応じて、そっとガラスパスツールピペットを率いる電球を使用してメッシュを配置します。組織表面に押さないでください。 </li><li>半固体をテストするため、直接組織の上に30μLを分注するために容積式ピペットを使用してください。パスツールピペットを持つ化学物質は、可能な限り組織の表面をカバーするために必要なスプレッド場合。 </li><li>固体材料の場合は、すぐに被験物質の適用前に、滅菌DPBSの25μLを組織表面を湿ら。これは、被験物質による組織表面の接触が改善されます。細かく粉砕された試料の約25 mgの25 mgのキャリブレーション鋭いアプリケーションのスプーン（または他の適切なツールを）埋める。組織表面に固体の被験物質を適用します。必要に応じて、完全にスプーンを空にするパスツールピペットを率いる電球を使用してください。ゆっくりと表面に固体の拡散を改善するために挿入を振る。 </li><li>ろう状の粘度を持つ被験物質の場合は、直径で約8mm作品フラット&quot;のようなクッキー&quot;を形成し、以前に滅菌DPBSで濡らしていた組織、頂上に配置してみてください。被験物質と組織との間の接触を改善するために、ステンレス製またはプラスチック製の助けを借りて、&quot;クッキー&quot;を下に重量を量る。 </li><li>陰性コントロールとコントロールの組織に陽性対照として5％SDSなどのDPBSを適用します。 </li><li>最後のティッシュを投与した後、加湿インキュベーター（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）。ために35のすべてのプレート± 1分を転送</li><li> 35後の± 37℃で1分間のインキュベーション℃のインキュベータからのすべてのプレートを取り外す。無菌フードにプレートを置き、60分の化学物質暴露の期間が最初に投与された組織のために完了するまで待ちます。 </li><li>その後（insurする分の時間間隔ごとにインサートを使用して洗浄操作を開始すべての挿入のための総露光時間が60分であることを電子）。 </li><li>滅菌DPBSで組織を洗浄する洗浄瓶を使用してください。 DPBSの定数ストリームを使用して15回インサート組織を記入し、（注、それを空にする：。ナイロンメッシュを有する組織のために、組織の表面を5回洗浄し、先の尖った、鋭いピンセットで慎重にメッシュを削除するには、その後、残りを続行10回洗浄）。 </li><li> 15日以降に150mlのDPBSで完全に水没挿入3回、洗浄瓶を用いて洗い、試験材料の残りの部分を削除するには振る。 </li><li>最後に、滅菌DPBSで一回内側からと一度外から組織のインサートをすすぐ。 </li><li>優しくインサートを振って、滅菌吸い取り紙の上にブロッティングにより組織からDPBSの余分を削除します。 </li><li>以前にアッセイ培地であらかじめ入力された新しい6ウェルプレートにブロット組織のインサートを移す。これらの手順はすべて、（14-18）、挿入のたびに1分以内に行う必要があります。 </li><li>最後の組織をリンスした後に、慎重に滅菌綿棒をチップソーで各組織の表面を乾燥させる。 </li><li>次の24 ± 2時間（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）のためにインキュベーターで組織をインキュベートする。 注：各アッセイの技術者は、下記のようにプロトコルに従うことができるように、単一のテストラン（セット）での陰性および陽性対照を含めて7つ以上の試験物質をテストしてはいけません </li></ol> III。培地の交換 - 2日目<ol><li> 24 ± 2時間後のインキュベーションの後、6ウェルプレート、メディア0.9 mlを事前に満たされたの下部に挿入して転送する。上段からのメディアは、追加のエンドポイント（サイトカイン、ケモカインなど）の分析用に収集することができます。二次エンドポイントの解析は任意です。 </li><li>ポストインキュベーションを続行します（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）さらに18 ± 3時間。 </li></ol> IV。 MTT生存率アッセイ - 3日目<ol><li>ラベル化学物質名またはコードを持つ2つの24ウェルプレート。一つのプレートには、MTTと抽出工程のための他に組織のインキュベーションのために配信されます。 </li><li> MTT濃縮物（5 mg / mL）を解凍し、MTTの希釈剤で希釈してMTT溶液を調製します。 MTT溶液の最終濃度は1 mg / mlである。 </li><li>ピペット24ウェルプレートの各ウェルにMTT溶液を300μL。 </li><li>インキュベーターから6ウェルプレートを取り外す、吸い取り紙でインサートの底面を覆い隠す、そしてMTT付きプレフィルド24ウェルプレートにそれらを転送する。 </li><li>インキュベーター内で24ウェルプレートを配置する（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）と3時間インキュベート± 5分。厳密に3時間を厳守±異なるMTTの測定値との偏差を避けるために5分のインキュベーション時間を。 </li><li> MTTのインキュベーションが完了すると、静かに全ウェルのMTT培地を吸引する吸引ポンプを使用してください。 </li><li>リフィルは、DPBSで井戸と再び吸引。この洗浄をさらに2回繰り返し、組織の最後の吸引後乾燥していることを確認してください。 </li><li>洗浄後、新しい24ウェルプレートにインサートを移す。軽く各インサートに2 mLの抽出液（イソプロパノール）をピペッティングすることによって、挿入を浸し。レベルは、このように完全に組織を水没、インサートの上端よりも高くなります。 </li><li>抽出剤の蒸発を抑制するために24ウェルプレートを（パラフィルムやシール袋を使用する場合の例）封印。プレートシェーカー（約120回転）で静かに撹拌しながら室温で少なくとも2時間のために組織からMTTを抽出する。振盪せずに一晩抽出を使用することもできます。 </li><li>抽出期間が完了したら、ピアス注射針や電球パスツールピペットをビーズと抽出液が、挿入が取得されたウェルに実行できるようにすると挿入。 </li><li>パンクしたインサートを破棄し、それが均一になるまで上下に三回ものソリューションをピペット。 </li><li>それぞれの組織の場合は、96ウェル平底マイクロタイタープレートに紫色のホルマザンのソリューションの2つの200μLのアリコートを移す。このビデオプロトコルに付随するスプレッドシートで指定された固定プレートのデザインに応じて複製を転送する。ブランクの場合は、イソプロパノールを使用してください。 </li><li>基準フィルタなしで570 nmの（540〜580）の波長を用いて96ウェルプレート分光光度計でMTTの抽出物の光学密度（OD）をお読みください。 </li><li>結果の自動計算（図1）のためのスプレッドシートに結果を入力してください。 </li><li> MTTアッセイによって決定されたパーセントの組織の生存率は陰性対照に対する相対的な&lt;50％の場合、試験物質は&quot;刺激&quot;（R38またはGHSカテゴリ2）ラベルが付いています。 注：MTTは有毒なので、取り扱う際には必ず手袋を着用してください。 MTTとそのように保護する軽いから、MTTからlutionsは敏感な光です。それは時間の経過とともに低下するので、調製後数時間以内にMTT溶液を使用してください。 </li></ol> V.アッセイの品質コントロール<ul><li>表皮EPI - 200 - SITキット承認基準： 体外 RHEモデルではなく、検証のプロセス（8）中、時間をかけて一貫性のある、高品質なデータを提供する必要があります。長期的なアッセイの再現性とパフォーマンスを確保するために推奨されるガイドラインは、&quot;パフォーマンスのための各ロットのサンプリングを細胞または組織の完全な特性、...、及びアッセイのパフォーマンスの一貫性の保証を提供するコントロールとベンチマーク化学物質の定期的な使用&quot;（9）が含まれ。以下に概説するアッセイの受け入れ基準に加えて、表皮の各製造ロットは、追加のベンチマークの化学物質（1％トリトンX - 100）に対して製造業者によってテストされた品質管理です。トリトンX - 100の50％（ET - 50）に組織の実行可能性を減らすために必要な露光時間が決定されます。表皮の場合は、年平均ET - 50値は5.9時間から7.5時間であったしている。ネガティブコントロール組織のための多くのCV（ベースラインの生存率の変動性をすなわち）の多くは、1996年から毎年7.5％の下に平均しています。順番に各製造ロットのET50値は、（上限許容限界= 8.7h;下限許容限界= 4.8h、すなわちET - 50 = 6.7時間）、1996年に設立された歴史的な平均的なトリトンX - 100 ET50の2標準偏差内に収まっている必要がありますメーカーによる使用のためにリリースされる。 </li><li> EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準1：ネガティブコントロール： MTT試験でネガティブコントロール（NC）組織の絶対的なODは（滅菌DPBSで処理）の手順を出荷し、保管した後や特定の使用条件下での試験所で得られた組織の生存能力の指標です。 NC組織の平均OD 570は ≥1.0と≤2.5の場合アッセイは、受け入れ基準を満たしています。 </li><li> EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準2：ポジティブコントロール 5％SDS（H 2 O中）ソリューションは、ポジティブコントロール（PC）として使用し、被験物質と同時にテストされています。 PCは、それぞれのアッセイで試験することではなく、複数のPCが一日のテストごとに必要とされていることを同時手段。陽性対照の生存率は、過去のデータの95％信頼区間内にある必要があります。ネガティブコントロール組織の％として表されるPCの組織の平均生存率が20％の場合、アッセイは、受け入れ基準を満たしています。 </li><li> EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準3：標準偏差（SD） 皮膚刺激性は、3つの組織で決定されるため、組織の変動が許容可能な低いはず複製、平均生存率から予測される。同じ3個％の組織の生存率から算出したSDが複製処理された場合アッセイは、受け入れ基準を満たしている&lt;18％である。 </li></ul>代表的な結果<div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="図1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="図2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="図3" /> </div> 図1 6のテスト記事、NCとPC制御のために得られた結果- 結果の計算のための自動化されたスプレッドシートの一部。 NCを基準にして50％未満の組織の生存率を減少被験物質は刺激性として分類されます。テストは、このように検定の頑健性を高める分類カットオフ（50％生存率）から十分に離れている結果を提供するために最適化されています。 <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> 材料 </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="材料リスト" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

このビデオでは、我々は表皮の皮膚刺激性試験（表皮SIT）を開発し、化粧品及び医薬品成分を含む化学物質のin vitroでの皮膚刺激性試験のための検証を実証した。プロトコルからの逸脱が異なる結果を引き起こす場合があるので、このメソッドを実行するとき、それは、無菌条件下で動作するようにし、厳密に検証プロトコルに従うことが重要です。アッセイのいくつかの変形が可能である、しかし、プロトコルへの変更は、著者と直接相談する必要があります。 この方法の唯一の制限は、MTTのエンドポイントとの被験物質の干渉の可能性があります。直接MTTを減少させる色の被験物質または1つの（そしてそれによって細胞のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性を模倣するには）MTTエンドポイントを妨げる可能性があります。しかし、これらの被験物質は、まだ（またはで）で組織を提示している唯一のMTT試験（すなわち42時間被験物質の暴露後の）被験物質の十分な量の時の場合の問題です。この万一の場合には、着色された試験物質や試験材料による（false）を直接MTTの還元により（本当の）代謝MTTの還元と貢献はで提供されるアッセイの標準操作手順で詳しく説明されている手順によって定量化することができるマテック株式会社

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

表皮の皮膚刺激性試験（表皮SIT）を開発した<sup&gt;（1,2,3）</sup&gt;と検証<sup&gt;（4,5）</sup&gt;のための<em&gt; in vitroで</em化粧品と医薬品成分を含む化学物質の&gt;皮膚刺激性試験、。表皮のSITは、3Dを利用<em&gt; in vitroで</em&gt;再構築されたヒト上皮（RHE）モデルの表皮。このプロトコルで説明する手順では、GHSのカテゴリー2及び非刺激性物質の刺激性物質の区別を可能に<sup&gt;（6）</sup&gt;。試験はプレインキュベーション、60分露出、42時間のポストインキュベーションとMTT生存率アッセイから成る、4日間の期間の経過とともに行われます。組織の領収書と一晩プレインキュベーション（0日）した後、組織を局所的に液体、半固体、固体またはワックスすることができるテストの化学薬品（1日目）、にさらされている。三つの組織は、各被験物質のためだけでなく、ポジティブコントロール（5％水溶液。SDS溶液）、及びネガティブコントロール（DPBS）に使用されます。化学物質の曝露は、組織を37℃インキュベーター内に保持され、そのうち35分℃、60分間持続する被験物質は、広範な洗浄の手順で組織表面から削除されます。組織のインサートは、ブロットし、新鮮な培地に転送されます。 24時間の潜伏期間（2日目）後、培地を交換されます。培地は、サイトカインや関心のある他のエンドポイントのさらなる分析のために保存することができます。培地交換した後、組織を、さらに18時間インキュベートする。全体42hのポストインキュベーション（3日目）の終わりには、組織は、黄色のMTT溶液中に転送され、3時間インキュベートした。ミトコンドリア代謝を中心に形成された結果の青紫色のホルマザンの塩は、、イソプロパノールを使用して2時間抽出されます。抽出されたホルマザンの吸光度を分光光度計を用いて決定されます。化学物質は、陰性対照処置組織への相対的な組織の生存率が50％以下に下がっている場合刺激性として分類される。この手順は、EUの規制に沿って化学物質の危険有害性の特定とラベリングのためのin vivoでのウサギの皮膚刺激性試験での完全な代替として使用することができます<sup&gt;（7）</sup&gt;。

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model at JoVE.com

An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

このビデオでは、我々は表皮の皮膚刺激性試験（表皮SIT）のために開発および検証を実証する<em&gt; in vitroで</em化粧品と医薬品成分を含む化学物質の&gt;皮膚刺激性試験、。

アンインビトロ</em表皮を使用して>皮膚刺激性試験（SIT）は、ヒト上皮（RHE）モデルを再構築

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

67.4K ビュー.  MatTek Corporation.  日本語 

ビデオ: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

クリストファーヒューズ：血管新生の研究のためのin vitroモデル（インタビュー）

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

生物学

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

生殖様細胞に新生マウス皮膚由来幹細胞の分化<em&gt;インビトロ</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

同種異系皮膚移植片で再建された火傷のマウスモデル

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

アンインビトロ皮膚刺激性試験（SIT）は、ヒト上皮（RHE）モデルを再構築