Os autores gostariam de agradecer a ZEBET no BfR (Alemanha), BASF SE (Alemanha), Inc. IIVS (EUA), Zet-LSL (Áustria) para a participação no estudo multicêntrico de validação Internacional da EpiDerm Modificado SIT (5 ).

I. condicionado Tissue - Dia 0 <ol><li> Após o recebimento do kit EpiDerm EPI-200 SIT, verificar todos os componentes do kit de integridade (para detalhes veja a Tabela kit de reagentes e equipamentos específicos). </li><li> Para cada três tecidos EpiDerm, prepare uma placa de 6 poços estéreis pré-cheia com 0,9 ml de meio de ensaio. </li><li> Em condições estéreis, abrir o saco plástico contendo a placa de 24 poços contendo os tecidos EpiDerm e remova a gaze estéril. </li><li> Use uma pinça estéril, para remover cada inserção que contém o tecido EpiDerm e coloque a pastilha na placa de 24 poços vazios. Durante esta etapa, remover qualquer restantes transporte agarose que adere às paredes externas da inserção pelo gentil blotting em papel de filtro estéril. </li><li> Dentro dos próximos cinco minutos, inspecionar visualmente os tecidos. Não use tecidos defeituosos ou tecidos que são completamente cobertas com líquido. </li><li> Utilizando uma zaragatoa de algodão ponta, com cuidado secar a superfície dos tecidos. Tente não tocar o tecido diretamente - efeitos capilares são suficientes para eliminar a umidade da superfície do tecido. </li><li> Após a secagem da superfície do tecido, a transferência de três tecidos para a linha superior das placas de seis poços pré-cheia com 0,9 ml de meio de ensaio. Libertar quaisquer bolhas de ar aprisionadas debaixo do inserções. </li><li> Coloque as placas de 6 poços contendo as inserções na incubadora para a 60 ± 5 min de pré-incubação a 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR (Umidade Relativa). </li><li> No final dos anos 60 período de 5 min ± pré-incubação, transferir as inserções dos poços superior nos poços inferiores da placa de 6 poços. Coloque as placas de volta para a incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR) por um dia para o outro pré-incubação (18 ± 3 h). </li><li> Coloque o restante do meio de ensaio para a (5 ± 3 ° C). Geladeira Após a noite de pré-incubação, os produtos químicos teste pode ser aplicado para os tecidos EpiDerm. Nota: O procedimento de pré-incubação pode ser encurtado em caso de entrega tardia do tecido (por exemplo, se os tecidos chegam na quarta-feira em vez de terça-feira). </li></ol> II. Exposição a substâncias químicas - Dia 1 <ol><li> Prepare uma placa de 6 poços por produto químico teste preenchendo a linha superior apenas com 0,9 ml por poço de meio de ensaio. </li><li> Aproximadamente 5 minutos antes da exposição prevista para produtos químicos, remover as placas de 6 poços contendo os tecidos pré-condicionado da incubadora. </li><li> Avaliar a superfície dos tecidos e retirar a umidade usando cotonetes estéreis. </li><li> Rotular todos os seis tampas bem-placa com os códigos de testar o material ou nomes. </li><li> Dose os tecidos com os produtos químicos teste em intervalos de 1 minuto para facilitar a lavagem dos produtos químicos de teste após a exposição. Mantenha as placas com tecidos dosado na capa estéril, até que o tecido última é dosado. </li><li> Para testar produtos químicos líquidos, dispensar 30 mL da solução diretamente sobre o tecido e colocar a malha de nylon na superfície dos tecidos. Se necessário, suavemente a posição da malha usando o bulbo de vidro dirigido Pasteur pipeta. Não pressione a superfície do tecido. </li><li> Para semi-sólidos de teste, use uma pipeta de deslocamento positivo para dispensar 30 mL diretamente sobre o tecido. Se necessário, a disseminação química com pipeta Pasteur para cobrir a superfície do tecido, tanto quanto possível. </li><li> Para materiais sólidos, pouco antes da aplicação da substância de ensaio, umedecer a superfície do tecido com 25 mL de DPBS estéril. Isto irá melhorar o contato da superfície do tecido com a substância química de ensaio. Encha uma colher de 25 mg aplicação calibrada afiada (ou qualquer outra ferramenta apropriada) com aproximadamente 25 mg de material finamente moído teste. Aplicar o teste químico sólido à superfície do tecido. Se necessário, use uma lâmpada de cabeça Pasteur Pipeta para esvaziar completamente a colher. Agite suavemente o inserções para melhorar a difusão do sólido na superfície. </li><li> No caso de substâncias com consistência cerosa, tentar formar um &quot;cookie como&quot; flat pedaço de cerca de 8 mm de diâmetro e coloque-o em cima do tecido, que foi previamente umedecido com DPBS estéril. Para melhorar o contato entre substância e tecidos, pesar o &quot;cookie&quot; com um aço inoxidável ou de plástico ajuda. </li><li> Aplicar DPBS como o controle negativo e SDS 5% como controle positivo para os tecidos de controle. </li><li> Após a administração do tecido passado, transferir todas as placas para 35 ± 1 minuto para a incubadora umidificada (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% UR). </li><li> Após a 35 ± 1 minuto de incubação a 37 ° C remover todas as placas da incubadora. Coloque as placas na capa estéril e esperar até que um período de 60 minutos de exposição química é preenchido para o primeiro tecido dosado. </li><li> Depois iniciar o procedimento de lavagem usando a inserir um intervalo de tempo por minuto (para um seguroe que o tempo total de exposição para cada inserção é de 60 minutos). </li><li> Use um frasco de lavagem para lavar os tecidos com DPBS estéril. Preencha o tecido inserir 15 vezes usando um fluxo constante de DPBS e esvaziá-lo (Nota:. Para os tecidos com uma malha de nylon, lavar a superfície do tecido 5 vezes e remover a malha cuidadosamente com o apontado, pinças afiadas Depois, continue com os restantes 10 lavagens). </li><li> Após o 15 enxaguar utilizando o frasco de lavagem, submergir completamente a inserção 3 vezes em 150 DPBS ml e agitar para remover o restante do material de teste. </li><li> Finalmente, lave a inserção do tecido uma vez a partir do interior e uma vez do lado de fora com DPBS estéril. </li><li> Remova qualquer excesso de DPBS a partir do tecido agitando a inserir e blotting-lo no papel estéril blotting. </li><li> Transferir as inserções de tecidos riscados para o novo prato 6-bem anteriormente pré-cheia com o meio de ensaio. Todas essas etapas (14-18) deve ser feito dentro de 1 min para cada inserção. </li><li> Após a última tecido é enxaguado, seco cuidadosamente a superfície de cada tecido com algodão estéril ponta cotonete. </li><li> Incubar os tecidos na incubadora para o próximo 24 ± 2 horas (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% UR). Nota: Cada técnico do ensaio não deve testar mais de 6 substâncias, incluindo os controles positivos e negativos em uma corrida de teste único (set), para poder seguir o protocolo, conforme descrito abaixo </li></ol> III. Meio de troca - Dia 2 <ol><li> Após a 24 ± 2 horas pós-incubação, transferir o insere na parte inferior da placa de 6 poços, pré-cheia com 0,9 ml de mídia. Meios de comunicação de linhas superior pode ser recolhida para análise dos pontos finais adicionais (citocinas, quimiocinas, etc.) Análise dos desfechos secundários é opcional. </li><li> Continuar com a pós-incubação (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR) por mais 18 ± 3 horas. </li></ol> IV. MTT Assay Viabilidade - Dia 3 <ol><li> Etiqueta de duas placas de 24 poços com os nomes químicos ou códigos. Uma placa servirá para a incubação do tecido com MTT e outro para a etapa de extração. </li><li> Preparar a solução de MTT por descongelamento concentrado MTT (5 mg / ml) e diluir com o diluente MTT. Concentração final da solução de MTT é de 1 mg / ml. </li><li> Pipetar 300 mL da solução de MTT em cada poço da placa de 24 poços. </li><li> Retirar as placas de 6 poços de incubadora, blot o fundo das inserções em um mata-borrão, e transferi-los para a placa de 24 poços de pré-preenchido com MTT. </li><li> Coloque a placa de 24 poços na incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% RH) e incubar por 3 horas ± 5 min. Estritamente as 3 horas o tempo de incubação ± 5 min para evitar o desvio entre as leituras MTT diferentes. </li><li> Quando a incubação MTT está completa, use uma bomba de sucção para aspirar cuidadosamente o meio MTT de todos os poços. </li><li> Recarga dos poços com DPBS e aspirar novamente. Repita esta lavagem mais duas vezes e certifique-se que os tecidos estão secos após a aspiração passado. </li><li> Após a transferência lava as pastilhas a uma placa de 24 poços novos. Mergulhe as pastilhas com cuidado pipetando 2 mL de solução extrator (Isopropanol) em cada inserção. O nível vai subir acima das bordas superiores da inserção, assim, completamente submergindo os tecidos. </li><li> Selar a placa de 24 poços (por exemplo, com Parafilm ou usando saco de vedação) para inibir a evaporação extrator. Extraia o MTT dos tecidos, pelo menos, duas horas à temperatura ambiente com agitação suave em um shaker placa (~ rpm 120). Extração sem agitação durante a noite também pode ser usado. </li><li> Após o período de extração é completa, furar as inserções com uma agulha de injeção ou o bulbo de contas pipeta Pasteur e permitir que o extrato a correr para o bem de que a inserção foi tirada. </li><li> Descartar a inserir perfurado e pipetar a solução no poço de cima para baixo três vezes até que esteja homogêneo. </li><li> Para cada tecido, de transferência de duas alíquotas 200 mL da solução de formazan púrpura em uma placa de 96 poços de fundo plano de microtitulação. Transferir as duplicatas de acordo com o projeto placa fixa dada na planilha que acompanha este protocolo de vídeo. Para espaços em branco, use isopropanol. </li><li> Ler a densidade óptica (DO) dos extratos em espectrofotômetro MTT placa de 96 poços usando um comprimento de onda de 570 nm (540-580), sem um filtro de referência. </li><li> Inserir os resultados na planilha para cálculo automático dos resultados (Figura 1). </li><li> A substância em estudo é rotulado «irritante» (R38 ou GHS categoria 2) se a viabilidade dos tecidos por cento determinado pelo ensaio de MTT é &lt;50% em relação ao controle negativo. Nota: MTT é tóxico, portanto não se esqueça de usar luvas ao manusear. MTT e proteger a sua tãoluções da luz, já que MTT é sensível à luz. Use solução de MTT dentro de algumas horas após o preparo porque degrada com o tempo. </li></ol> V. Qualidade Assay Controles <ul><li> EpiDerm EPI-200-SIT Critérios de aceitação kit: Modelos in vitro RHE deve fornecer dados consistentes e de alta qualidade ao longo do tempo, não apenas durante o processo de validação (8). Diretrizes recomendadas para garantir a longo prazo reprodutibilidade do ensaio e do desempenho incluem &quot;a caracterização completa de células ou tecidos, amostras de cada lote ... para o desempenho, e uso regular de controles e produtos químicos de referência para fornecer uma garantia de consistência de desempenho do ensaio&quot; (9) . Além de critérios de aceitação do ensaio descrito a seguir, cada lote de produção de EpiDerm é o controle de qualidade testada pelo fabricante contra um produto químico de referência adicional (1% Triton X-100). O tempo de exposição necessário para reduzir a viabilidade do tecido a 50% (ET-50) de Triton X-100 é determinado. Para EpiDerm, média anual ET-50 valores têm variado de 5,9 horas para 7,5 horas. O lote a lote para tecidos CV controle negativo (ou seja, a variabilidade da viabilidade de base) foi em média menos de 7,5% por cada ano desde 1996. O valor de ET50 cada lote de produção deve cair dentro de 2 desvios padrão da média histórica Triton X-100 ET50 criada em 1996 (ou seja, ET-50 = 6,7 horas; Limite mínimo de aceitação = 4.8h; limite de aceitação superior = 8.7h), a fim para ser liberado para uso pelo fabricante. </li><li> EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 1: Controle Negativo: O OD absoluta do controlo negativo (NC) tecidos (tratados com DPBS estéril) na MTT-teste é um indicador da viabilidade dos tecidos obtidos no laboratório de testes após o envio e armazenamento de procedimentos e sob condições específicas de utilização. O ensaio atende ao critério de aceitação se o OD significa 570 dos tecidos NC é ≥ 1,0 e ≤ 2,5. </li><li> EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 2: Controle Positivo A solução a 5% SDS (em H 2 O) é usado como controle positivo (PC) e testado em simultâneo com os produtos químicos de teste. Significa simultâneos que o PC tem que ser testada em cada ensaio, mas não mais do que um PC é necessário por testes dia. Viabilidade do controlo positivo deve ser dentro do intervalo de confiança de 95% dos dados históricos. O ensaio satisfaz o critério da aceitação se a viabilidade média de tecidos PC expressos como% dos tecidos controle negativo é de 20%. </li><li> EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 3: Desvio Padrão (SD) A irritação cutânea é previsto a partir da viabilidade média determinada em 3 tecidos único e, portanto, a variabilidade de tecido réplicas deve ser aceitavelmente baixo. O ensaio atende ao critério de aceitação se o SD calculado a partir de viabilidades% cada tecido do 3 identicamente tratados replica é &lt;18%. </li></ul> Resultados representante <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Figura 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Figura 3" /> </div> Figura 1 Resultados obtidos para seis artigos de teste, NC e controle PC -. Parte da planilha para o cálculo automático dos resultados. Produtos químicos teste que reduziu a viabilidade do tecido abaixo de 50% referenciados NC são classificados como irritantes. O teste foi otimizado para fornecer resultados que são suficientemente longe da classificação de corte (50% de viabilidade), aumentando assim a robustez do ensaio. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Materiais </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Lista de Materiais" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

Neste vídeo, temos demonstrado a EpiDerm teste de irritação da pele (EpiDerm SIT) desenvolvido e validado para testes in vitro irritação da pele de produtos químicos, incluindo ingredientes cosméticos e farmacêutica. Ao executar este método, é importante trabalhar em condições assépticas e seguir estritamente o protocolo validado, uma vez que desvio do protocolo podem causar resultados diferentes. Algumas modificações do ensaio são possíveis, no entanto, alterações ao protocolo deve ser discutido diretamente com os autores. A única limitação deste método é uma possível interferência da substância de ensaio com a extremidade MTT. Uma substância de cor ou uma que reduz diretamente MTT (e, assim, imita atividade desidrogenase da mitocôndria celular) pode interferir com o endpoint MTT. No entanto, essas substância são um problema somente se no momento do teste MTT (ou seja, 42 horas após a exposição à substância de teste) uma quantidade suficiente da substância de ensaio ainda estão presentes no (ou dentro) dos tecidos. No caso deste evento improvável, o (verdadeiro) redução MTT metabólica e da contribuição por um material de teste colorido ou (false) redução MTT direta pelo material de teste pode ser quantificado através de um procedimento descrito em detalhes no Procedimento de Operação Padrão fornecido pelo ensaio Mattek Corp

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

O teste EpiDerm Irritação da pele (EpiDerm SIT) foi desenvolvido<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; E validados<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Para<em&gt; In vitro</em&gt; Teste de irritação da pele de produtos químicos, incluindo ingredientes cosméticos e farmacêutica. O SIT EpiDerm utiliza o 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Reconstruída epidérmico humano (RHE) EpiDerm modelo. O procedimento descrito neste protocolo permite a discriminação entre os irritantes da categoria GHS 2 e não-irritantes<sup&gt; (6)</sup&gt;. O teste é realizado ao longo de um período de tempo 4 dias, consistindo de pré-incubação, 60 minutos de exposição, 42 horas pós-incubação eo ensaio de viabilidade MTT. Após o recebimento dos tecidos e pré-incubação durante a noite (Dia 0), os tecidos são topicamente expostos aos produtos químicos de teste (dia 1), que pode ser líquido, semi-sólidos, sólidos ou cera. Três tecidos são utilizados para cada substância em estudo, bem como para o controle positivo (5% aq. Solução SDS), e um controle negativo (DPBS). Exposição a produtos químicos tem a duração de 60 minutos, 35 min do que os tecidos são mantidos em uma incubadora a 37 ° C. As substâncias de ensaio são então removidos da superfície do tecido por um procedimento de lavagem extensiva. As inserções de tecidos são apagados e transferidos para meio fresco. Após um período de incubação 24 h (dia 2), o meio é trocado. O meio pode ser guardado para posterior análise de citocinas ou outros parâmetros de interesse. Após a troca de médio, os tecidos são incubados por um período adicional de 18 horas. No final da 42h inteira de pós-incubação (dia 3), os tecidos são transferidos para solução de MTT amarelo e incubadas por 3 horas. A resultante azul-púrpura sal formazan, formada principalmente pelo metabolismo mitocondrial, é extraído por 2 horas usando isopropanol. A densidade óptica do formazan extraído é determinado usando um espectrofotômetro. Um produto químico é classificado como um irritante se a viabilidade dos tecidos em relação ao controle negativo tecidos tratados é reduzida abaixo de 50%. Este procedimento pode ser usado como substituto completo do teste in vivo irritação de pele de coelho para identificação de perigos e rotulagem de produtos químicos, de acordo com os regulamentos da UE<sup&gt; (7)</sup&gt;.

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An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Neste vídeo, demonstramos a EpiDerm teste de irritação da pele (EpiDerm SIT) desenvolvido e validado para<em&gt; In vitro</em&gt; Teste de irritação da pele de produtos químicos, incluindo ingredientes cosméticos e farmacêutica.

Um In Vitro Teste de Irritação da pele (SIT), utilizando o EpiDerm Reconstruído epidérmico humano Model (RHE)

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

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Vídeo: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioengenharia

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests phase of drug developing process because they are genetically human and recapitulate the interplay among tissues. In this study, the human intestinal barrier (emulated by a co-culture of Caco-2 and HT-29 cells) and the liver equivalent (emulated by spheroids made of differentiated HepaRG cells and human hepatic stellate cells) were integrated into a two-organ chip (2-OC) microfluidic device to assess some acetaminophen (APAP) pharmacokinetic (PK) and toxicological properties. The MPS had three assemblies: Intestine only 2-OC, Liver only 2-OC, and Intestine/Liver 2-OC with the same media perfusing both organoids. For PK assessments, we dosed the APAP in the media at preset timepoints after administering it either over the intestinal barrier (emulating the oral route) or in the media (emulating the intravenous route), at 12 &#181;M and 2 &#181;M respectively. The media samples were analyzed by reversed-phase high-pressure liquid chromatography (HPLC). Organoids were analyzed for gene expression, for TEER values, for protein expression and activity, and then collected, fixed, and submitted to a set of morphological evaluations. The MTT technique performed well in assessing the organoid viability, but the high content analyses (HCA) were able to detect very early toxic events in response to APAP treatment. We verified that the media flow does not significantly affect the APAP absorption whereas it significantly improves the liver equivalent functionality. The APAP human intestinal absorption and hepatic metabolism could be emulated in the MPS. The association between MPS data and in silico modeling has great potential to improve the predictability of the in vitro methods and provide better accuracy than animal models in pharmacokinetic and toxicological studies.

We exposed a microphysiological system (MPS) with intestine and liver organoids to acetaminophen (APAP). This article describes the methods for organoid production and APAP pharmacokinetic and toxicological property assessments in the MPS. It also describes the tissue functionality analyses necessary to validate the results.

Um sistema microfisiológico intestinal/hepático para avaliação farmacocinética e toxicológica de drogas

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests ...

Química

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Biologia do Desenvolvimento

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

Modelo de ferida ex vivo humana e abordagem de coloração de montagem inteira para avaliar com precisão o reparo da pele

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Geração de Equivalentes de Pele Humana Vascularizada Auto-montado

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Geração de um modelo simplificado de pele em um chip tridimensional em uma plataforma microfluida micromaquinda

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modelos de pele 3D eficientes para aplicação de pesquisa flexível

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Aprimorando a diversidade de modelos de pele com modelos celulares 3D econômicos

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

Construindo modelos de pele para inúmeras aplicações - da monocultura bidimensional (2D) à multicultura tridimensional (3D)

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

Um In Vitro Teste de Irritação da pele (SIT), utilizando o EpiDerm Reconstruído epidérmico humano Model (RHE)

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Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

Um sistema microfisiológico intestinal/hepático para avaliação farmacocinética e toxicológica de drogas

Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

Modelo de ferida ex vivo humana e abordagem de coloração de montagem inteira para avaliar com precisão o reparo da pele

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

Geração de Equivalentes de Pele Humana Vascularizada Auto-montado

Geração de um modelo simplificado de pele em um chip tridimensional em uma plataforma microfluida micromaquinda

Construindo modelos de pele para inúmeras aplicações - da monocultura bidimensional (2D) à multicultura tridimensional (3D)

Construindo modelos de pele para inúmeras aplicações - da monocultura bidimensional (2D) à multicultura tridimensional (3D)