Prodotto da Loredana Manfra dell&#39;Istituto per la tutela dell&#39;ambiente e della ricerca (ISPRA-Dipartimento di controllo della qualità ambientale) e Federica Savorelli dell&#39;Agenzia Regionale per la Protezione dell&#39;Ambiente (Emilia-Romagna, Italia). I membri di riferimento per il sub-gruppo di lavoro il crostaceo Artemia all&#39;interno del gruppo biologico Metodi - Saltwater / acque salmastre e sedimenti della Commissione UNICHIM sulla qualità delle acque (l&#39;istituto per il funzionamento delle norme tecniche nel settore chimico). Videografia e l&#39;editing di Marco Pisapia di ISPRA (Unità Web). Coordinamento della produzione di Anna Maria Cicero e Erika Magaletti di ISPRA (Dipartimento di controllo della qualità ambientale). Vorremmo ringraziare l&#39;Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale della Regione Emilia-Romagna, Filiale di Ferrara, il Gruppo biologica Metodi - Saltwater / SalmastroAcqua e sedimenti della Commissione UNICHIM sulla qualità dell&#39;acqua e Luciana Migliore, Università di Tor Vergata (Roma) per la loro cooperazione; Rossella Boscolo e Massimo Gabellini di ISPRA (Dipartimento di Prevenzione e mitigazione degli impatti) per il loro sostegno finanziario, Fabio Matassa e il London Scuola di Lingue a Roma per il loro supporto linguistico.

1. Metodo Standard Il test consiste nel sottoporre larve Artemia ad un intervallo di concentrazioni della sostanza o di un campione di prova per determinare i livelli di concentrazione o diluizione che potrebbero causare la morte del 50% degli organismi (LC 50) esposto per 14 giorni e di soddisfare le condizioni definite con questo metodo. Se necessario e possibile, possono anche essere determinato: a) il livello di concentrazione che provoca la morte del 20% degli organismi esposti (LC 20), b) il più alto livello di concentrazione analizzato che non determina un tasso di mortalità più elevato di quello dei il controllo negativo (NOEC), il livello più basso concentrazione saggiata che determina, dopo 14 giorni, un tasso di mortalità più elevato di quello del controllo negativo (LOEC). 2. Prova dei materiali 2.1 uova di Artemia Per eseguire il test, Artemia franciscana </emLarve&gt; meno di 48 ore di vita (nauplii) sono obbligatori, in stadio II o III, ottenuti da uova appena schiusi 5. Uova o cisti certificati utilizzati per supportare il testing sono disponibili in commercio, ad esempio, della divisione Research Quality Assurance, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, USA o dal Laboratorio per la ricerca biologica in fenomeni di inquinamento acquatico, Università di Ghent, in Belgio. 2,2 di acqua di diluizione Salata sintetica può essere utilizzata come acqua di diluizione, preparata sciogliendo riconosciuti reagenti di qualità analitica o una formulazione disponibile in commercio in acqua distillata o deionizzata. Miscele di sale per creare l&#39;acqua salata ideale sono commercialmente disponibili, ad esempio le miscele Ocean istantanea. Si raccomanda di acqua di diluizione con una salinità pari a 35 (± 2) PSU nonché una concentrazione di ossigeno disciolto superiore al 80% del valore di saturazione e una temperatura di 25 (± 2) egradi; C. Dopo aerazione per 48 ore e filtrazione in filtri con una porosità di almeno 0,45 um, la diluizione può essere conservato per un massimo di 30 giorni al buio a una temperatura di 0-4 ° C. 2,3 coltura di alghe Si raccomanda che gli organismi test sono si nutrono di microalghe Dunaliella tertiolecta, che crescono in modo esponenziale e di raggiungere densità di 1.3x10 6 - 2.0x10 6 cellule / ml. La sperimentazione su campioni ambientali richiede culture con densità superiori a 2.0x10 6 cellule / ml 6. Si suggerisce che Dunaliella tertiolecta cresce in un terreno di coltura contenente acqua di mare (30 (± 2) PSU e 20 (± 1) ° C) con l&#39;aggiunta di sostanze nutritive essenziali, minerali e vitamine. Alcune indicazioni sulla composizione delle alghe i media e la preparazione sono riportati in appendice. La densità cellulare iniziale è suggerito per essere circa 10 5 cellule / ml. La coltura di alghe è mantenuto in unotermostato ambiente a 20 (± 1) ° C, illuminato con lampade fluorescenti 3000 (± 300) lx, con un rapporto fotoperiodo di 16 ore di luce a 8 ore di oscurità. Altre specie fitoplanctoniche potrebbe anche essere utilizzato per l&#39;alimentazione ma sarebbe necessario effettuare studi comparativi con queste specie fitoplanctoniche per trovare i &quot;equivalente&quot; specie di Dunaliella tertiolecta, poiché le condizioni sperimentali (ad esempio densità cellulari iniziali, illuminazione luce, temperatura, composizione di terreni di coltura e tempo di esposizione) varia a seconda delle specie di fitoplancton. Oltre la tolleranza delle microalghe di inquinanti differenti deve essere considerata in quanto gli effetti inquinanti sulla crescita e lo sviluppo di impatto fitoplancton anche al Artemia. 2,4 Sostanza di riferimento La sostanza di riferimento in questo test è Dodecyl solfato di sodio. 2,5 di vetro per laboratorio <ol><li> Contenitori di prova di cui 100 ml bicchieri di vetro borosilicato (18 per eseguire test e 18 per il trasferimento di soluzioni). </li><li> Un pallone (ad esempio, beuta da 500 ml) per preparare la soluzione standard. </li><li> Sei palloni (ad esempio, 200 palloni da ml) per preparare le soluzioni di testing. </li><li> Vetro o polistirolo 5 cm di diametro piastre Petri con sfoderabile da utilizzare per attivare le cisti e trasferimento Artemia dal piatto schiusa ai contenitori di prova. </li><li> Pipette Pasteur di vetro (con le punte arrotondate alla fiamma) per trasferire il naupli. </li><li> Cannule di vetro o Pasteur 3 ml pipette di plastica monouso (da tagliare) per il trasferimento di Artemia. </li><li> Micropipette e pipette graduate per preparare le soluzioni di testing. </li><li> Sei cilindri graduati (per esempio 50 cilindri ml) per il trasferimento di soluzioni di test dai palloni a Tegli prova contenitori. </li></ol> 3. Cisti di attivazione 3,1. Piastre Petri contenenti cisti + versare acqua Per generare organismi di prova, 20 mg di cisti sono posti in una capsula Petri contenente 12 ml di acqua di diluizione 48 ore prima della prova. 3.2. L&#39;incubazione nella luce e nel buio Il piatto Petri viene mantenuta a 25 (± 2) ° C e ad una 4000 (± 1000) lux (lumen per metro quadrato) l&#39;intensità della luce per un&#39;ora. 3,3. Sostituzione del mezzo con il microscopio Dopo 24 ore, le larve schiusa sono trasferiti in una piastra Petri nuovo riempita con acqua artificiale. Il trasferimento viene eseguita utilizzando il microscopio, cioè utilizzando una sorgente luminosa in modo che l&#39;, larve cova fototropico migrano verso il fascio di luce. Un bicchiere pipetta Pasteur è usato per fare il trasferimento, assicurando che solo il nascente larve are trasferito e non le cisti o le larve ancora in membrane. 3,4. L&#39;incubazione al buio Il piatto contenente le larve è posto in una camera termostatica buio per 24 ore a 25 (± 2) ° C. 4. Preparazione delle soluzioni di prova 4,1. Pesatura della sostanza + trasferire nel pallone Si raccomanda che la soluzione standard per la sostanza di prova viene preparata sciogliendo 0,5 g della sostanza in un pallone da 500 ml. Il pallone viene riempito con acqua deionizzata o distillata e la soluzione viene agitata fino a quando la sostanza di prova è completamente sciolto. Soluzioni devono essere preparate al momento dell&#39;uso a meno che non è noto se la sostanza è stabile in soluzione. In tal caso, la soluzione standard può essere preparata fino a due giorni prima del test. 4,2. Preparazione del controllo negativo, l&#39;aggiunta di acqua di diluizione e alghe wisecolo la pipetta da 10 ml Il controllo negativo viene preparata in un pallone (esempio 200 ml) aggiungendo una aliquota della sospensione algale per l&#39;acqua di diluizione in modo che una densità di 10 5 cellule / ml viene ottenuta. 4,3. Preparare le soluzioni di test: l&#39;aggiunta di acqua di diluizione, alghe e soluzione standard Si suggerisce che le soluzioni di prova sono preparati in cinque matracci tarati da 200 aggiungendo la soluzione standard per l&#39;acqua di diluizione nelle quantità specificate in modo che le concentrazioni desiderate per il test si ottiene. Per alimentare gli organismi, aliquote di una sospensione Dunaliella microalghe tertiolecta possono essere utilizzati e aggiunto a raggiungere una densità di 10 5 cellule / ml quando soluzioni di prova sono preparati. Il seguente ordine di aggiunta è consigliato: acqua di diluizione, la sospensione delle alghe e la soluzione standard. Dopo la preparazione di soluzioni di test, essi devono essere utilizzati nel test appena possibile. 4,4. Trasferimento di soluzioni dal pallone ai contenitori di prova, poi le piastre di Petri Quantità uguale (50 ml) delle soluzioni di prova sono introdotti nei contenitori di test che utilizza il cilindro graduato. Tre repliche per ciascuna concentrazione sono fatti. Per ciascuna serie di test, un contenitore di controllo viene preparato con una quantità di acqua di diluizione pari al volume delle soluzioni di prova. Volumi uguali (circa 12 ml) delle soluzioni di prova vengono introdotti nelle piastre di Petri. Per ogni serie di test, un piatto di controllo Petri viene utilizzato. 5. Preparazione per le prove 5,1. Nauplii al II-III stadio Quarantotto ore dopo l&#39;attivazione cisti, i naupli raggiungere il II-III stadio larvale e sono quindi utilizzabili per i test. 5,2. Trasferimento nauplii nelle piastre di Petri con il microscopio Il piatto Petri utilizzato per cisti<html> attivazione è preso dalla camera termostatica. Una piccola quantità di larve vengono trasferite in piastre di Petri contenenti il ​​controllo e le soluzioni di test. Questo compito deve essere eseguito con il microscopio utilizzando una pipetta di diametro sufficientemente ampia in modo che i microrganismi non vengono danneggiati. In questa fase del test, il trasferimento può essere eseguito con una pipetta Pasteur vetro (con punta arrotondata di fiamma) e una sorgente di luce posizionati lateralmente che incoraggia il Artemia ad aggregarsi. 5,3. Trasferimento nauplii dalle piastre di Petri nei contenitori di prova con il microscopio Dieci larve vengono trasferiti dalle soluzioni di prova Petri per i contenitori di prova. Anche questa operazione deve essere effettuata utilizzando la pipetta Pasteur e microscopio. Si raccomanda che un volume non superiore a 1 mL viene trasferito nel passaggio di larve non influenzare il volume complessivo del sistema di test. e_step &quot;&gt; 5.4. contenitori pieni coperto con parafilm I bicchieri di prova sono coperti con parafilm (lasciando uno spazio per il passaggio dell&#39;aria), e mantenuta ad una temperatura di 25 (± 2) ° C per tutta la durata della prova e ad una illuminazione di 900 (± 100) lx con un fotoperiodo rapporto di 14 ore di luce a 10 ore di oscurità. 6. Sostituzione del Supplemento Media and Food 6,1. Tasso di sopravvivenza di controllo Due giorni dopo il test è stato avviato, e poi, dopo giorni 5, 7, 9 e 12, l&#39;Artemia è osservato al microscopio per verificare il tasso di sopravvivenza e di sostituire il mezzo e l&#39;integratore alimentare. Numero di organismi viventi viene contato in ogni contenitore test. Dopo l&#39;osservazione al microscopio e lieve stimolazione meccanica (ad esempio toccando le larve con una pipetta Pasteur di vetro), organismi che non mostrano un certo movimento per circa 10 seconds dovrebbe essere considerato morto. 6,2. Preparazione di una soluzione di prova mostra campionamento alghe con una pipetta 10 ml e campionamento della sostanza da testare con una micropipetta. Trasferimento di soluzioni dal pallone ai contenitori di test Durante il test, le soluzioni di prova devono essere sostituiti periodicamente, e preparata nello stesso giorno in cui devono essere utilizzati. Le soluzioni di prova sono realizzati dalla soluzione standard precedentemente preparata. 6,3. Artemia trasferimento, utilizzando un taglio pipetta Pasteur, dai contenitori di prova vecchi ai tre nuovi contenitori Il trasferimento di Artemia viene eseguito usando una pipetta con un diametro sufficientemente ampio in modo da non danneggiare gli organismi. Durante questa fase, uno ml 3 plastica pipetta Pasteur (da tagliare) possono essere utilizzati. 6,4. Le larve in un bicchiere contenente sia vivo o morto Artemia Dopo 1<html> 4 giorni di esposizione alla fine del test, il numero di sopravvissuti larve viene contato e registrato sul foglio. LC 50 e / o LC 20, NOEC e LOEC a 14 giorni, sono calcolati e registrati, così come i limiti di confidenza al 95% in cui i metodi appropriati, e di calcolo. 7. Risultati rappresentativi Alla fine della prova (14 giorni), calcolare la percentuale di mortalità per ciascuna concentrazione, secondo la formula seguente: (M s / N) * 100 Dove: M s è il numero medio di individui morti nel campione analizzato N è il numero totale di individui esposti La tabella 1 riporta un esempio di dati di test (14d) con Artemia esposto sodio dodecil solfato. <table border="1"><tbody><tr><td> Concentrazioni (mg / l) </td>&quot;&gt; Numero di persone sono morte in ogni replica </td><td> Mortalità (%) </td></tr><tr><td></td><td> Io </td><td> II </td><td> III </td><td></td></tr><tr><td> Controllo negativo </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1,56 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3,12 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> 6,25 </td><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 12,5 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 25,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 50,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Inoltre, determinareLC 50 valore di una trama grafica gaussiana logaritmica o con metodi statistici appropriati (per esempio Spearman-Karber o di un metodo Probit). Il calcolo di LC 50 per i dati di tabella 1 è 8,18 (7,15-9,37) mg / l. Se la concentrazione massima causavano una mortalità inferiore del 50%, non si deve procedere al calcolo del valore 50 LC che sarebbe quindi inaffidabili o addirittura non calcolabile. In questo caso, tuttavia, sarebbe opportuno ripetere il test estendendo la gamma di concentrazioni testate. In alternativa, il valore LC 50 è più correttamente espressa come superiore alla concentrazione più elevata, che potrebbe indicare la percentuale di mortalità a concentrazione più elevata e la concentrazione massima corrispondente ad un nessun effetto. I risultati sono considerate valide se alla fine del test le seguenti condizioni sono state soddisfatte: <ol class="lalpha"><li> del controllo tasso di mortalità medioè ≤ 20%; </li><li> dove con sodio dodecil solfato, il LC 50 a 14 giorni è incluso nel 8,0 (± 5) mg / l intervallo. </li></ol> Se le condizioni di cui sopra non sono state rispettate, tutti i dati ottenuti con lo stesso lotto di organismi dovrebbero essere considerati non validi e prove ripetute.

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	<li>Togulga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Short-Term+Toxicity+of+Two+Toxicants+to+Artemia+Nauplii.">The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii.</a> Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).</li><li>Persoone, G., Wells, P. G., Sorgeloos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artemia+in+aquatic+toxicology:+a+review.">Artemia in aquatic toxicology: a review.</a> Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. , 259-275 (1987).</li><li>Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+genus+Artemia+in+ecotoxicity+testing.">Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing.</a> Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).</li><li>APAT IRSA-CNR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).</li><li>Sorgellos, P., Wielen, C. R. e. m. i. c. h. e. -. V. a. n. D. e. r., Persoone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Artemia+nauplii+for+toxicity+tests+â€“+a+critical+analysis.">The use of Artemia nauplii for toxicity tests â€“ a critical analysis.</a> Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).</li><li>Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Set+up+of+a+standard+methodology+for+14-day+bioassay+on+Artemia+franciscana+and+A.+parthenogenetica.">Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica.</a> Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).</li><li>Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+toxicity+of+arsenic+to+the+Great+Salt+Lake+brine+shrimp,+Artemia+franciscana.">Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana.</a> Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).</li><li>Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+a+chronic+site-specific+water+quality+standard+for+selenium+in+the+Great+Salt+Lake,+Utah,+USA.">Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA.</a> Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualit&#225;+dell'acqua+-+Determinazione+della+tossicit&#225;+letale+a+14+giorni+con+Artemia+franciscana+(Crustacea:+Anostraca).">Qualit&#225; dell'acqua - Determinazione della tossicit&#225; letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca).</a> Commissione UNICHIM "Qualit&#225; dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , (2010).</li><li>Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cholinesterases+and+evaluation+of+the+inhibitory+potential+of+chlorpyrifos+and+dichlorvos+to+Artemia+salina+and+Artemia+parthenogenetica.">Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica.</a> Chem. 48, 563-569 (2002).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Artemia è uno dei più importanti organismi di prova disponibili per i test di ecotossicità e di ricerca fatto finora ci consente di affermare che è possibile sostenere diverse opzioni connessi al consumo di Artemia in Tossicologia ed Ecotossicologia. Le caratteristiche che trasformano questo organismo in una specie adatti per saggi biologici sono: una vasta distribuzione geografica, elevata adattabilità a condizioni ambientali avverse e nutrienti vari, la cultura di laboratorio relativamente sempl...

Prodotto da Loredana Manfra dell&#39;Istituto per la tutela dell&#39;ambiente e della ricerca (ISPRA-Dipartimento di controllo della qualità ambientale) e Federica Savorelli dell&#39;Agenzia Regionale per la Protezione dell&#39;Ambiente (Emilia-Romagna, Italia). I membri di riferimento per il sub-gruppo di lavoro il crostaceo Artemia all&#39;interno del gruppo biologico Metodi - Saltwater / acque salmastre e sedimenti della Commissione UNICHIM sulla qualità delle acque (l&#39;istituto per il funzionamento delle norme tecniche nel settore chimico). Videografia e l&#39;editing di Marco Pisapia di ISPRA (Scientific Advisory e servizi di documentazione). Coordinamento della produzione di Anna Maria Cicero e Erika Magaletti di ISPRA (Dipartimento di controllo della qualità ambientale). Vorremmo ringraziare l&#39;Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale della Regione Emilia-Romagna, Filiale di Ferrara e la BiologiCal Metodi Group - Saltwater / acqua salmastra e sedimenti della Commissione UNICHIM sulla qualità dell&#39;acqua per la loro collaborazione, Rossella Boscolo e Massimo Gabellini di ISPRA (Dipartimento di Prevenzione e mitigazione degli impatti) per il loro sostegno finanziario, e la London School of Languages ​​di Roma per il loro supporto linguistico. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Codice prodotto </td></tr><tr><td> Sodio dodecil solfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4390 </td></tr></tbody></table> Appendice Il algale supporto deve essere preparato utilizzando reagenti di qualità analitica. Un litro di soluzione nutritiva viene preparata sciogliendo 300 g di NaNO 3, 30 g di KH 2 PO 4 g e 20 di NH 4 Cl in acqua distillata. Quattro soluzioni iniziali (A, B, C, D) Di minerali vengono preparati come segue: <ul><li> Un litro di soluzione &quot;A&quot; contenente 30 g di ZnSO 4 H 2 O, 25 g di CuSO 4 5 H 2 O, 30 g di CoSO 4 7 H 2 O e 20 g di MnSO 4 H 2 O in acqua distillata; </li><li> Un litro di soluzione &quot;B&quot; contenente 50 g di FeCl 3 • 6 H 2 O in acqua distillata; </li><li> Un litro di soluzione &quot;C&quot; contenente 25 g di Na 2 MoO 4 • 2 H 2 O in acqua distillata; </li><li> Un litro di soluzione &quot;D&quot; contenente 50 g di Na 2 EDTA • 2 H 2 O in acqua distillata. </li></ul> Un litro di una soluzione finale di minerali (soluzione &quot;E&quot;) è ottenuta aggiungendo aliquote delle suddette soluzioni in acqua distillata. La seguente ordine di aggiunta si raccomanda: 100 ml di soluzione &quot;D&quot;, 10 ml di soluzione &quot;C&quot;, 10 ml di soluzione &quot;B&quot; e 10 ml di soluzione &quot;A&quot;. Tre iniziativesoluzioni L (F, G, H), di vitamine vengono preparati come segue: <ul><li> Un litro di soluzione &quot;F&quot; contenente 100 mg di biotina in acqua distillata; </li><li> Un litro di soluzione &quot;G&quot; contenente 10 g di tiamina in acqua distillata; </li><li> Un litro di soluzione &quot;H&quot; contenente 100 mg di cobalamina in acqua distillata. </li></ul> Un litro di una soluzione finale di vitamine (soluzione &quot;I&quot;) ottenuto aggiungendo 10 ml delle tre soluzioni iniziali di acqua distillata. Un litro di alghe supporto viene preparata sciogliendo 1 ml della soluzione nutritiva, 1 ml della soluzione finale minerale (soluzione &quot;E&quot;) e 1 ml della soluzione di vitamina finale (soluzione &quot;I&quot;) in acqua di mare. Quest&#39;ultimo può essere ottenuta sciogliendo riconosciuti reagenti di qualità analitica o una formulazione disponibile in commercio in acqua distillata o deionizzata. Miscele di sale per creare l&#39;acqua salata ideale sono commercialmente disponibili, ad esempio le miscele Ocean istantanea. Si tratta di raccomandazioniDed l&#39;utilizzo di acqua di mare con salinità di 30 (± 2) PSU e temperatura di 20 (± 1) ° C.

long-term lethal toxicity test with the crustacean artemia franciscana

Le nostre attività di ricerca incentrato sull&#39;uso di metodi biologici per la valutazione della qualità ambientale, con particolare riferimento ad acqua salata / acqua salmastra e sedimenti. La scelta degli indicatori biologici deve basarsi su conoscenze scientifiche affidabili e, eventualmente, la disponibilità di procedure standardizzate. In questo articolo, vi presentiamo un protocollo standardizzato che ha utilizzato il crostaceo marino Artemia per valutare la tossicità delle sostanze chimiche e / o di matrici ambientali marine. Gli scienziati propongono che l&#39;artemia (Artemia) è un candidato idoneo per lo sviluppo di un saggio biologico standard per l&#39;utilizzo in tutto il mondo. Un certo numero di lavori sono stati pubblicati sugli effetti tossici di varie sostanze chimiche e sostanze tossiche sul artemia (Artemia). Il vantaggio principale di questo crostaceo per gli studi di tossicità è la disponibilità complessiva delle cisti secchi, questi possono essere immediatamente utilizzato nei test e la coltivazione difficile non è richiesto <sup&gt; 1,2. Cisti basati su test di tossicità sono a buon mercato, sempre disponibile, semplice e affidabile e sono quindi una risposta importante alle esigenze di routine lo screening di tossicità, per esigenze di controllo industriali o per motivi di regolamentazione 3. Il metodo proposto prevede la mortalità un endpoint. I numeri dei sopravvissuti sono stati contati e la percentuale di decessi sono stati calcolati. Le larve sono stati considerati morti se non ha evidenziato alcun movimento interno o esterno durante alcuni secondi di osservazione 4. Questa procedura è stata test standardizzati una sostanza di riferimento (sodio dodecil solfato); alcuni risultati sono riportati in questo lavoro. In questo articolo si accompagna un video che descrive le prestazioni delle prove di tossicità procedurale, mostrando tutti i passaggi relativi al protocollo.

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Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Questo studio riguarda lo sviluppo e la standardizzazione di un protocollo valido strumento metodologico per determinare a lungo termine (14 giorni) tossicità letale esercitata da sostanze chimiche, delle acque reflue industriali o acque di scarico e liquidi campioni ambientali sul crostaceo d&#39;acqua salata,<em&gt; Artemia franciscana</em&gt;.

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

long-term-lethal-toxicity-test-with-the-crustacean-artemia-franciscana

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

19.4K Views.  Institute for Environmental Protection and Research. Questo studio riguarda lo sviluppo e la standardizzazione di un protocollo valido strumento metodologico per determinare a lungo termine (14 giorni) tossicità letale esercitata da sostanze chimiche, delle acque reflue industriali o acque di scarico e liquidi campioni ambientali sul crostaceo d'acqua salata, Artemia franciscana.

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

Ricerca

Biologia

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

A lungo termine Cultura di campioni umani cancro al seno e la loro analisi utilizzando la tomografia ottica di proiezione

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, un metodo per montare la larva della Drosophila per l'imaging time-Lapse a lungo termine

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

Isolamento, trasfezione e cultura a lungo termine di cardiomiociti per topi e ratti adulti

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Applicazione del movimento passivo della testa per generare accelerazioni definite alle teste dei roditori

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled environments enables an enriched comprehension of their biology that can contribute to applied research. This practice is usually employed in population control studies of species that cause economic loss, such as Atta ants. To cultivate their mutualistic fungus, these leaf-cutting ants collect leaves and for this are considered agricultural pests widely distributed throughout the American continent. They are highly socially organized and inhabit elaborated underground nests composed of a variety of chambers. Their maintenance in a controlled environment depends on a daily routine of several procedures and frequent care that are described here. It starts with the collection of queens during the reproductive season (i.e., nuptial flight), which are then individually transferred to plastic containers. Due to the high mortality rate of queens, a second collection can be carried out about 6 months after the nuptial flight, when incipient nests with developed fungus wad are excavated, hand-picked, and placed in plastic containers. In the laboratory, leaves are daily provided to established colonies, and ant-produced waste is weekly removed along with remaining dry plant material. As the fungus garden keeps growing, colonies are transferred to different types of containers according to the experimental purpose. Leaf-cutting ant colonies are placed in interconnected containers, representing the organizational system with functional chambers built by those insects in nature. This setup is ideal to monitor factors such as waste amount, fungus garden health, and the behavior of workers and queen. Facilitated data collection and more detailed observations are considered the greatest advantage of keeping ant colonies in controlled conditions.

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants Atta in Laboratory Conditions

Here, a protocol is described to successfully collect and maintain healthy Atta (Hymenoptera: Formicidae) ant colonies in laboratory conditions. Additionally, different nest types and configurations are detailed together with possible experimental procedures.

Raccolta e mantenimento a lungo termine delle formiche tagliafoglie (Atta) in condizioni di laboratorio

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Coltura a lungo termine di singoli Caenorhabditis elegans su terreni solidi per il monitoraggio longitudinale della fluorescenza e interventi avversivi

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, rapid reproduction cycle (~3 days), short lifespan (~3 weeks), and numerous available tools for genetic manipulation and molecular analysis. The most common approach for conducting aging studies in C. elegans, including survival analysis, involves culturing populations of tens to hundreds of animals together on solid nematode growth media (NGM) in Petri plates. While this approach gathers data on a population of animals, most protocols do not track individual animals over time. Presented here is an optimized protocol for the long-term culturing of individual animals on microfabricated polydimethylsiloxane (PDMS) devices called WorMotels. Each device allows up to 240 animals to be cultured in small wells containing NGM, with each well isolated by a copper sulfate-containing moat that prevents the animals from fleeing. Building on the original WorMotel description, this paper provides a detailed protocol for molding, preparing, and populating each device, with descriptions of common technical complications and advice for troubleshooting. Within this protocol are techniques for the consistent loading of small-volume NGM, the consistent drying of both the NGM and bacterial food, options for delivering pharmacological interventions, instructions for and practical limitations to reusing PDMS devices, and tips for minimizing desiccation, even in low-humidity environments. This technique allows the longitudinal monitoring of various physiological parameters, including stimulated activity, unstimulated activity, body size, movement geometry, healthspan, and survival, in an environment similar to the standard technique for group culture on solid media in Petri plates. This method is compatible with high-throughput data collection when used in conjunction with automated microscopy and analysis software. Finally, the limitations of this technique are discussed, as well as a comparison of this approach to a recently developed method that uses microtrays to culture isolated nematodes on solid media.

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Presented here is an optimized protocol for culturing isolated individual nematodes on solid media in microfabricated multi-well devices. This approach allows individual animals to be monitored throughout their lives for a variety of phenotypes related to aging and health, including activity, body size and shape, movement geometry, and survival.

Coltura a lungo termine e monitoraggio di Caenorhabditis elegans isolati su terreni solidi in dispositivi multi-pozzetto

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...