Prodotto da Loredana Manfra dell&#39;Istituto per la tutela dell&#39;ambiente e della ricerca (ISPRA-Dipartimento di controllo della qualità ambientale) e Federica Savorelli dell&#39;Agenzia Regionale per la Protezione dell&#39;Ambiente (Emilia-Romagna, Italia). I membri di riferimento per il sub-gruppo di lavoro il crostaceo Artemia all&#39;interno del gruppo biologico Metodi - Saltwater / acque salmastre e sedimenti della Commissione UNICHIM sulla qualità delle acque (l&#39;istituto per il funzionamento delle norme tecniche nel settore chimico). Videografia e l&#39;editing di Marco Pisapia di ISPRA (Unità Web). Coordinamento della produzione di Anna Maria Cicero e Erika Magaletti di ISPRA (Dipartimento di controllo della qualità ambientale). Vorremmo ringraziare l&#39;Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale della Regione Emilia-Romagna, Filiale di Ferrara, il Gruppo biologica Metodi - Saltwater / SalmastroAcqua e sedimenti della Commissione UNICHIM sulla qualità dell&#39;acqua e Luciana Migliore, Università di Tor Vergata (Roma) per la loro cooperazione; Rossella Boscolo e Massimo Gabellini di ISPRA (Dipartimento di Prevenzione e mitigazione degli impatti) per il loro sostegno finanziario, Fabio Matassa e il London Scuola di Lingue a Roma per il loro supporto linguistico.

1. Metodo Standard Il test consiste nel sottoporre larve Artemia ad un intervallo di concentrazioni della sostanza o di un campione di prova per determinare i livelli di concentrazione o diluizione che potrebbero causare la morte del 50% degli organismi (LC 50) esposto per 14 giorni e di soddisfare le condizioni definite con questo metodo. Se necessario e possibile, possono anche essere determinato: a) il livello di concentrazione che provoca la morte del 20% degli organismi esposti (LC 20), b) il più alto livello di concentrazione analizzato che non determina un tasso di mortalità più elevato di quello dei il controllo negativo (NOEC), il livello più basso concentrazione saggiata che determina, dopo 14 giorni, un tasso di mortalità più elevato di quello del controllo negativo (LOEC). 2. Prova dei materiali 2.1 uova di Artemia Per eseguire il test, Artemia franciscana </emLarve&gt; meno di 48 ore di vita (nauplii) sono obbligatori, in stadio II o III, ottenuti da uova appena schiusi 5. Uova o cisti certificati utilizzati per supportare il testing sono disponibili in commercio, ad esempio, della divisione Research Quality Assurance, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, USA o dal Laboratorio per la ricerca biologica in fenomeni di inquinamento acquatico, Università di Ghent, in Belgio. 2,2 di acqua di diluizione Salata sintetica può essere utilizzata come acqua di diluizione, preparata sciogliendo riconosciuti reagenti di qualità analitica o una formulazione disponibile in commercio in acqua distillata o deionizzata. Miscele di sale per creare l&#39;acqua salata ideale sono commercialmente disponibili, ad esempio le miscele Ocean istantanea. Si raccomanda di acqua di diluizione con una salinità pari a 35 (± 2) PSU nonché una concentrazione di ossigeno disciolto superiore al 80% del valore di saturazione e una temperatura di 25 (± 2) egradi; C. Dopo aerazione per 48 ore e filtrazione in filtri con una porosità di almeno 0,45 um, la diluizione può essere conservato per un massimo di 30 giorni al buio a una temperatura di 0-4 ° C. 2,3 coltura di alghe Si raccomanda che gli organismi test sono si nutrono di microalghe Dunaliella tertiolecta, che crescono in modo esponenziale e di raggiungere densità di 1.3x10 6 - 2.0x10 6 cellule / ml. La sperimentazione su campioni ambientali richiede culture con densità superiori a 2.0x10 6 cellule / ml 6. Si suggerisce che Dunaliella tertiolecta cresce in un terreno di coltura contenente acqua di mare (30 (± 2) PSU e 20 (± 1) ° C) con l&#39;aggiunta di sostanze nutritive essenziali, minerali e vitamine. Alcune indicazioni sulla composizione delle alghe i media e la preparazione sono riportati in appendice. La densità cellulare iniziale è suggerito per essere circa 10 5 cellule / ml. La coltura di alghe è mantenuto in unotermostato ambiente a 20 (± 1) ° C, illuminato con lampade fluorescenti 3000 (± 300) lx, con un rapporto fotoperiodo di 16 ore di luce a 8 ore di oscurità. Altre specie fitoplanctoniche potrebbe anche essere utilizzato per l&#39;alimentazione ma sarebbe necessario effettuare studi comparativi con queste specie fitoplanctoniche per trovare i &quot;equivalente&quot; specie di Dunaliella tertiolecta, poiché le condizioni sperimentali (ad esempio densità cellulari iniziali, illuminazione luce, temperatura, composizione di terreni di coltura e tempo di esposizione) varia a seconda delle specie di fitoplancton. Oltre la tolleranza delle microalghe di inquinanti differenti deve essere considerata in quanto gli effetti inquinanti sulla crescita e lo sviluppo di impatto fitoplancton anche al Artemia. 2,4 Sostanza di riferimento La sostanza di riferimento in questo test è Dodecyl solfato di sodio. 2,5 di vetro per laboratorio <ol><li> Contenitori di prova di cui 100 ml bicchieri di vetro borosilicato (18 per eseguire test e 18 per il trasferimento di soluzioni). </li><li> Un pallone (ad esempio, beuta da 500 ml) per preparare la soluzione standard. </li><li> Sei palloni (ad esempio, 200 palloni da ml) per preparare le soluzioni di testing. </li><li> Vetro o polistirolo 5 cm di diametro piastre Petri con sfoderabile da utilizzare per attivare le cisti e trasferimento Artemia dal piatto schiusa ai contenitori di prova. </li><li> Pipette Pasteur di vetro (con le punte arrotondate alla fiamma) per trasferire il naupli. </li><li> Cannule di vetro o Pasteur 3 ml pipette di plastica monouso (da tagliare) per il trasferimento di Artemia. </li><li> Micropipette e pipette graduate per preparare le soluzioni di testing. </li><li> Sei cilindri graduati (per esempio 50 cilindri ml) per il trasferimento di soluzioni di test dai palloni a Tegli prova contenitori. </li></ol> 3. Cisti di attivazione 3,1. Piastre Petri contenenti cisti + versare acqua Per generare organismi di prova, 20 mg di cisti sono posti in una capsula Petri contenente 12 ml di acqua di diluizione 48 ore prima della prova. 3.2. L&#39;incubazione nella luce e nel buio Il piatto Petri viene mantenuta a 25 (± 2) ° C e ad una 4000 (± 1000) lux (lumen per metro quadrato) l&#39;intensità della luce per un&#39;ora. 3,3. Sostituzione del mezzo con il microscopio Dopo 24 ore, le larve schiusa sono trasferiti in una piastra Petri nuovo riempita con acqua artificiale. Il trasferimento viene eseguita utilizzando il microscopio, cioè utilizzando una sorgente luminosa in modo che l&#39;, larve cova fototropico migrano verso il fascio di luce. Un bicchiere pipetta Pasteur è usato per fare il trasferimento, assicurando che solo il nascente larve are trasferito e non le cisti o le larve ancora in membrane. 3,4. L&#39;incubazione al buio Il piatto contenente le larve è posto in una camera termostatica buio per 24 ore a 25 (± 2) ° C. 4. Preparazione delle soluzioni di prova 4,1. Pesatura della sostanza + trasferire nel pallone Si raccomanda che la soluzione standard per la sostanza di prova viene preparata sciogliendo 0,5 g della sostanza in un pallone da 500 ml. Il pallone viene riempito con acqua deionizzata o distillata e la soluzione viene agitata fino a quando la sostanza di prova è completamente sciolto. Soluzioni devono essere preparate al momento dell&#39;uso a meno che non è noto se la sostanza è stabile in soluzione. In tal caso, la soluzione standard può essere preparata fino a due giorni prima del test. 4,2. Preparazione del controllo negativo, l&#39;aggiunta di acqua di diluizione e alghe wisecolo la pipetta da 10 ml Il controllo negativo viene preparata in un pallone (esempio 200 ml) aggiungendo una aliquota della sospensione algale per l&#39;acqua di diluizione in modo che una densità di 10 5 cellule / ml viene ottenuta. 4,3. Preparare le soluzioni di test: l&#39;aggiunta di acqua di diluizione, alghe e soluzione standard Si suggerisce che le soluzioni di prova sono preparati in cinque matracci tarati da 200 aggiungendo la soluzione standard per l&#39;acqua di diluizione nelle quantità specificate in modo che le concentrazioni desiderate per il test si ottiene. Per alimentare gli organismi, aliquote di una sospensione Dunaliella microalghe tertiolecta possono essere utilizzati e aggiunto a raggiungere una densità di 10 5 cellule / ml quando soluzioni di prova sono preparati. Il seguente ordine di aggiunta è consigliato: acqua di diluizione, la sospensione delle alghe e la soluzione standard. Dopo la preparazione di soluzioni di test, essi devono essere utilizzati nel test appena possibile. 4,4. Trasferimento di soluzioni dal pallone ai contenitori di prova, poi le piastre di Petri Quantità uguale (50 ml) delle soluzioni di prova sono introdotti nei contenitori di test che utilizza il cilindro graduato. Tre repliche per ciascuna concentrazione sono fatti. Per ciascuna serie di test, un contenitore di controllo viene preparato con una quantità di acqua di diluizione pari al volume delle soluzioni di prova. Volumi uguali (circa 12 ml) delle soluzioni di prova vengono introdotti nelle piastre di Petri. Per ogni serie di test, un piatto di controllo Petri viene utilizzato. 5. Preparazione per le prove 5,1. Nauplii al II-III stadio Quarantotto ore dopo l&#39;attivazione cisti, i naupli raggiungere il II-III stadio larvale e sono quindi utilizzabili per i test. 5,2. Trasferimento nauplii nelle piastre di Petri con il microscopio Il piatto Petri utilizzato per cisti<html> attivazione è preso dalla camera termostatica. Una piccola quantità di larve vengono trasferite in piastre di Petri contenenti il ​​controllo e le soluzioni di test. Questo compito deve essere eseguito con il microscopio utilizzando una pipetta di diametro sufficientemente ampia in modo che i microrganismi non vengono danneggiati. In questa fase del test, il trasferimento può essere eseguito con una pipetta Pasteur vetro (con punta arrotondata di fiamma) e una sorgente di luce posizionati lateralmente che incoraggia il Artemia ad aggregarsi. 5,3. Trasferimento nauplii dalle piastre di Petri nei contenitori di prova con il microscopio Dieci larve vengono trasferiti dalle soluzioni di prova Petri per i contenitori di prova. Anche questa operazione deve essere effettuata utilizzando la pipetta Pasteur e microscopio. Si raccomanda che un volume non superiore a 1 mL viene trasferito nel passaggio di larve non influenzare il volume complessivo del sistema di test. e_step &quot;&gt; 5.4. contenitori pieni coperto con parafilm I bicchieri di prova sono coperti con parafilm (lasciando uno spazio per il passaggio dell&#39;aria), e mantenuta ad una temperatura di 25 (± 2) ° C per tutta la durata della prova e ad una illuminazione di 900 (± 100) lx con un fotoperiodo rapporto di 14 ore di luce a 10 ore di oscurità. 6. Sostituzione del Supplemento Media and Food 6,1. Tasso di sopravvivenza di controllo Due giorni dopo il test è stato avviato, e poi, dopo giorni 5, 7, 9 e 12, l&#39;Artemia è osservato al microscopio per verificare il tasso di sopravvivenza e di sostituire il mezzo e l&#39;integratore alimentare. Numero di organismi viventi viene contato in ogni contenitore test. Dopo l&#39;osservazione al microscopio e lieve stimolazione meccanica (ad esempio toccando le larve con una pipetta Pasteur di vetro), organismi che non mostrano un certo movimento per circa 10 seconds dovrebbe essere considerato morto. 6,2. Preparazione di una soluzione di prova mostra campionamento alghe con una pipetta 10 ml e campionamento della sostanza da testare con una micropipetta. Trasferimento di soluzioni dal pallone ai contenitori di test Durante il test, le soluzioni di prova devono essere sostituiti periodicamente, e preparata nello stesso giorno in cui devono essere utilizzati. Le soluzioni di prova sono realizzati dalla soluzione standard precedentemente preparata. 6,3. Artemia trasferimento, utilizzando un taglio pipetta Pasteur, dai contenitori di prova vecchi ai tre nuovi contenitori Il trasferimento di Artemia viene eseguito usando una pipetta con un diametro sufficientemente ampio in modo da non danneggiare gli organismi. Durante questa fase, uno ml 3 plastica pipetta Pasteur (da tagliare) possono essere utilizzati. 6,4. Le larve in un bicchiere contenente sia vivo o morto Artemia Dopo 1<html> 4 giorni di esposizione alla fine del test, il numero di sopravvissuti larve viene contato e registrato sul foglio. LC 50 e / o LC 20, NOEC e LOEC a 14 giorni, sono calcolati e registrati, così come i limiti di confidenza al 95% in cui i metodi appropriati, e di calcolo. 7. Risultati rappresentativi Alla fine della prova (14 giorni), calcolare la percentuale di mortalità per ciascuna concentrazione, secondo la formula seguente: (M s / N) * 100 Dove: M s è il numero medio di individui morti nel campione analizzato N è il numero totale di individui esposti La tabella 1 riporta un esempio di dati di test (14d) con Artemia esposto sodio dodecil solfato. <table border="1"><tbody><tr><td> Concentrazioni (mg / l) </td>&quot;&gt; Numero di persone sono morte in ogni replica </td><td> Mortalità (%) </td></tr><tr><td></td><td> Io </td><td> II </td><td> III </td><td></td></tr><tr><td> Controllo negativo </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1,56 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3,12 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> 6,25 </td><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 12,5 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 25,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 50,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Inoltre, determinareLC 50 valore di una trama grafica gaussiana logaritmica o con metodi statistici appropriati (per esempio Spearman-Karber o di un metodo Probit). Il calcolo di LC 50 per i dati di tabella 1 è 8,18 (7,15-9,37) mg / l. Se la concentrazione massima causavano una mortalità inferiore del 50%, non si deve procedere al calcolo del valore 50 LC che sarebbe quindi inaffidabili o addirittura non calcolabile. In questo caso, tuttavia, sarebbe opportuno ripetere il test estendendo la gamma di concentrazioni testate. In alternativa, il valore LC 50 è più correttamente espressa come superiore alla concentrazione più elevata, che potrebbe indicare la percentuale di mortalità a concentrazione più elevata e la concentrazione massima corrispondente ad un nessun effetto. I risultati sono considerate valide se alla fine del test le seguenti condizioni sono state soddisfatte: <ol class="lalpha"><li> del controllo tasso di mortalità medioè ≤ 20%; </li><li> dove con sodio dodecil solfato, il LC 50 a 14 giorni è incluso nel 8,0 (± 5) mg / l intervallo. </li></ol> Se le condizioni di cui sopra non sono state rispettate, tutti i dati ottenuti con lo stesso lotto di organismi dovrebbero essere considerati non validi e prove ripetute.

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	<li>Togulga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Short-Term+Toxicity+of+Two+Toxicants+to+Artemia+Nauplii.">The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii.</a> Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).</li><li>Persoone, G., Wells, P. G., Sorgeloos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artemia+in+aquatic+toxicology:+a+review.">Artemia in aquatic toxicology: a review.</a> Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. , 259-275 (1987).</li><li>Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+genus+Artemia+in+ecotoxicity+testing.">Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing.</a> Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).</li><li>APAT IRSA-CNR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).</li><li>Sorgellos, P., Wielen, C. R. e. m. i. c. h. e. -. V. a. n. D. e. r., Persoone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Artemia+nauplii+for+toxicity+tests+â€“+a+critical+analysis.">The use of Artemia nauplii for toxicity tests â€“ a critical analysis.</a> Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).</li><li>Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Set+up+of+a+standard+methodology+for+14-day+bioassay+on+Artemia+franciscana+and+A.+parthenogenetica.">Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica.</a> Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).</li><li>Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+toxicity+of+arsenic+to+the+Great+Salt+Lake+brine+shrimp,+Artemia+franciscana.">Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana.</a> Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).</li><li>Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+a+chronic+site-specific+water+quality+standard+for+selenium+in+the+Great+Salt+Lake,+Utah,+USA.">Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA.</a> Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualit&#225;+dell'acqua+-+Determinazione+della+tossicit&#225;+letale+a+14+giorni+con+Artemia+franciscana+(Crustacea:+Anostraca).">Qualit&#225; dell'acqua - Determinazione della tossicit&#225; letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca).</a> Commissione UNICHIM "Qualit&#225; dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , (2010).</li><li>Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cholinesterases+and+evaluation+of+the+inhibitory+potential+of+chlorpyrifos+and+dichlorvos+to+Artemia+salina+and+Artemia+parthenogenetica.">Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica.</a> Chem. 48, 563-569 (2002).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Artemia è uno dei più importanti organismi di prova disponibili per i test di ecotossicità e di ricerca fatto finora ci consente di affermare che è possibile sostenere diverse opzioni connessi al consumo di Artemia in Tossicologia ed Ecotossicologia. Le caratteristiche che trasformano questo organismo in una specie adatti per saggi biologici sono: una vasta distribuzione geografica, elevata adattabilità a condizioni ambientali avverse e nutrienti vari, la cultura di laboratorio relativamente sempl...

Prodotto da Loredana Manfra dell&#39;Istituto per la tutela dell&#39;ambiente e della ricerca (ISPRA-Dipartimento di controllo della qualità ambientale) e Federica Savorelli dell&#39;Agenzia Regionale per la Protezione dell&#39;Ambiente (Emilia-Romagna, Italia). I membri di riferimento per il sub-gruppo di lavoro il crostaceo Artemia all&#39;interno del gruppo biologico Metodi - Saltwater / acque salmastre e sedimenti della Commissione UNICHIM sulla qualità delle acque (l&#39;istituto per il funzionamento delle norme tecniche nel settore chimico). Videografia e l&#39;editing di Marco Pisapia di ISPRA (Scientific Advisory e servizi di documentazione). Coordinamento della produzione di Anna Maria Cicero e Erika Magaletti di ISPRA (Dipartimento di controllo della qualità ambientale). Vorremmo ringraziare l&#39;Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale della Regione Emilia-Romagna, Filiale di Ferrara e la BiologiCal Metodi Group - Saltwater / acqua salmastra e sedimenti della Commissione UNICHIM sulla qualità dell&#39;acqua per la loro collaborazione, Rossella Boscolo e Massimo Gabellini di ISPRA (Dipartimento di Prevenzione e mitigazione degli impatti) per il loro sostegno finanziario, e la London School of Languages ​​di Roma per il loro supporto linguistico. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Codice prodotto </td></tr><tr><td> Sodio dodecil solfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4390 </td></tr></tbody></table> Appendice Il algale supporto deve essere preparato utilizzando reagenti di qualità analitica. Un litro di soluzione nutritiva viene preparata sciogliendo 300 g di NaNO 3, 30 g di KH 2 PO 4 g e 20 di NH 4 Cl in acqua distillata. Quattro soluzioni iniziali (A, B, C, D) Di minerali vengono preparati come segue: <ul><li> Un litro di soluzione &quot;A&quot; contenente 30 g di ZnSO 4 H 2 O, 25 g di CuSO 4 5 H 2 O, 30 g di CoSO 4 7 H 2 O e 20 g di MnSO 4 H 2 O in acqua distillata; </li><li> Un litro di soluzione &quot;B&quot; contenente 50 g di FeCl 3 • 6 H 2 O in acqua distillata; </li><li> Un litro di soluzione &quot;C&quot; contenente 25 g di Na 2 MoO 4 • 2 H 2 O in acqua distillata; </li><li> Un litro di soluzione &quot;D&quot; contenente 50 g di Na 2 EDTA • 2 H 2 O in acqua distillata. </li></ul> Un litro di una soluzione finale di minerali (soluzione &quot;E&quot;) è ottenuta aggiungendo aliquote delle suddette soluzioni in acqua distillata. La seguente ordine di aggiunta si raccomanda: 100 ml di soluzione &quot;D&quot;, 10 ml di soluzione &quot;C&quot;, 10 ml di soluzione &quot;B&quot; e 10 ml di soluzione &quot;A&quot;. Tre iniziativesoluzioni L (F, G, H), di vitamine vengono preparati come segue: <ul><li> Un litro di soluzione &quot;F&quot; contenente 100 mg di biotina in acqua distillata; </li><li> Un litro di soluzione &quot;G&quot; contenente 10 g di tiamina in acqua distillata; </li><li> Un litro di soluzione &quot;H&quot; contenente 100 mg di cobalamina in acqua distillata. </li></ul> Un litro di una soluzione finale di vitamine (soluzione &quot;I&quot;) ottenuto aggiungendo 10 ml delle tre soluzioni iniziali di acqua distillata. Un litro di alghe supporto viene preparata sciogliendo 1 ml della soluzione nutritiva, 1 ml della soluzione finale minerale (soluzione &quot;E&quot;) e 1 ml della soluzione di vitamina finale (soluzione &quot;I&quot;) in acqua di mare. Quest&#39;ultimo può essere ottenuta sciogliendo riconosciuti reagenti di qualità analitica o una formulazione disponibile in commercio in acqua distillata o deionizzata. Miscele di sale per creare l&#39;acqua salata ideale sono commercialmente disponibili, ad esempio le miscele Ocean istantanea. Si tratta di raccomandazioniDed l&#39;utilizzo di acqua di mare con salinità di 30 (± 2) PSU e temperatura di 20 (± 1) ° C.

long-term lethal toxicity test with the crustacean artemia franciscana

Le nostre attività di ricerca incentrato sull&#39;uso di metodi biologici per la valutazione della qualità ambientale, con particolare riferimento ad acqua salata / acqua salmastra e sedimenti. La scelta degli indicatori biologici deve basarsi su conoscenze scientifiche affidabili e, eventualmente, la disponibilità di procedure standardizzate. In questo articolo, vi presentiamo un protocollo standardizzato che ha utilizzato il crostaceo marino Artemia per valutare la tossicità delle sostanze chimiche e / o di matrici ambientali marine. Gli scienziati propongono che l&#39;artemia (Artemia) è un candidato idoneo per lo sviluppo di un saggio biologico standard per l&#39;utilizzo in tutto il mondo. Un certo numero di lavori sono stati pubblicati sugli effetti tossici di varie sostanze chimiche e sostanze tossiche sul artemia (Artemia). Il vantaggio principale di questo crostaceo per gli studi di tossicità è la disponibilità complessiva delle cisti secchi, questi possono essere immediatamente utilizzato nei test e la coltivazione difficile non è richiesto <sup&gt; 1,2. Cisti basati su test di tossicità sono a buon mercato, sempre disponibile, semplice e affidabile e sono quindi una risposta importante alle esigenze di routine lo screening di tossicità, per esigenze di controllo industriali o per motivi di regolamentazione 3. Il metodo proposto prevede la mortalità un endpoint. I numeri dei sopravvissuti sono stati contati e la percentuale di decessi sono stati calcolati. Le larve sono stati considerati morti se non ha evidenziato alcun movimento interno o esterno durante alcuni secondi di osservazione 4. Questa procedura è stata test standardizzati una sostanza di riferimento (sodio dodecil solfato); alcuni risultati sono riportati in questo lavoro. In questo articolo si accompagna un video che descrive le prestazioni delle prove di tossicità procedurale, mostrando tutti i passaggi relativi al protocollo.

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Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Questo studio riguarda lo sviluppo e la standardizzazione di un protocollo valido strumento metodologico per determinare a lungo termine (14 giorni) tossicità letale esercitata da sostanze chimiche, delle acque reflue industriali o acque di scarico e liquidi campioni ambientali sul crostaceo d&#39;acqua salata,<em&gt; Artemia franciscana</em&gt;.

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

19.5K Views.  Institute for Environmental Protection and Research. Questo studio riguarda lo sviluppo e la standardizzazione di un protocollo valido strumento metodologico per determinare a lungo termine (14 giorni) tossicità letale esercitata da sostanze chimiche, delle acque reflue industriali o acque di scarico e liquidi campioni ambientali sul crostaceo d'acqua salata, Artemia franciscana.

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

Ricerca

Biologia

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

A lungo termine Cultura di campioni umani cancro al seno e la loro analisi utilizzando la tomografia ottica di proiezione

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

Arricchimento di serie staminali spermatogoni e cellule progenitrici (SSC) in Cultura per la derivazione di lungo termine Lines topo adulto SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a promising model organism for laboratory studies of development, providing a useful outgroup comparison to the well studied arthropod model organism Drosophila melanogaster. In contrast to the syncytial cleavages of Drosophila, the early cleavages of Parhyale are holoblastic. Fate mapping using tracer dyes injected into early blastomeres have shown that all three germ layers and the germ line are established by the eight-cell stage. At this stage, three blastomeres are fated to give rise to the ectoderm, three are fated to give rise to the mesoderm, and the remaining two blastomeres are the precursors of the endoderm and germ line respectively. However, blastomere ablation experiments have shown that Parhyale embryos also possess significant regulatory capabilities, such that the fates of blastomeres ablated at the eight-cell stage can be taken over by the descendants of some of the remaining blastomeres. Blastomere ablation has previously been described by one of two methods: injection and subsequent activation of phototoxic dyes or manual ablation. However, photoablation kills blastomeres but does not remove the dead cell body from the embryo. Complete physical removal of specific blastomeres may therefore be a preferred method of ablation for some applications. Here we present a protocol for manual removal of single blastomeres from the eight-cell stage of Parhyale embryos, illustrating the instruments and manual procedures necessary for complete removal of the cell body while keeping the remaining blastomeres alive and intact. This protocol can be applied to any Parhyale cell at the eight-cell stage, or to blastomeres of other early cleavage stages. In addition, in principle this protocol could be applicable to early cleavage stage embryos of other holoblastically cleaving marine invertebrates.

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

The amphipod Parhyale hawaiensis is a promising model organism for studies of crustacean embryology and comparative arthropod development and evolution. This protocol describes a method for manual removal of single blastomeres from early cleavage stage embryos of Parhyale.

Ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, un metodo per montare la larva della Drosophila per l'imaging time-Lapse a lungo termine

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

Isolamento, trasfezione e cultura a lungo termine di cardiomiociti per topi e ratti adulti

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Applicazione del movimento passivo della testa per generare accelerazioni definite alle teste dei roditori

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled environments enables an enriched comprehension of their biology that can contribute to applied research. This practice is usually employed in population control studies of species that cause economic loss, such as Atta ants. To cultivate their mutualistic fungus, these leaf-cutting ants collect leaves and for this are considered agricultural pests widely distributed throughout the American continent. They are highly socially organized and inhabit elaborated underground nests composed of a variety of chambers. Their maintenance in a controlled environment depends on a daily routine of several procedures and frequent care that are described here. It starts with the collection of queens during the reproductive season (i.e., nuptial flight), which are then individually transferred to plastic containers. Due to the high mortality rate of queens, a second collection can be carried out about 6 months after the nuptial flight, when incipient nests with developed fungus wad are excavated, hand-picked, and placed in plastic containers. In the laboratory, leaves are daily provided to established colonies, and ant-produced waste is weekly removed along with remaining dry plant material. As the fungus garden keeps growing, colonies are transferred to different types of containers according to the experimental purpose. Leaf-cutting ant colonies are placed in interconnected containers, representing the organizational system with functional chambers built by those insects in nature. This setup is ideal to monitor factors such as waste amount, fungus garden health, and the behavior of workers and queen. Facilitated data collection and more detailed observations are considered the greatest advantage of keeping ant colonies in controlled conditions.

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants Atta in Laboratory Conditions

Here, a protocol is described to successfully collect and maintain healthy Atta (Hymenoptera: Formicidae) ant colonies in laboratory conditions. Additionally, different nest types and configurations are detailed together with possible experimental procedures.

Raccolta e mantenimento a lungo termine delle formiche tagliafoglie (Atta) in condizioni di laboratorio

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled ...

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana

Riepilogo

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