<ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Preparazione di lesione fantasma (phantom preparare circa 38 a 48 ore prima della effettiva sessione pratica di competenza FNA (Figura 1) o utilizzare pronta per l&#39;uso &#39;AV Phantom&#39; da sorgenti FNA, USA. La lesione fantasma (conservati in frigorifero senza congelamento) può essere tenuti pronti anche 3 o 4 giorni prima della sessione di pratica. </li><li> Praticare FNA competenza: Anche se abbiamo dimostrato la procedura utilizzando Shidham di THFV (Tissue semoventi con valvola funzionale) (Fonte FNA, USA), qualsiasi altro sistema FNA può essere utilizzato per la pratica (Figura 2). </li><li> Diffusione e l&#39;elaborazione dei aspirare nelle diapositive di vetro (Figura 3). </li></ol> Materiale richiesto <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Chiaro gomma siliconica caulk-disponibile in molte costruzioni / home negozi di miglioramento. Molte marche sono disponibili includendo GETM, DAP, Red Devil, White Lightning, e dei marchi catena locale. Abbiamo usato in gomma di silicone trasparente, Prodotti White Lightning, Cleveland, Ohio, USA, <a href="http://www.wlcaulk.com/products/all_purpose/silicone_rubber/wl09010.html">http://www.wlcaulk.com/products/all_purpose/silicone_rubber/wl09010.html</a> ) </li><li> Pistola per silicone </li><li> Un pezzo di foglio di pellicola trasparente (abbiamo usato Saran Wrap Cling Inoltre, SC Johnson &amp; Son Inc, Racine, WI, USA <a href="http://www.saranbrands.com/plastic-wrap/index.asp">http://www.saranbrands.com/plastic-wrap/index.asp</a> </li><li> Guanti in lattice </li><li> Diametro di banane largo o salsiccia. </li><li> Fermo e piatto piastra di base (circa 6 pollici x 6 pollici), fatto di cartone spesso, piatto in acrilico, o altro. </li><li> FNA eseguire attrezzature <ul><li> 25 gauge aghi ipodermici </li><li> Shidham di THFV (o di altri componenti per l&#39;esecuzione di FNA) </li><li> vetrini </li><li> colorazione kit </li></ul></li></ol> Passo-passo i dettagli A. Preparazione della lesione fantasma (phantom preparare 1 a 2 giorni prima di praticare FNA competenza (Figura 2) o utilizzare pronta per l&#39;uso &#39;AV Phantom&#39; da sorgenti FNA, USA. <ol><li> Tagliare una X 6 6 in pollici di sostenere bordo. </li><li> Tagliare un segmento da 2,5 pollici lunga serie di &#39;core lesione fantasma&#39; (banana o salsiccia). </li><li> Espellere 0,5 cm di spessore di strato calafatare sulla piastra di base. </li><li> Premere il &#39;fantasma lesione core&#39; leggermente in questo strato di calafatare. </li><li> Aggiungere più calafatare il &#39;core lesione fantasma&#39; in modo che sia completamente incorporato nel tumulo di caulk, senza intrappolare bolle d&#39;aria. </li><li> Regolare e modellare il calafatare sul &#39;core lesione fantasma&#39; con mano guantata. </li><li> Prendete un pezzo X 6 6 pollici formato di pellicola trasparente e coprire il tumulo calafatare e regolare la superficie della collina in una configurazione uniforme convessa con un pulito, mano guantata. </li><li> Lasciate la cura tumulo calafatare per 6-8 ore in più rispetto al tempo di maturazione di cui al punto le istruzioni del prodotto, (di solito per 24 ore), in luogo caldo. </li><li> Dopo la polimerizzazione, il calafatare dovrebbe essere ferma, e l&#39;involucro di plastica può essere staccata facilmente. </li><li> La lesione FNA fantasma è pronto per essere usato per praticare la procedura di FNA dopo circa 8 ore in cui il cumulo intera caulk ha completamente curato con il centro che contiene il &#39;core lesione fantasma&#39; (banana o salsiccia). </li></ol> B. Praticare FNA competenza sulla lesione AV Phantom. Qualsiasi approccio per ottenere alta qualità, adeguata aspirati FNA con una buona qualità prelievi citologici diretto dovrebbe affrontare i seguenti punti critici- <ol style="list-style-type:upper-roman;"><li> L&#39;indicatore, come l&#39;ago implicita nel titolo della procedura, gli aghi più sottili (numero di diametro superiore) resa migliore aspirati con la diluizione del sangue minimi. Per l&#39;equilibrio critico di vantaggi e limitazioni, dal 22 al 25 aghi calibro sono da preferire per la stabilità meccanica ottimale dell&#39;ago senza compromettere la qualità aspirare FNA. </li><li> Controllo sequenze appropriate in applicazione del vuoto e rilasciare nel corso della procedura di FNA-Questo è fondamentale per far progredire le cellule campionate con ogni colpo di spillo, verso il mozzo ago. Tuttavia, il materiale aspirato non dovrebbe essere consentito di giungere nella zona del gruppo ago aspirazione con siringa. Se questo non è impedito, il materiale può essere difficile da recuperare per fare strisci (questo materiale può tuttavia essere utilizzato per la preparazione cell block o per metodi di concentrazione come Cytospin, i metodi di filtro, o di recente preparati liquidi citologia). </li><li> Lo sviluppo di competenze appropriate nel trattamento del campione aspirato, compresa la preparazione striscio diretta e on-site valutazione di adeguatezza con triaging appropriato per le prove di accessori quali celle blocco preparazione immunocitochimica elettiva, citometria a flusso elettivo per immunofenotipizzazione delle lesioni linfoproliferative, presentando passa sterile per microbiologia studi, e compagnoriale per i test molecolari (citogenetica, ecc.) </li></ol> Ba Esecuzione di procedura FNA (indicato con THFV Shidham [1] (Fonte FNA, USA), ma qualsiasi altro sistema FNA può essere utilizzato per la pratica). (Fig. 3,4,5). <ol><li> Preparare l&#39;assemblea FNA con la valvola chiusa. </li><li> Localizzare la lesione e inserire la punta dell&#39;ago nella lesione. </li><li> Aprire la valvola per collegare il vuoto, attraverso l&#39;ago alla sua punta, per aspirare rappresentante componenti cellulari della lesione con ogni corsa avanti e indietro nella lesione. </li><li> Mantenere le aree vuoto e campione diverse della lesione inserendo l&#39;ago nella lesione in diverse direzioni. </li><li> Chiudere la valvola di scollegare il vuoto nel lume ago. </li><li> Equilibrare la pressione con condizioni ambientali (per esempio scollegando il siringa valvole da l&#39;ago per un breve istante e ricollegare. Se il dispositivo speciale con passi integrato, come &#39;THFV&#39; è utilizzato, questo e altri passi da Ba1 attraverso BA6 sono concertati automaticamente seguendo diverse fasi del sistema di valvole) [1]. </li><li> Rimuovere l&#39;ago dalla lesione con la valvola chiusa, al fine di prevenire la perdita del campione per capillarità nella lesione meno che ci sia pressione leggermente negativa al termine hub. </li><li> Rimuovere il contenuto aspirato sul vetrino per preparare striscio diretto (vedi sotto) (figura 6). </li></ol> Bb. Trattamento del campione aspirato con triage appropriato Diffondere la aspirare sui vetrini e preparazione di strisci di buona qualità diretto (Figura 6) seguita dalla colorazione corretta e triage (Figura 7,8). <ol><li> Una goccia di aspirare sloggiato sul vetrino si sviluppa da una varietà di approcci, come illustrato nella (Figura 6) [2]. L&#39;approccio comune è &#39;a&#39;. Tuttavia, se il campione è sangue diluito con un po microfragments, il sangue in eccesso viene drenata via inclinando il vetrino, e il microfragments poi sono sparsi tra questa diapositiva e far scorrere secondo bicchiere simile a &#39;a&#39;. Se l&#39;aspirato è prevalentemente una sospensione senza microfragments, ad esempio da lesioni linfoproliferative, si diffonde simile a &#39;b&#39; o &#39;c&#39;. </li><li> Le sbavature possono essere trattati e fissati in una varietà di modi per metodi di colorazione diversa durante valutazione in loco adeguatezza. Tuttavia, l&#39;approccio migliore è quello di asciugare tutte le sbavature. L&#39;aria secca strisci possono essere colorati con macchie Romanowski (come Difff-Quik macchia, Wright macchia) dopo la fissazione metanolo o con il Pap macchia dopo reidratazione salina-e post-fissazione (nel 95% di etanolo o preferibilmente in etanolo al 95% con 5 % di acido acetico) [3]. L&#39;eliminazione delle interferenze dovute al sangue oscurando è un beneficio significativo [3]. </li><li> A seconda dei risultati iniziali cytomorphologic durante la valutazione sul campo adeguatezza, triage aggiuntive (come il blocco di celle elettiva, microscopia elettronica, culture microbiologia, citometria a flusso, citogenetica molecolare-test, ecc) è raccomandato come indicato. </li></ol> Rappresentante dei risultati: <img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig1tmb.jpg" alt="figura 1" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig1.jpg">Clicca qui per vedere una versione più grande della figura 1</a> . Figura 1. Materiali necessarie per la preparazione AV Phantom per la pratica di competenza FNA (* Noi usiamo involucro di plastica Saran che non aderire al calafatare alla fine, durante la rimozione dopo l&#39;indurimento completo della calafatare.) <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig2tmb.jpg" alt="figura 2" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig2.jpg">Clicca qui per vedere una versione più grande della figura 2.</a> Figura 2. Preparazione AV lesione Phantom <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig3tmb.jpg" alt="figura 3" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig3.jpg">Clicca qui per vedere una versione più grande della figura 3.</a> Figura 3. Passaggi critici nella procedura FNA. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig4tmb.jpg" alt="figura 4" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig4.jpg">Clicca qui per vedere una versione più grande della figura 4.</a> Figura 4. EUS-FNA-Sintesi dei passaggi critici * (vedi Fig. 3) <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig5tmb.jpg" alt="figura 5" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig5.jpg">Clicca qui per vedere una versione più grande della figura 5.</a> Le insidie ​​Figura 5. Legate ai passaggi critici in FNA procedure. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig6tmb.jpg" alt="figura 6" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig6.jpg">Clicca qui per vedere una versione più grande della figura 6.</a> Figura 6. Preparazione degli strisci diretta del campione FNA tra due diapositive. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig7tmb.jpg" alt="figura 7" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig7.jpg">Clicca qui per vedere una versione più grande della figura 7.</a> Figura 7. Wet fisso strisci contro essiccati all&#39;aria. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig8tmb.jpg" alt="figura 8" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig8.jpg">Clicca qui per vedere una versione più grande della figura 8.</a> Figura 8. Wet fisso strisci contro essiccati all&#39;aria.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Pandit, A. W., Rao, R. N., Basir, Z., Shidham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Harvester+with+Functional+Valve+(THFV):+Shidham's+device+for+reproducibly+higher+specimen+yield+by+fine+needle+aspiration+biopsy+with+easy+to+perform+steps.">Tissue Harvester with Functional Valve (THFV): Shidham's device for reproducibly higher specimen yield by fine needle aspiration biopsy with easy to perform steps.</a> BMC Clinical Pathology. 7 (2), (2007).</li><li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AppendiX+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">AppendiX I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> , 207-235 (2007).</li><li>Shidham, V., Kampalath, B., England, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+air+drying+of+all+the+smears+prepared+during+fine+needle+aspiration+and+intraoperative+cytology+studies:+An+opportunity+to+practice+a+unified+protocol,+offering+the+flexibility+of+choosing+variety+of+staining+methods.">Routine air drying of all the smears prepared during fine needle aspiration and intraoperative cytology studies: An opportunity to practice a unified protocol, offering the flexibility of choosing variety of staining methods.</a> Acta Cytologica. (45), 60-68 (2001).</li></ol>

Biopsie con ago sottile aspirazione (FNAB) sono ampiamente eseguita come una economica, tecnica sicura, rapida e mini-invasiva per la diagnosi del tessuto di vari tumori e lesioni. In questa procedura, un 18-27 gauge viene inserito nella lesione, avanti e indietro più volte in diverse aree della lesione sotto vuoto controllato (aspirazione) di intensità variabile da minimo sotto forma di unica azione capillare di circa 10 ml vuoto in siringa per recuperare materiale diagnostico dei tessuti. Un ago con calibro più fine più alto è il numero preferito di recuperare un buon materiale citologico per preparare strisci diretti. Gauge più ampia di 18G recupera più adeguato campione per il blocco delle cellule, citometria a flusso, microscopia elettronica, citogenetica, microbiologia ecc culture Anche se la procedura è semplice, controllare le varie fasi con l&#39;applicazione corretta ed il rilascio di vuoto a misure appropriate in modo concertato è estremamente importante per risultati ottimali. A causa della non disponibilità di appositamente progettato ad alto rendimento aghi, aghi ipodermici convenzionale o le loro modifiche sono utilizzati per eseguire questa procedura. Tuttavia, gli aghi ipodermici hanno delle limitazioni che portano ad una bassa resa di campione se utilizzato in modo convenzionale. Il requisito di grip siringa speciale aggiunge di solito la complessità della procedura. Pertanto, a causa della mancanza di idonei dispositivi disponibili in commercio aghi FNAB, questa procedura estremamente versatile soffre un problema frequente di recupero campione inadeguata. Recentemente, un dispositivo aumentando il rendimento con la riproducibilità è stata segnalata [1]. Inoltre, attualmente vi è una mancanza di modello adatto per praticare attitudine ai FNAB da personale sanitario in formazione tra residenti e compagni. Abbiamo avuto un modello standardizzato con un pezzo di fegato bovino fresco farcito in guanto di lattice per praticare FNAB competenza. Tuttavia, questo modello è difficile da organizzare a breve termine. Acquisto di fegato bovino fresco di solito è la situazione limitante. Inoltre, la gestione del fegato può introdurre contaminazione fattori legati da richiamo significativo indietro. La tendenza per il guanto in lattice a perdere dopo un paio di punture spillo porta alla confusione potenziale durante la sessione di prove libere. Riportiamo e descrivere un nuovo metodo semplice ma di incorporare un piccolo pezzo di banana (o salsiccia) in un mastice di silicone disponibili in commercio in gomma e altri materiali facilmente reperibili. Il fantasma FNAB mantiene tenuta di vuoto permettendo così l&#39;aspirazione di materiale dal campione incorporato, equivalente alla procedura FNAB reale su una lesione in ambito clinico. In questo video, dimostriamo la procedura che consente FNAB lesione fantasma e la pratica della procedura FNAB. Dimostra anche in breve il trattamento dei campioni recuperate compresa la preparazione striscio e colorazione [2,3]. Poiché il caulk richiede tempo per curare la lesione fantasma dovrebbe essere preparata in anticipo circa 24 a 48 ore prima della sessione pratica. Paragonabile pronto per l&#39;uso lesione fantasma possono essere ottenuti da una fonte commerciale (Fonte FNA, USA). La lesione fantasma per la pratica di FNAB competenza possono essere utilizzati per la formazione dei residenti e compagni prima dell&#39;inizio della prestazione FNAB su pazienti in ambiente clinico.

preparation and using phantom lesions to practice fine needle aspiration biopsies

Attualmente, gli operatori sanitari compresi i residenti e compagni non hanno un modello adatto fantasma di praticare l&#39;agoaspirato biopsia (FNAB) procedura. In passato, abbiamo standardizzato un modello costituito da guanti in lattice contenenti fresca fegato bovino per la pratica FNAB. Tuttavia, questo modello è difficile da organizzare e preparare in tempi brevi, con l&#39;acquisto di fegato fresco bovino è l&#39;aspetto più impegnativo. Manipolazione di fegato con problemi di contaminazione legati è anche un pareggio importante schiena. Inoltre, le perdite di materiale dei guanti, dopo un ago pochi passi, con conseguente disordine. Abbiamo stabilito un nuovo metodo semplice di incorporare un piccolo pezzo di salsiccia o di banane in un mastice di silicone disponibili in commercio in gomma. Questo modello consente la conservazione di tenuta vuoto e l&#39;aspirazione di materiale dal campione incorporato, che assomiglia ad un procedimento effettivo FNAB sulle lesioni massa clinica. Il materiale aspirato nel mozzo dell&#39;ago può essere elaborato simile ai modelli procurato durante una procedura effettiva FNAB, facilitando competenza aggiuntiva in preparazione striscio e colorazione.

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Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

Praticare delle biopsie fini di aspirazione dell&#39;ago (FNAB) da tirocinanti è relativamente impegnativo, a causa della mancanza di un facilmente disponibile, lesione appropriato. Preparazione di una lesione AV fantasma per praticare la procedura di FNAB e competenza mastering è relativamente facile.

Preparazione e utilizzo lesioni Phantom alla pratica Belle biopsie agoaspirazione

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

preparation-using-phantom-lesions-to-practice-fine-needle-aspiration

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K Views.  University of Wisconsin - Milwaukee. Praticare delle biopsie fini di aspirazione dell'ago (FNAB) da tirocinanti è relativamente impegnativo, a causa della mancanza di un facilmente disponibile, lesione appropriato. Preparazione di una lesione AV fantasma per praticare la procedura di FNAB e competenza mastering è relativamente facile.

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Ricerca

Biologia

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento

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Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. Therapeutic options addressing the causes of muscular dystrophy pathogenesis are expected to alleviate muscle degeneration. Therefore, a method to assay and quantify the extent of cell death in muscle biopsies is needed. Conventional methods to observe myofiber degeneration in situ are either poorly quantitative or rely on the injection of vital dyes. In this article, an immunofluorescence protocol is described that stains necrotic myofibers by targeting immunoglobulin G (IgG) uptake by myofibers. The IgG uptake method is based on cell features characterizing the necrotic demise, including 1) the loss of plasma membrane integrity with the release of damage-associated molecular patterns and 2) the uptake of plasmatic proteins. In murine cross-sections, the co-immunolabelling of myofibers, extracellular matrix proteins, and mouse IgG allows clean and straightforward identification of myofibers with necrotic fate. This simple method is suitable for quantitative analysis and applicable to all species, including human samples, and does not require the injection of vital dye. The staining of necrotic myofibers by IgG uptake can also be paired with other co-immunolabelling.

Described here is a protocol for direct immunolabelling of necrotic myofibers in muscle cryosections. Necrotic cells are permeable to serum proteins, including immunoglobulin G (IgG). Revealing the uptake of IgG by myofibers allows the identification and quantification of myofibers that undergo necrosis regardless of muscle condition.

Immunolabelling Degenerazione di mitragliari nelle biopsie muscolari

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Micro-aspirazione a cella singola come strategia alternativa per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per la separazione delle miscele di virus giganti

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Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Valutazione del rischio agrochimico per le regine delle api da miele accoppiate

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Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their recruited proteins, lead to temporal and spatial control of gene expression. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&#38;Tag) is an enzyme-tethering method in which the specific chromatin protein is firstly recognized by its specific antibody, and then the antibody tethers a protein A-transposase (pA-Tn5) fusion protein, which cleaves the targeted chromatin in situ by the activation of magnesium ions. Here, we provide our previously published CUT&#38;Tag protocol using intact nuclei isolated from allortetraploid cotton leaves with modification. This step-by-step protocol can be used for epigenomic research in plants. In addition, substantial modifications for plant nuclei isolation are provided with critical comments.

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag) is an efficient chromatin epigenomic profiling strategy. This protocol presents a refined CUT&amp;Tag strategy for the profiling of histone modifications in plants.

Profilazione della modifica H3K4me3 negli impianti utilizzando la scissione sotto target e tagmentazione

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un test di chemiotassi migliorato per la rapida identificazione dei chemioattrattivi rizobatterici negli essudati radicali

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Comprehensive Echocardiographic Assessment of Right Ventricle Function in a Rat Model of Pulmonary Arterial Hypertension

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive disease caused by vasoconstriction and remodeling of the small arteries in the lungs. This remodeling leads to increased pulmonary vascular resistance, worsened right ventricular function, and premature death. Currently approved therapies for PAH largely target pulmonary vasodilator pathways; however, recent emerging therapeutic modalities are focused on other novel pathways involved in the pathogenesis of the disease, including right ventricle (RV) remodeling. Imaging techniques that allow longitudinal assessment of novel therapeutics are very useful for determining the efficacy of new drugs in preclinical studies. Noninvasive trans-thoracic echocardiography remains the standard approach to evaluating heart function and is widely used in rodent models. However, echocardiographic evaluation of the RV can be challenging due to its anatomical position and structure. In addition, standardized guidelines are lacking for echocardiography&#160;in preclinical rodent models, making it difficult to carry out a uniform assessment of RV&#160;function across studies in different laboratories. In preclinical studies, the monocrotaline (MCT) injury model in rats is widely used to evaluate drug efficacy for treating PAH. This protocol describes the echocardiographic evaluation of the RV in na&#239;ve and MCT-induced PAH rats.

The present protocol describes the echocardiographic characterization of right ventricular morphology and function in a rat model of pulmonary arterial hypertension.

Valutazione ecocardiografica completa della funzione del ventricolo destro in un modello di ratto di ipertensione arteriosa polmonare

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive disease caused by vasoconstriction and remodeling of the small arteries in the lungs. This ...

Utilizzo di biopsie cutanee per generare podociti derivati da pazienti

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the glomerulus. Mutations in podocyte-specific genes can cause focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), and podocytes are also affected in many other primary and secondary nephropathies. Due to their differentiated nature, primary cell culture models are limited for podocytes.&#160;Therefore, commonly conditionally immortalized cells are used. However, these conditionally immortalized podocytes (ciPodocytes) have several limitations: the cells can dedifferentiate in culture, especially when they reach confluency, and several podocyte-specific markers are either only slightly or not expressed at all. This brings the use of ciPodocytes and their applicability for physiological, pathophysiological, and clinical reach into question. Here, we describe a protocol for the generation of human podocytes-including patient-specific podocytes-from a skin punch biopsy by episomal reprogramming of dermal fibroblasts into hiPSCs and subsequent differentiation into podocytes. These podocytes resemble in vivo podocytes much better in terms of morphological characteristics, like the development of foot processes and the expression of the podocyte-specific marker. Finally, yet importantly, these cells maintain patients&#39; mutations, resulting in an improved ex vivo model to study podocyte diseases and potential therapeutic substances in an individualized approach.

Autore in primo piano: Generazione di podociti derivati da pazienti da biopsie cutanee  

This manuscript describes a two-step protocol to generate patient-specific podocytes from dermal fibroblasts via episomal reprogramming into human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and subsequent differentiation into podocytes.

Generazione di podociti derivati dal paziente da biopsie cutanee

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...