Questo lavoro è supportato da un finanziamento della MRC a M. FS.

1. Lo sviluppo degli embrioni <ol><li> Quando sono previste, le uova sono raggruppati a causa di filamenti attaccamento al corion. Per consentire gli embrioni si sviluppano normalmente, è necessario separare le uova. Groviglio e tagliare filamenti attaccamento tenendo i filamenti allegato con due pinze. </li><li> Dopo unclustering, le uova sono separati da feci e alghe e trasferita ad un mezzo embrione fresco ad una densità massima di 40 uova per ogni piatto 6 centimetri di Petri. </li><li> Embrioni Medaka sviluppare leggermente più lento rispetto zebrafish a 27 ° C. I tempi di schiusa è diverso tra le due specie; embrioni Medaka portello dal corion in 7 giorni e cominciare subito a nuotare e mangiare, mentre gli embrioni di zebrafish schiudono in 2 giorni, ma iniziano a nuotare e mangiare in 5-6 giorni. Sviluppo di Medaka si svolge secondo 4 Iwamatsu messa in scena è. </li><li> Lo sviluppo degli embrioni Medaka può essere comodamente regolato piani sperimentali, selezionare la temperatura appropriata. Sviluppo di embrioni Medaka può essere fermato a 4 ° C nel primo sviluppo. Dopo la tappa 24, quando il cuore inizia a battere, lo sviluppo può essere rallentato con una temperatura minima di 18 ° C. </li><li> I tempi di comparsa di organi / tessuti è leggermente diverso in Medaka rispetto al pesce zebra, vale a dire in somitogenesis Medaka si verifica dopo l&#39;inizio dello sviluppo del cervello mentre in somitegenesis zebrafish precede lo sviluppo del cervello. </li></ol> 2. Rimozione del corion Il corion di Medaka è costituito da due strati protettivi con uno strato duro interno e una superficie morbida esterna. Così, in due fasi di trattamento della proteasi impiegando pronasi ed enzimi cova è necessario rimuovere questo corion. Una volta dechorionated, gli embrioni devono essere conservati in 1X BSS. Semi-sterile condizioni miglioreranno la cultura di successo degli embrioni dechorionated, specialmente quando lunghi periodi di osservazione sono obbligatori. Queste includono l&#39;utilizzo di soluzioni sterili (ad esempio sterilizzati 1X BSS con gli antibiotici) e gli strumenti sterilizzati con etanolo al 70% seguita da risciacquo con 1X BSS. Come dechorionated embrioni Medaka sono più morbide e più fragili di embrioni di zebrafish dechorionated, particolare attenzione deve essere presa per assicurare che non entrino in contatto con l&#39;aria o bolle nella pipetta, in modo da causare il collasso immediato. Per garantire il minimo danno agli embrioni, una bocca larga pipetta di vetro lucido con pompa di calore pipetta deve essere utilizzato per il trasferimento di embrioni e un ciclo capelli dovrebbero essere utilizzate per orientare gli embrioni per l&#39;osservazione. Non aderente scatole di Petri devono essere usati per prevenire gli embrioni di attaccarsi alle superfici. <ol><li> Prima di dechorionation è opportuno verificare che le uova sono state sufficientemente separati e ripulito. </li><li> Dal momento che sia pronasi ed enzimi cova sono proteinasi, dovrebbero essere tenuti in ghiaccio e minimizzare l&#39;esposizione degli embrioni a questi enzimi. </li><li> Trasferimento uova di carta vetrata (grana P2000, impermeabile) posta nel coperchio di un piatto nove centimetri Petri. Rimuovere l&#39;eccesso di media, ma garantire un volume sufficiente resta contro l&#39;essiccamento della embrioni. </li><li> Ruotare delicatamente embrioni per circa 45-60 secondi per rimuovere alcuni dei peli superficie esterna e punteggio leggermente la superficie del corion (Figura 1). Trasferimento degli embrioni indietro originale Petri ed esaminare. Quando gli embrioni che rotola su carta vetrata usare il dito indice, applicando una pressione minima e mantenendo le dita parallele alla superficie della carta vetrata. Non tiro più di 5-7 embrioni alla volta. Questa precauzione riduce al minimo il rischio di schiacciare gli embrioni sotto l&#39;altro. </li><li> Sostituire medio uovo in un piatto con pronasi 20mg/ml ed embrioni incubare per 40-60 minuti a 27 ° C. Assicurarsi che gli embrioni sono sufficientemente coperti da pronasi e un coperchio è presente sul piatto. Pronasi non utilizzati devono essere tenuti in ghiaccio durante questa fase di minimizzare auto-digestione e può essere riutilizzato fino a quando l&#39;attività è persa (circa 1-2 settimane). </li><li> Recuperare pronasi per il riutilizzo e lavare gli embrioni 5X in media embrione per rimuovere le tracce di pronasi quanto ciò inattivare l&#39;enzima cova da aggiungere. </li><li> Rimuovere medio embrione embrioni e coprire con l&#39;enzima cova, assicurando embrioni riunirsi in monostrato nel piatto. Se le uova sedersi su uno sopra l&#39;altro nel piatto, quelli in basso saranno schiacciati come il corion si dissolve. Tenere enzima utilizzato cova sul ghiaccio. </li><li> Incubare gli embrioni a 27 ° C e dopo 15 minuti controllare periodicamente i progressi della cova utilizzando uno stereomicroscopio. Si vedrà che un certo numero di cratere lunare, come i buchi cominciano ad apparire nello strato interno del corion, che si dissolve ben presto seguendo questo lasciando lo strato morbido esterno del corion facilmente rimosso manually. L&#39;intero processo di schiusa può richiedere 15-60 minuti. </li><li> Non appena gli embrioni escono dal corion, il trasferimento degli embrioni a una piastra di Petri contenente 1X BSS. Assicurarsi di non trasferire enzima da cova verso la BSS 1X toccando la punta della pipetta sulla superficie del BSS permettendo al embrioni a rotolare delicatamente. </li><li> Una volta che tutti gli embrioni vengono trasferiti da enzima cova, effettuare un trasferimento finale ad un altro piatto fresco di 1X BSS. In questo modo gli embrioni non siano esposti a eventuali residui di enzima cova, in quanto ciò potrebbe danneggiare gli embrioni esposti. Una volta in questo piatto finale di tutti gli embrioni che possiedono ancora lo strato esterno del corion possono essere liberati manualmente utilizzando sterilizzati micro-pinze con lo stereomicroscopio. Se gli embrioni devono essere sviluppate dechorionation seguenti, penicillina / streptomicina deve essere aggiunto il BSS per prevenire la crescita batterica. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Confronto di embrioni arrotolato e srotolato durante dechorionation. Osservate come gli embrioni pannello arrotolato in B mancano i capelli visto sul embrioni srotolato nel pannello A. 3. Montaggio embrioni dechorionated Embedding agarosio è utile per lunghi periodi di immagini (ad esempio, time-lapse imaging) per gli embrioni di vivere così come per osservazioni dettagliate di embrioni fisso. Durante la gastrulazione e organogenesi precoce (stadio 14 a tappa 28), embrioni Medaka mostra ondate di movimenti ritmici contrattile attraverso il periderm, uno strato di tessuto che copre sia nello sviluppo embrionale e il tuorlo 5. Gli embrioni sono trattati con 3,5 mm 1-eptanolo per fermare i movimenti contrattili 6. Per fermare il movimento di embrioni dopo la tappa 28 (64hpf), gli embrioni vengono anestetizzati con l&#39;aggiunta di gocce di Tricaine mesilato (TMS) prima di incorporamento. TMS è aggiunto anche l&#39;agarosio (aggiungere solo una minima quantità, questa dose deve essere ottimizzato, circa una diluizione 1:25). <ol><li> Scongelare una piccola quantità del 3% agarosio a bassa temperatura di gelificazione (in 1X BSS), con il riscaldamento a 37 ° C e mantenendolo a tale temperatura. </li><li> Le seguenti operazioni devono essere svolte rapidamente per garantire che l&#39;agarosio non solidificare prima orientare l&#39;embrione. Usando una bocca larga trasferimento pipetta di vetro fuso sufficiente agarosio a riempire la depressione tappo di una provetta Eppendorf. </li><li> Trasferimento di un embrione dechorionated alla depressione tappo minimizzando riporto BSS con l&#39;embrione. Immediatamente l&#39;assorbimento e l&#39;agarosio embrione dalla depressione cappuccio e trasferimento in una camera di cultura capsula di Petri. Un piatto di Petri 3,5 centimetri con una finestra di vetro sul fondo viene utilizzato. Per le immagini utilizzando un microscopio invertito, gli embrioni sono orientati a faccia in giù il corpo e posto vicino al vetro di copertura. Per le immagini utilizzando un microscopio in posizione verticale, lo spessore di agarosio è ridotto al minimo. </li><li> Trasferire il piatto 3,5 centimetri Petri in un piatto di 14 centimetri di diametro Petri contenente acqua e ghiaccio (acqua riempito circa 1 / 3 profondità totale di piatto di grandi dimensioni). Mentre tenendo la camera con decisione sul fondo del piatto 14 centimetri Petri, utilizzare un ciclo capelli per orientare delicatamente l&#39;embrione come desiderato nel fuso agarosio e tenere l&#39;embrione fino alla agarosio solidifica delicatamente alzare ed abbassare il piatto più piccolo nella sua posizione originale in acqua gelida. </li></ol> 4. Trapianto di cellule negli embrioni Medaka L&#39;obiettivo di questa procedura è quello di determinare se il gene di interesse atti cellule autonomamente (all&#39;interno di una cella) o non cellulari autonomamente (tra le cellule). Cellule del donatore possono essere etichettati con un colorante tracciante come rodamina-destrano prima del trapianto (come descritto in &#39;microiniezione di embrioni Medaka&#39; il protocollo che accompagna Giove) o di un ceppo transgenico con espressione GFP può essere utilizzata, che permetta di valutare il trapianto. Una combinazione di entrambe le tecniche di etichettatura è spesso utile a superare l&#39;auto-fluorescenza che si possono incontrare. Per time-lapse studi dopo il trapianto, l&#39;espressione della GFP è particolarmente utile. Utilizzare una pipetta ad imboccatura larga in vetro con pompa pipetta durante tutta la procedura e sterilizzare tutti gli strumenti (compresi gli scivoli) in anticipo con il 70% EtOH seguito da un risciacquo con sterili 1X BSS. Embrioni destinatari sono in genere sviluppati intorno al palco 12 come questo permette la discriminazione dei poli ventrale e dorsale nello svolgimento trapianto. <ol><li> Iniziare dechorionating embrioni 1,5 ore prima del trapianto e l&#39;iniezione apparato di setup durante l&#39;incubazione dell&#39;enzima. </li><li> Posizionare un vetrino da microscopio cavità in un piatto di 9 centimetri di diametro Petri. </li&gt; <li> Aggiungere una piccola quantità del 3% di metilcellulosa al centro della diapositiva cavità con una punta di pipetta sterile e diffondere sottilmente. </li><li> Metilcellulosa asciugare per circa 1-2 minuti. </li><li> Aggiungere 350μl di sterili 1X BSS a riempire la depressione diapositive. </li><li> Trasferimento di un embrione donatore e fino a quattro embrioni destinatario alla diapositiva con una pipetta di vetro. </li><li> Embrioni orientarsi utilizzando un ciclo capelli in modo che il Blastoderm dell&#39;embrione è rivolto verso l&#39;alto. Gli embrioni possono essere appoggiati uno contro l&#39;altro per aumentare ulteriormente la stabilità. </li><li> Inserire delicatamente la micro-ago nel Blastoderm donatore e lentamente assorbimento 10-20 cellule. </li><li> Inserire delicatamente l&#39;ago in area richiesta di Blastoderm destinatario embrione ed espellere le cellule lentamente. Grande attenzione dovrebbe essere presa quando si inserisce nelle cellule Blastoderm destinatario in modo da non disturbare la cellula-uovo confine sacco in quanto ciò può provocare la morte dell&#39;embrione. </li><li> Versare sterilizzati 1X BSS nella capsula di Petri. Versare cautamente il BSS in piatto più vicino al lato del piatto il più possibile in modo da non disturbare gli embrioni. Non versare mai il BSS direttamente sul embrioni e aggiungere sufficiente BSS in modo che la diapositiva e gli embrioni sono immersi. </li><li> Aggiungere 100μl di penicillina / streptomicina per il piatto e coprire. Con attenzione trasferire il piatto ad un 27 ° C incubatore per consentire il normale sviluppo. </li><li> Gli embrioni possono essere periodicamente osservare come desiderato. Quando si utilizza il trapianto di effettuare guadagno di funzione e / o esperimenti di salvataggio fenotipo, alcuni cambiamenti morfologici osservati potrebbe essere dovuta agli effetti del trapianto. Così trapianti multipli sono necessari. Dopo 2-3 giorni, melanofore deve essere presente sul sacco vitellino, testa, occhi e del tronco. Se presente sugli embrioni poi trapiantato con successo chimera è probabilmente stato prodotto (Figura 3). </li></ol> Se necessario, embrione donatore genotipo (s), trasferendo alla PCR tubo (s) contenente 20mg/ml 25μl di proteinasi K. Incubare a 55 ° C per 4 ore seguiti da 10 minuti a 94 ° C ed eseguire PCR. 5. Rappresentante risultati <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Posizione Esempio di agarosio-embedded embrione. Anteriore è mostrato a destra e la vista è dorsale. Pannello B: cellule endoteliali possono essere visti su entrambi i lati del corpo dell&#39;embrione e sono etichettati con GFP guidata dal promotore fli. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Immagini di post-trapianto di embrioni. Una immagine mostra un embrione donatore e ricevente immediatamente post-trapianto. L&#39;embrione donatore viene mostrato sulla destra con un Blastoderm completamente rossa (freccia). L&#39;embrione destinatario è mostrato sulla sinistra ed è facilmente identificabile dalla piccola massa di cellule trapiantate rosso visibile nella Blastoderm (punta di freccia). B immagine mostra due embrioni destinatario circa 7 ore dopo il trapianto (incubazione a 27 ° C). Notate le cellule trapiantate sono migrate dal sito del trapianto e sono ora dispersi in tutto il Blastoderm (frecce). Immagine C mostra un embrione destinatario a st.29 (circa 74hpf). Si noti la pigmentazione negli occhi e la presenza di melanofore nella regione del tronco e del cervello (frecce). La rodamina marcato le cellule possono essere visti da colonizzare molte delle strutture embrionali che indica la produzione di successo di una chimera.

<ol>
	<li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka,+Oryzias+latipes.">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li><li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+and+zebrafish,+an+evolutionary+twin+study.">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li><li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation.">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li><li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo.">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li><li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization.">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo video ci mostrano come dechorionate e realizzare transplanataion cellula su embrioni Medaka. Questa è una tecnica potente per produrre embrioni chimerici per lo studio del gene / proteina funzione durante lo sviluppo, nonché per chiarire l&#39;autonomia del gene / proteina in questione. Medaka sono un utile sistema modello vertebrato per questa tecnica a causa di mappe destino ben consolidata e il loro prestito trasparenza bene di in vivo imaging in tempo reale. Trapianto può essere combinato con microiniezione (come descritto in &#39;microiniezione di embrioni Medaka&#39; il protocollo che accompagna Giove) in modo che il comportamento delle cellule trapiantate possono essere facilmente osservati.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Embryo medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-dissecting forceps</td>
<td>Tools</td>
<td>55 INOX A.DUMONT&amp;FILS</td>
<td>N/A</td>
<td>Very sharp fine tips for removal of chorion.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size</td>
<td>Tools</td>
<td>Hermes Abrasives Ltd.</td>
<td>N/A</td>
<td>Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.</td>
</tr>
<tr>
<td>3% methylcellulose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M 0512</td>
<td>High viscosity for holding embryos in place during transplantation.</td>
</tr>
<tr>
<td>1X BSS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>Added to BSS when incubating dechorionated embryos.</td>
</tr>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>53702</td>
<td>For dechorionation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Hatching enzyme</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>For dechorionation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tricaine mesilate (TMS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-5040</td>
<td>400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.</td>
</tr>
<tr>
<td>3% ultra-low gelling temp. agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2576</td>
<td>Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dish culture chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td>
<td>11-004-008</td>
<td>Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige</td>
<td>N/A</td>
<td>Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>GC100-10T</td>
<td>For making transplantation needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>Model P-97 </td>
<td>For making transplantation needles.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras

Medaka è un piccolo deposizione delle uova di pesce d&#39;acqua dolce che permette le analisi genetiche ed embriologica ed è uno dei tre organismi modello vertebrato, in cui sono state effettuate genome-wide schermi mutante fenotipo-cacciati 1. Divergenza di sovrapposizione funzionale di geni correlati tra Medaka zebrafish e consente l&#39;identificazione di fenotipi romanzo che sono identificabili in una singola specie 2, così Medaka e zebrafish sono complementari per la dissezione genetica delle funzioni del genoma dei vertebrati. Manipolazione di embrioni Medaka, come dechorionation, embrioni di montaggio per l&#39;imaging e il trapianto di cellule, sono procedure fondamentali per lavorare su entrambi i Medaka zebrafish e in un laboratorio. Trapianto di cellule esamina autonomia cellula di mutazioni Medaka. Chimere sono generati dal trapianto di cellule da embrioni etichettati donatore in embrioni destinatario senza etichetta. Cellule del donatore possono essere trapiantati ad aree specifiche degli embrioni destinatario in base al destino mappe 3 in modo che i cloni di cellule trapiantate possono essere integrati nel tessuto di interesse durante lo sviluppo. A causa del corion duro e morbido embrioni, la manipolazione degli embrioni Medaka è più coinvolto che in zebrafish. In questo video vi mostriamo le procedure dettagliate per manipolare embrioni Medaka.

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Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

A causa del corion duro e morbido embrioni, la manipolazione degli embrioni Medaka è più coinvolto che in zebrafish. Questo video mostra passo per passo le procedure di come manipolare gli embrioni Medaka, tra cui dechorionation, montaggio in agarosio per l&#39;imaging e il trapianto di cellule per la produzione di chimere. Queste procedure sono essenziali per l&#39;uso Medaka zebrafish e in un laboratorio per sfruttare al massimo delle loro caratteristiche complementari per la dissezione genetica delle funzioni del genoma dei vertebrati.

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

dechorionation-medaka-embryos-cell-transplantation-for-generation

Research

JoVE Journal

Biology

17.6K Views.  University of Bath. A causa del corion duro e morbido embrioni, la manipolazione degli embrioni Medaka è più coinvolto che in zebrafish. Questo video mostra passo per passo le procedure di come manipolare gli embrioni Medaka, tra cui dechorionation, montaggio in agarosio per l'imaging e il trapianto di cellule per la produzione di chimere. Queste procedure sono essenziali per l'uso Medaka zebrafish e in un laboratorio per sfruttare al massimo delle loro caratteristiche complementar...

Video: Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

Ricerca

Biologia

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissezione di 6,5 embrioni di topo dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

Tracheotomia: Un metodo per il trapianto di cellule staminali al polmone

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporare plastica e Sezionamento embrioni di Xenopus laevis

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell&#39;immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...