Questo lavoro è supportato da Howard Hughes Medical Institute e una borsa di studio del NIH per lo studio della ematopoiesi embrionale.

Parte 1. Preparazione del materiale di iniezione <ol><li> Tg (globina: GFP) celle: </li><li> Bleed pesce adulto donatore utilizzando punta della pipetta 10ul rivestito in eparina (1unit/ul) a pescare puntura dietro branchia. </li><li> Aspirare globuli rossi e dispensare nel buffer di cella (0.9x PBS + 5% FBS + 1% Pen / Strep). </li><li> Cellula sospensione filtro su mesh 40uM e determinare la concentrazione di cellule utilizzando emocitometro come precedentemente descritto da LeBlanc et al. </li><li> Spin down e risospendere in buffer cella a concentrazione desiderata in modo tale che il volume di iniezione finale non è più di 5UL. Qui iniettare 1,5-2000000 cellule / destinatario. </li><li> Per le, destrano Texas Red ®, sciogliere il colorante in DPBS per una concentrazione di iniezione finale di 10-12 mg / mL. Piano per iniettare 4 uL per pesce. </li></ol> Parte 2. Iniezione <ol><li> Anestetizzare pesce in tricaine (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml pesci d&#39;acqua). </li><li> Lavare Hamilton siringa 3-4 volte prima dell&#39;iniezione utilizzando etanolo al 70%. Lavare 3-4 volte con DPBS 0.9x. </li><li> Luogo pesce lato dorsale e rivolta a destra sulla spugna umida. </li><li> Tenere la siringa Hamilton con la mano destra e con il dito indice sullo stantuffo. Delicatamente stabilizzare il corpo del pesce con la mano sinistra. </li><li> La posizione della lancetta con lo smusso rivolto verso l&#39;alto in modo tale che se l&#39;occhio del pesce s fosse un orologio, l&#39;ago sarebbe indicando la posizione 7:00 e con un angolo di 45 gradi per il pesce (figura 1). </li><li> Inserire delicatamente l&#39;ago 1-2 mm in posizione 07:00 e lentamente spingere il pistone. </li><li> Permettono di recuperare il pesce in acqua dolce E3. </li><li> Lavare ago, come descritto sopra, tra le iniezioni di reagenti diversi. </li><li> Flick soluzione cellula per risospendere le cellule ogni pochi minuti per evitare grumi di cellule. </li><li> Mantenere il flusso di pesce per 1 settimana con cambi d&#39;acqua ogni giorno per evitare l&#39;infezione. Noi mantenere i pesci in acqua terapia intensiva per questo periodo (cappotto stress da 10 ml + 5 ml + pemafix melafix 5mL per 38 litri di acqua E3). </li></ol> Parte 3. Rappresentante Risultati Quando eseguito correttamente, è possibile visualizzare materiale iniettato se è stato etichettato in qualche modo. Per esempio, Tg (globina: GFP) globuli rossi dovrebbe essere visto sotto un microscopio a fluorescenza dissezione circola nei vasi dei pesci destinatario casper subito dopo l&#39;iniezione, come illustrato in figura 2. Allo stesso modo, l&#39;iniezione di un destrano 70kDa, coniugato con Texas Red ® possono essere visualizzati nel sistema vascolare del pesce trasparente immediatamente successivo retro-orbitale di iniezione (figura 3). Cellule renali fluorescenti da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore può anche essere iniettato retro-orbitalmente in pesci irradiati destinatario casper. Queste cellule finalmente a casa per il midollo destinatario (figura 4a) e può quindi andare a ripopolare il rene dopo diverse settimane (figura 4b). Se l&#39;iniezione è troppo bassa o l&#39;angolo dell&#39;ago bypassa il retro-orbitale cavità dei seni venosi, materiale iniettato può essere visualizzata pooling intorno all&#39;occhio o che scorre fuori di esso. In alternativa, se l&#39;iniezione è troppo profondo, pesce possibile che si verifichino danni ai tessuti o sanguinamento eccessivo, anche se può ancora recuperare. Quando eseguito correttamente, la mortalità dopo retro-orbitale di iniezione deve essere inferiore al 5% del totale pesce iniettato e il successo di consegna alla circolazione sanguigna dovrebbe essere superiore al 90% del totale pesce iniettato. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1: Illustrazione di retro-orbitale tecnica di iniezione. L&#39;occhio destro del pesce è rappresentato come un orologio analogico in cui l&#39;orologio sette o posizione corrisponde al punto d&#39;iniezione corretta. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2: Tg (globina: GFP) globuli rossi circolanti nei vasi della coda di un pesce adulto casper tre giorni dopo la retro-orbitale iniezione. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3: iniezione di successo di una 70kDa destrano coniugato con Texas Red ® usato come colorante fluorescente produce vascolarizzazione nei pesci adulti trasparente, Casper ed è facilmente visualizzati utilizzando standard di tutta la microscopia a fluorescenza animale. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="figura 4a" /> Figura 4a: Tre giorni successivi retro-orbitale iniezione di cellule intere midollo rene da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore, le cellule possono essere visualizzati homing al midollo reni del combustibile irraggiato pesce destinatario casper adulti. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="figura 4b" /> Figura4b: Quattro settimane dopo la retro-orbitale iniezione di cellule intere midollo rene da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore, il ripopolamento del rene destinatario con verde cellule renali di tutto midollo del donatore possono essere visualizzati in irradiati pesce destinatario casper adulti.

<ol>
	<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model.">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li><li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route.">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li><li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish.">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li></ol>

Retro-orbitale iniezione in zebrafish adulto offre la massima efficienza della consegna del materiale iniettato alla circolazione sanguigna con la più bassa incidenza di mortalità. A causa della natura del punto di iniezione, la puntura sembra guarire in fretta, diminuendo l&#39;insorgenza di infezioni e la quantità di perdita di sangue. Il sito può anche essere iniettato ripetutamente nel corso di un breve periodo di tempo per iniezioni giornaliere di farmaci, per esempio. Grandi quanti...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>2106</td>
<td>Preweighed vial of 300 USP units</td>
</tr>
<tr>
<td>Tricaine-S</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Western Chemical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MS-222</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran, Texas Red&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes Inc.</td>
<td>D1830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5mM NaCl 
0.17 mM Kcl 
0.33 mM CaCl2 
0.33 mM MgSO2
</td>
</tr>
<tr>
<td>Microliter Syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>80300</td>
<td>701N 10uL SYR (26s/2&#x201D;/2)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

retro-orbital injection in adult zebrafish

Trattamento farmacologico degli animali tutto è uno strumento essenziale in qualsiasi sistema modello per studi di genetica e chimica farmacologica. Per via endovenosa (ev) è spesso la forma più efficace e non invasiva di consegna di un agente di interesse. Nel pesce zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), Iniezione IV di farmaci è stata a lungo una sfida a causa del diametro del vaso di piccole dimensioni. Questo si è dimostrato un ostacolo significativo per l&#39;iniezione di cellule durante il trapianto di cellule staminali emopoietiche. Storicamente, le iniezioni nel sangue sono state fatte direttamente al cuore. Tuttavia, questa intra-cardiaca procedura ha un tasso di mortalità molto alto, come il cuore è spesso perforato durante l&#39;iniezione di lasciare il pesce a rischio di infezione, perdita massiccia di sangue o di danno d&#39;organo fatale. Basandoci sulla nostra esperienza con il mouse, abbiamo sviluppato una nuova procedura di iniezione nel pesce zebra in cui il sito di iniezione è dietro l&#39;occhio e nel retro-orbitale del seno venoso. Questo retro-orbitale (RO), tecnica di iniezione è stato impiegato con successo in entrambi l&#39;iniezione di farmaci nei pesci adulti, nonché il trapianto di cellule del midollo intero rene. Iniezione RO ha un tasso di mortalità molto più basso rispetto ai tradizionali iniezione intra-cardiaca. I pesci che vengono iniettati retro-orbitalmente tendono a sanguinare iniezione meno seguito e sono ad un rischio molto più basso di lesioni per un organo importante come il cuore. Altre cellule, se eseguito correttamente, iniettati e / o farmaci entrare direttamente nel flusso sanguigno che permette composti di esercitare il loro effetto sul pesce intero e le cellule renali con facilità a casa per la loro nicchia. Così, questa nuova tecnica di iniezione riduce la mortalità, consentendo una distribuzione efficiente del materiale nel sangue dei pesci adulti. Qui esemplificare questa tecnica retro-orbitale iniezione di Tg (<em&gt; Globina</em&gt;: GFP) in cellule adulte<em&gt; Casper</em&gt; Pesci così come l&#39;iniezione di un colorante rosso fluorescente (destrano, Texas Red<em&gt;</em&gt;) In adulti<em&gt; Casper</em&gt; Pesce. Abbiamo poi visualizzare le iniezioni di successo al microscopio a fluorescenza intero animale.

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Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Qui vi mostriamo come fare retro-orbitale iniezione in zebrafish adulti.

Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

24.5K Views.  Children’s Hospital Boston. Qui vi mostriamo come fare retro-orbitale iniezione in zebrafish adulti.