Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere # DA15169 di HEM

Panoramica della procedura: Usando questo approccio, le proteine ​​della superficie cellulare sono covalentemente etichettati con biotina disponibili su residui di lisina extracellulare con un impermeant membrana, disolfuro ad accoppiamento reattivo biotinilazione (solfo-NHS-SS-biotina) con il traffico di condizioni restrittive (temperatura bassa) (vedi Fig. 1. per l&#39;illustrazione). Un set di cellule è spostato al traffico di condizioni permissive (37 ° C) e le proteine ​​biotinilato interiorizzare. L&#39;altra serie di cellule sono conservate a bassa temperatura come controlli per 1) la proteina superficie totale al tempo = 0, e 2) il controllo stripping. A seguito di un breve periodo di interiorizzazione, le cellule si spostano di nuovo a bassa temperatura per fermare l&#39;interiorizzazione, la biotina e qualsiasi superficie residua viene eliminata trattando le cellule con un agente riducente, che spacca il disolfuro accoppiamento biotina. Proteine ​​biotinilato che nasce dalla superficie cellulare e sono stati interiorizzati sono protetti dalla fase di stripping, e sarà l&#39;unica proteine ​​biotinilato che rimangono. A seguito di lisi cellulare, le proteine ​​biotinilato sono isolati da streptavidina cromatografia di affinità e la proteina di interesse viene rilevato da immunoblotting quantitativi. Per determinare il tasso di endocitica, la quantità di proteine ​​internalizzate viene confrontato con il controllo della superficie totale etichettati al tempo = 0. Abbiamo utilizzato con successo questo approccio per misurare il tasso di interiorizzazione della noradrenalina neuronale 1 e 1-4 trasportatori della dopamina. Protocollo dettagliato: 1 ° giorno: <ol><li> Cellule piastra in 6 piastre in modo che essi saranno confluenti ~ 80% nel Day 2. In alternativa, se le cellule trasfettate sono in uso, trasfettare ad una densità tale che siano confluenti ~ 80% al momento il tasso di internalizzazione sarà misurato. Se le cellule non sono fortemente aderente, la cultura ware tessuto devono essere trattati con un substrato di adesione cellulare (ad esempio poli-D-lisina) per prevenire la perdita delle cellule durante le fasi di lavaggio estesa. </li><li> Per ogni proteina in fase di test, piastra 2 pozzi su un piatto da utilizzare come la proteina di superficie totale (t = 0) e controlli stripping. Su un secondo piatto, piatto un pozzo per ogni condizione di internalizzazione in fase di sperimentazione (cioè basale endocitico vs farmaco-trattati). </li><li> Preparare le seguenti soluzioni e conservarlo a temperature indicate per l&#39;uso su Giorno 2: <ul><li> PBS 2 +: una soluzione salina tampone fosfato (pH 7,4) integrato con 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM CaCl 2, (4 ° C) </li><li> Biotinilazione Quench Soluzione: PBS 2 + integrato con 100 mM glicina, (4 ° C) </li><li> NT tampone: 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 0,2% di BSA, 20 mM Tris, pH 8,6, (4 ° C) </li><li> RIPA buffer: 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 0.1% SDS, 1.0% Triton X 100, sodio desossicolato 1,0%, (4 ° C) </li><li> Solfo-NHS-SS-biotina soluzione madre: sciogliere in dimetilsolfossido (DMSO) a 200 mg / ml, (-20 ° C) </li><li> Tris (2-carbossietil) fosfina cloridrato (TCEP) soluzione madre: 500 mm H 2 O, (-20 ° C, coperto di pellicola per bloccare la luce) </li></ul></li></ol> 2 ° giorno: <ol><li> Preparare PBS 2 + integrato con glucosio 0.18g/ml, 0,2% IgG / proteasi senza albumina di siero bovino (PBS 2 + / g / BSA). Pre-riscaldare la soluzione a 37 ° C a bagnomaria. </li><li> Scongelare il solfo-NHS-SS-biotina soluzione madre sul banco per sciogliere il DMSO. Immediatamente prima dell&#39;uso, preparare fresca solfo-NHS-SS-biotina soluzione (2,5 mg / ml in PBS freddo ghiaccio 2 +, sufficiente per 0,75 ml / pozzetto). Vortex vigorosamente la soluzione per solubilizzare il DMSO. Si noti che il NHS-biotina reagente viene facilmente idrolizzato in soluzione acquosa. Pertanto, tutte le soluzioni devono essere preparate immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Biotinilazione: piatti Mettere su un bagno di ghiaccio nella stanza fredda e lavare 3 x 2 ml con PBS freddo ghiaccio 2 +. Assicurarsi che le piastre sono leggermente angolati per consentire il drenaggio e la rimozione completa della soluzione tampone. Aggiungere 0,75 ml / pozzetto di fresco solfo-NHS-SS-biotina soluzione in ogni pozzetto. Incubare x 15 &#39;, 4 ° C sul bagno di ghiaccio con agitazione vigorosa. Dopo l&#39;incubazione è completa, preparare un altro dolce solfo-NHS-SS-biotina soluzione. Sostituire la vecchia soluzione con la soluzione fresca e incubare x 15 &#39;, 4 ° C. </li><li> Tempra: è fondamentale che tutti i non-reazione NHS-biotina molecole sono temprati, in modo che non reagiscono con le proteine ​​intracellulari e biotinylate una volta che le cellule sono lisate. Lavare le cellule 3 x 2 ml di soluzione di tempra e incubare due volte in 2 ml di soluzione spegnere x 15 &#39;, 4 ° C agitando delicatamente. </li><li> Interiorizzazione: se trattamenti farmacologici sono in fase di test, aggiungere giusta concentrazione di farmaco PBS 2 + / g / BSA. Mantenere piastra di controllo a 4 ° C e portare piastra interiorizzazione fuori dalla stanza fredda. Lavare 3 x 2 ml con PBS preriscaldata 2 + / g / BSA (+ / - drUGS) e lasciare in stesse soluzioni (2 ml / pozzetto). Riempire qualsiasi vuoto con pozzi pre-riscaldato soluzione per garantire la temperatura uniforme in tutto il piatto. Trasferire le cellule a 37 ° C in incubatore per 10 &#39;. Immediatamente prima della fine della 37 ° C di incubazione, preparare una soluzione fresca TCEP 50 mM in tampone di NT da utilizzare per passo stripping e memorizzare sul ghiaccio. Preparare la quantità sufficiente per 1,0 ml / pozzetto. </li><li> Spogliarello: Immediatamente piastra di trasferimento (s) a bagno di ghiaccio e di tornare a camera fredda. Lavare rapidamente le celle con ghiaccio freddo NT tampone, 3 x 2 ml di fermare endocitosi. Anche lavare striscia dei pozzetti di controllo 3 x 2 ml con tampone NT. Aggiungere 1,0 ml di soluzione fresca stripping in ciascun pozzetto. Incubare in ghiaccio, 15 &#39;, 4 ° C agitando delicatamente. Sostituire pozzetti con soluzione fresca stripping e incubare un ulteriore 15 &#39;, 4 ° C il ghiaccio. </li><li> Lisi: lavare tutti i pozzetti che sono stati esposti a soluzione stripping, 3 x 2 ml NT buffer. Quindi lavare tutti i pozzetti (compresi i controlli totali) con 3 x 2 ml di PBS 2 +. Lyse in 300μl/well RIPA buffer (tampone di lisi o altro compatibile per la proteina di interesse) contenenti gli inibitori della proteasi fresca (1,0 mM PMSF, 1,0 mg / ml ogni leupeptina, aprotinina e pepstatina). Lyse agitando x 20 &#39;, 4 ° C. Trasferimento a tubi microcentrifuga e chiaro detriti cellulari mediante centrifugazione 18.000 xg, 10 &#39;, 4 ° C. </li><li> Concentrazione determinazione delle proteine: utilizzare un dosaggio di proteine ​​compatibile con le vostre condizioni di lisi (es. proteina DC test, Bio-Rad) per determinare la concentrazione proteica del lisato rispetto ad una curva standard di BSA. </li><li> Streptavidina cromatografia di affinità: Preparare tubi microcentrifuga con quantità equivalenti di proteine ​​per ogni campione. Aggiungi tampone di lisi per portare il volume finale di ogni campione di 200μl. Vortex la streptavidina perline agarosio vigorosamente per portare a una sospensione anche. Utilizzando una pipetta 200μl con la punta tagliata, perline pipetta in ciascuna provetta. Consigliato 20μl beads/50 lisato mcg. Incubare per una notte, 4 ° C su un rotatore tubo. </li></ol> Giorno 3: <ol><li> Lavaggio tallone: ​​Centrifugare i campioni, 18.000 xg, 2 &#39;per raccogliere perle. Aspirare off lisato, facendo attenzione a non avvicinarsi tallone pellet con aspiratore. Utilizzare una punta di plastica pipetta sulla fine della aspiratore per un migliore controllo. Aggiungere 0,75 ml di tampone di lisi a ciascuna provetta e miscelare per lavare perline. Campioni centrifuga, 18.000 xg, 2 &#39;per raccogliere perline e ripetere l&#39;aspirazione e lavaggio due volte (tre lavaggi in totale). Dopo l&#39;ultimo lavaggio, aspirare la maggior quantità di buffer come possibile senza disturbare il pellet tallone. Ribaltamento del tubo verso l&#39;aspiratore assiste con questo passaggio. </li><li> Eluizione del campione: Aggiungere 20-25μl di buffer 2x campione Laemmli (riduzione) in ciascuna provetta. L&#39;agente riducente si unirà il SSN-SS-biotina legame disolfuro, rilasciando le proteine ​​isolate in soluzione. La maggior parte delle proteine ​​di membrana sono estremamente vulnerabili quando aggregazione bollito, e non deve essere riscaldato prima del caricamento su gel per SDS-PAGE. Determinare la sensibilità al calore della vostra proteina di interesse prima di effettuare questi esperimenti. Se la proteina non può tollerare il riscaldamento bollente /, incubare su un rotatore, 30 &#39;, temperatura ambiente prima analisi mediante SDS-PAGE. Questo è sufficiente a fendere il legame disolfuro ed eluire le proteine. </li><li> SDS-PAGE e immunoblotting: proteine ​​separate mediante SDS-PAGE. Per ogni campione, è più facile eseguire gli esempi nel seguente ordine: superficie totale (tempo = 0), nastri, condizione interiorizzazione # 1, Condizione # 2, ecc Trasferimento a membrana per immunoblotting e macchia con l&#39;anticorpo appropriato per la propria proteina di interesse. Cattura le bande immunoreattive utilizzando una telecamera CCD-sistema di documentazione del gel, essendo certi che non ci siano pixel saturi. Quantificare ogni densità banda utilizzando gel di analisi / densitometria software. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Un risultato di immunoblot rappresentante è mostrato nella Figura 2A. Il segnale più forte è nella corsia &quot;totale&quot; (T), che è quantità totale di proteina di superficie prima di internalizzazione. Il comando &quot;strip&quot; (S) dovrebbe essere idealmente vicino a vuoto, il che dimostra che la striscia era efficiente per l&#39;esperimento. L&#39;efficienza striscia è calcolato confrontando la densità della corsia &quot;striscia&quot; a quella della corsia &quot;totale&quot; (es. proteina che è stata biotinilati in parallelo con la striscia, ma non era né riscaldato a 37 ° C, né esposti a soluzione stripping). La formula viene utilizzata la seguente: [1 - (striscia / totale)] * 100% Usando questa formula, la striscia in Figura 2 è stata del 99,8% efficiente. Infine, si vedrà fasce di minore intensità rispetto al totale nella corsia di internalizzazione (s) (I). Nell&#39;esempio (Figura 2), le cellule trattate sono stati trattati con veicolo o 1μM acetato forbolo miristato (PMA) nel corso di un 10 &#39;i tassi di internalizzazione trasportatore della dopamina e internazionalizzazione sono stati misurati per un 10&#39; internalizzazione periodo iniziale. Il tasso di internalizzazione è calcolato comesegue: interiorizzato / totale * 100 Come si vede nella figura 2B, 10,4% della superficie DAT interiorizzato oltre 10 &#39;sotto di veicoli trattati con condizioni. PMA trattamento aumento dei tassi di interiorizzazione DAT al 23,2% della superficie totale DAT. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Cellule illustrazione del protocollo. Biotinilato sono a 4 ° C per etichettare esclusivamente la popolazione di superficie, e sono spostati a 37 ° C per avviare internalizzazione. A seguito di internazionalizzazione, le cellule sono rapidamente raffreddata per fermare i processi endocitico e biotina superficie residua è spogliato trattando le cellule con un agente riducente. L&#39;unico proteine ​​biotinilato che rimangono sono quelle verificatesi dalla superficie al tempo t = 0 e sono stati interiorizzati, così li protegge dal trattamento stripping. Biotinilato proteine ​​sono isolati dal lotto cromatografia di affinità con perline streptavidina e la proteina di interesse viene rilevato da immunoblotting. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Attivazione PKC aumenta il tasso endocitico DAT. Test internalizzazione. PC12 cellule che esprimono stabilmente DAT sono stati biotinilato, 4 ° C, come descritto nel &quot;Protocollo dettagliate&quot;. Le cellule sono state rapidamente portato a 37 ° C ± 1 microM PMA e incubate 10 &#39;, 37 ° C. Biotina residuo è stato spogliato, riducendo, le cellule sono state lisate e le proteine ​​biotinilati sono stati isolati da streptavidina cromatografia di affinità. (A) immunoblot Rappresentante mostrando DAT superficie totale al tempo t = 0 (T), striscia di controllo (S), e interiorizzato DAT (I), alle condizioni indicate. (B) Bande sono stati catturati con una telecamera CCD e quantificati con quantità di dati software (Bio-Rad). I dati sono espressi come minimo totale% DAT internalized/10. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Immunoblot esempio raffigurante una striscia povero biotina. Internalizzazione test. PC12 cellule che esprimono stabilmente DAT sono stati biotinilato, 4 ° C, come descritto nel &quot;Protocollo dettagliate&quot;. Le cellule sono state rapidamente riscaldato a 37 ° C e incubare 10 &#39;, 37 ° C. Biotina residuo è stato spogliato, riducendo, le cellule sono state lisate e le proteine ​​biotinilati sono stati isolati da streptavidina cromatografia di affinità. La mostra immunoblot DAT superficie totale al tempo t = 0 (T), striscia di controllo (S), e interiorizzato DAT (I). Si noti la banda visibile nella corsia striscia di controllo, indicativo di efficienza striscia poveri.

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	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

I problemi più comuni: Il problema più comune che si pone in questi esperimenti è l&#39;efficienza striscia poveri. L&#39;efficienza della striscia è fondamentale essere in grado di interpretare i risultati. A meno che la striscia è stata molto efficiente, non è possibile concludere che qualsiasi proteine ​​biotinilati nelle corsie internalizzazione erano, infatti, interiorizzati dalla superficie. Strisce di efficienza ≥ 90% sono ottimali, e noi scartare alcun risultato se la striscia scende al di sot...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

Proteine ​​di membrana plasmatica sono un grande gruppo eterogeneo di proteine ​​comprende recettori, canali ionici, trasportatori e pompe. Attività di queste proteine ​​è responsabile di una serie di eventi cellulari fondamentali, inclusa la consegna dei nutrienti, l&#39;eccitabilità cellulare, e la segnalazione chimica. Molte proteine ​​di membrana plasmatica sono dinamicamente regolato da traffico endocitico, che modula la funzione delle proteine ​​di superficie, modificando l&#39;espressione della proteina. I meccanismi che facilitano endocitosi di proteine ​​sono complesse e non sono pienamente compresi per molte proteine ​​di membrana. Al fine di comprendere appieno i meccanismi che controllano il traffico endocitico di una certa proteina, è fondamentale che il tasso di endocitico la proteina s essere misurato con precisione. Per molti recettori, misurazioni dirette tasso endocitico sono spesso raggiunto utilizzando ligandi dei recettori etichettati. Tuttavia, per molte classi di proteine ​​di membrana, come trasportatori, pompe e canali ionici, non c&#39;è ligando conveniente che può essere utilizzato per misurare la velocità endocitico. Nella presente relazione, si descrive un metodo reversibile biotinilazione che impieghiamo per misurare il trasportatore della dopamina (DAT) tasso endocitico. Questo metodo fornisce un approccio diretto per misurare i tassi di interiorizzazione, e possono essere facilmente utilizzati per gli studi di traffico di proteine ​​di membrana più.

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Endocitosi regolata regola i livelli di superficie cellulare espressione della maggior parte delle proteine ​​di membrana. Qui utilizziamo riducibili, reagenti biotinilazione impermeant membrana per misurare la velocità endocitico del trasportatore della dopamina (DAT), una proteina di membrana politopica. Il metodo favorisce un approccio diretto per misurare il tasso endocitico della maggior parte delle proteine ​​di membrana plasmatica.

Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

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Biology

16.9K Views.  University of Massachusetts Medical School. Endocitosi regolata regola i livelli di superficie cellulare espressione della maggior parte delle proteine ​​di membrana. Qui utilizziamo riducibili, reagenti biotinilazione impermeant membrana per misurare la velocità endocitico del trasportatore della dopamina (DAT), una proteina di membrana politopica. Il metodo favorisce un approccio diretto per misurare il tasso endocitico della maggior parte delle proteine ​​di membrana plasmatica.

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Misura Vicino membrana plasmatica e Global Dynamics calcio intracellulare negli astrociti

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

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Biologia

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

Misurare la tensione indotta a membrana con Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche Retinol Binding

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Trasporto di membrana processi analizzati da un altamente parallelo sistema Nanopore Chip a risoluzione della proteina singolo

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Misurazione delle proteine plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile