Questo protocollo offre una piattaforma con etichetta biotina per lo studio delle interazioni proteina-acido nucleico che si rivela robusta, affidabile, efficiente e conveniente. Lo stesso lotto degli acidi nucleici etichettati con biotina può essere utilizzato per un lungo periodo di tempo, mantenendo la riproducibilità degli esperimenti. Infine, tutti i saggi con etichetta biotina descritti qui possono essere eseguiti entro un giorno e non richiedono attrezzature speciali.
A dimostrare la procedura sarà Lina Yu, una post-laurea del nostro laboratorio. Preparare i costrutti MEIOB e MOV10 e trasformarli nei batteri appropriati. Per estrarre MEIOB, pelletare le cellule tramite centrifugazione e rimostrarle in 20 millilitri di saline tamponate al fosfato di Dulbecco ghiacciate, o tamponamento DPBS.
Sonicare la sospensione batterica sul ghiaccio. Quindi, centrifuga il lisato a 12.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti e trasferisci il supernatante in un tubo fresco. Pre-lavare le perline di glutatione-sefarose e incubarle con il lisato a quattro gradi Celsius per due ore.
Centrifugare la miscela a 750 volte g e quattro gradi Celsius per un minuto per pelletare le perline. Risciacquare le perline con 10 millilitri di PBS ghiacciato otto volte. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di eluizione, incubare le perline a quattro gradi Celsius per 10 minuti ed eludere le perline tramite centrifugazione.
Ripetere l'eluizione sei volte e mettere insieme le sei frazioni. Trasferire le proteine eluite in un filtro centrifugo e concentrarsi per centrifugazione a 7.500 volte g per un volume finale da 100 a 200 microlitri. Per estrarre MOV10, esprimere la proteina nelle cellule HEK293T e pelletare le cellule secondo le indicazioni del manoscritto.
Rimescolare il pellet in tre millilitri di tampone di lisi cellulare con cocktail completo di inibitore della proteasi senza EDTA e incubare per 30 minuti sul ghiaccio. Quindi, centrifuga il lisato a quattro gradi Celsius. Preparare perline magnetiche anti-FLAG lavandole due volte con tampone K150.
Dopo il lavaggio, rimorsi le perline in un millilitro di tampone K150 ghiacciato e incubarle per due minuti a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata. Raccogliere le perline su un magnete e rimuovere il supernatante. Aggiungere le perline al lisato cellulare e incubare a quattro gradi Celsius per due ore.
Lavare le perline con tampone K150 secondo le indicazioni del manoscritto e rimpiorsi le perline in 300 microlitri di tampone di eluizione FLAG. Posizionare le perline su un magnete, raccogliere il supernatante con le proteine MOV10 e determinare la concentrazione proteica. Preparare gli oligonucleotidi dell'RNA diluendo ogni oligo a 20 micromolari e ricotturandoli per formare duplex RNA secondo le indicazioni del manoscritto.
Per il saggio di spostamento elettroforetico di mobilità MEIOB, o EMSA, mescolare i reagenti in base alle direzioni del manoscritto. Aggiungere acqua per un volume di reazione finale di 20 microlitri. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi aggiungere tampone di arresto 5x.
Per il saggio di attività dell'elicase MOV10, mescolare i reagenti secondo le indicazioni del manoscritto e aggiungere acqua per un volume di reazione finale di 20 microlitri. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti, 30 minuti e 60 minuti, quindi aggiungere un buffer di arresto 5x per interrompere la reazione. Quindi, preparare un gel di poliacrilammide nativo al 20% e caricare da 20 a 25 microlitri di ogni campione in ogni pozzo.
Eseguire il gel a 100 volt su un bagno di ghiaccio fino a quando il marcatore blu bromofenolo non è migrato verso il quarto inferiore del gel. L'acrilammide è dannosa e tossica. È importante gestirlo con adeguati dispositivi di protezione individuale.
Smontare le piastre di gel e tagliare il gel rimuovendo i pozzi di carico e le corsie inutilizzate. Posizionare il gel in un buffer TBE 0,5x. Tagliare la carta da filtro e la membrana di nylon alle dimensioni del gel, pre-bagnare la carta e la membrana e assemblare la pila per il trasferimento.
Trasferire i campioni dal gel alla membrana in un apparecchio elettroforetico semi-secco a 90 milliampere per 20 minuti. Quindi, incrociare i campioni irradiando la membrana a 120 millijoule per centimetro squadrato per 45-60 secondi. Per il rilevamento della chemiluminescenza, iniziare aggiungendo 20 millilitri di tampone di blocco alla membrana e incubandolo per 15-30 minuti mentre si trema delicatamente.
Rimuovere con cura il buffer di blocco e sostituirlo con un buffer coniugato/bloccante. Incubare nuovamente la membrana per 15 minuti. Lavare la membrana quattro volte mentre si trema per cinque minuti per lavaggio.
Quindi, aggiungere 30 millilitri di tampone di equilibrazione del substrato alla membrana e incubarlo per cinque minuti mentre si trema a 20-25 giri/min. Coprire l'intera superficie della membrana con la soluzione di lavoro del substrato e incubare per cinque minuti. Dopo l'incubazione, scansionare la membrana in un sistema di imaging chemiluminescente per uno o tre secondi.
La purificazione delle proteine MEIOB A, C ed E può essere verificata con colorazione blu Coomassie e analisi western blot. Le frecce rosse indicano le posizioni delle proteine MEIOB purificate. Le interazioni tra MEIOB e DNA a singolo filamento possono essere visualizzate utilizzando l'EMSA.
Si osservano legatura e scissione dipendenti dalla concentrazione. Come previsto, solo il MEIOB-A di tipo selvaggio interagisce con il DNA mentre i mutanti MEIOB-E e MEIOB-C no. Si possono anche osservare interazioni di MEIOB e RNA a singolo filamento.
Il MEIOB di tipo selvaggio mostra l'attività di legame e esonucleasi dipendente dalla concentrazione sull'RNA a singolo filamento. Tuttavia, il confronto quantitativo mostra che il MEIOB lega il DNA con un'efficienza superiore rispetto all'RNA. La purificazione del MOV10 è stata verificata con la colorazione blu coomassie e l'attività elicase della proteina è stata misurata su un duplex RNA con uno sbalzo a cinque primi.
Con l'aumentare del tempo di reazione, MOV10 srotola progressivamente l'RNA a doppio filamento. Per ridurre il costo del saggio, il rilevamento della chemiluminescenza può essere eseguito con una diluizione duplice dei reagenti del kit di rilevamento o con reagenti autoprodetti. Il protocollo qui descritto utilizzava con successo acidi nucleici etichettati con biotina come substrati per saggi biochimici in vitro come l'EMSA e per reazioni enzimatiche in cui la biotina non è stata comunemente utilizzata.
