Questo protocollo utilizza la microdisezione laser-capture accoppiata con RNA-Sequenziamento per ottenere trascrizioni spaziali e temporali da cellule specifiche in piante di interesse, utilizzando piccole quantità di materiali biologici. Il principale vantaggio della tecnica laser è che facilita la visualizzazione diretta delle cellule all'interno del normale contesto tissutale, consentendo alle cellule discrete di essere isolate con precisione in modo privo di contatto. Sebbene questo protocollo sia ottimizzato per l'isolamento delle cellule vegetali, può essere applicato alla maggior parte delle cellule che possono essere identificate istologicamente.
Una buona preparazione del campione è fondamentale. Pertanto, uno che esegue questa tecnica per la prima volta, l'ottimizzazione prop della fissazione dei tessuti e dell'incorporamento è importante prima della microdisezione laser-capture. Prima di raccogliere il campione di tessuto, preparare un fissatore appropriato alla specie e al tipo di tessuto da raccogliere.
Per i semi d'orzo, tagliare i campioni di semi a metà prima di immergere i campioni in almeno un volume di 10 volte di freddo ghiacciato fissatore. Utilizzare l'infiltrazione sottovuoto per accelerare la penetrazione del fissatore. Il tessuto dovrebbe affondare entro la fine dell'infiltrazione, quindi aggiornare il fissatore per un'incubazione notturna e trasferire i campioni in cassette per la lavorazione dei tessuti.
Posizionare le cassette caricate in tessuto nel cestello metallico di un processore automatico e collegare il cestello metallico al supporto sopra la camera uno. Impostare il programma sui pannelli di controllo del processore tissutale e premere start per avviare il programma di elaborazione automatica. Il sistema disidrata i campioni immergere le cassette in una serie gradiente di etanolo per 90 minuti per concentrazione come indicato.
Dopo l'ultima immersione in etanolo, il sistema immergerà i campioni in gradienti di xilene per 90 minuti per soluzione come indicato. Seguito da immersioni di 290 minuti in paraffina fusa a 55-60 gradi Celsius. La mattina seguente, rimuovere le cassette infiltrate di paraffina dal processore tissutale e procedere all'incorporamento della paraffina.
La mattina successiva, utilizzare le forcep fini per trasferire i campioni di processo in stampi di dimensioni adeguatamente dimensionate e aggiungere paraffina fusa su ogni campione. Per i semi d'orzo, orientare longitudinalmente i campioni nella paraffina verso la direzione di taglio per facilitare l'acquisizione di sezioni longitudinali. Posizionare una cassetta pulita sullo stampo e assicurarsi che l'intera cassetta sia completamente coperta con un volume sufficiente di paraffina per fissare il campione alla cassetta.
Quindi posizionare lo stampo su una piastra fredda per 10-20 minuti fino a quando la paraffina non viene impostata prima di rilasciare il blocco dallo stampo. Per preparare uno slide a membrana PEN, immergere gli scivoli in soluzione disattivante RNS per tre secondi seguiti da due brevi lavaggi e acqua trattata con DEPC. Quindi guidare le diapositive in un incubatore di 370 gradi Celsius per rimuovere qualsiasi soluzione rimasta e i raggi UV trattano le diapositive in un armadio a flusso laminare per 30 minuti per migliorare la loro paraffina e non le nocciole.
Per un sessatura del tessuto campione posizionare i blocchi di paraffina sulla piastra fredda e riempire il bagno d'acqua con l'acqua trattata con DEPC, quindi riscaldare a 42 gradi Celsius. Tagliare i blocchi alla profondità della regione di interesse e sessare i blocchi di paraffina fino a uno spessore da sei a 10 micron. Un blocco ben seghettato formerà un nastro sul bordo della lama.
Utilizzare una pinzetta fine per trasferire delicatamente nastri dal microtomo al bagno d'acqua, facendo attenzione che il nastro giace piatto sulla superficie dell'acqua. Per raccogliere le sezioni, tenendo uno scivolo con un angolo di 45 gradi, utilizzare un movimento verso l'alto per sollevare un nastro dall'acqua sullo scivolo e utilizzare un tessuto privo di pelucchi per rimuovere con cura l'acqua in eccesso. Una volta raccolte tutte le sezioni, lavare gli scivoli con lavaggi di 320 secondi in xilene, seguiti da lavaggi di 230 secondi in etanolo al 100% e lavaggi di 230 secondi in etanolo al 70%.
Per microsezionare le cellule di interesse dalle sezioni di tessuto deparraffinizzato e secco, caricare le diapositive sulle tre fessure del microscopio LCM e il tubo di raccolta del carico negli slot disponibili. Spostare lo stage per individuare la regione del campione che deve essere tagliata e tagliare un segmento vuoto privo di tessuto sullo scivolo della membrana. Ottimizzare la velocità di taglio e il taglio della pressione laser catapultando energia e messa a fuoco.
Utilizzare gli strumenti di disegno per delineare l'area di interesse nel tessuto e utilizzare i parametri ottimizzati e la funzione Robo LPC per catapultare le cellule nei tappi adesivi. Selezionare il contrassegno dall'elenco degli elementi per utilizzare lo strumento contrassegno per contrassegnare le aree di interesse. Controllare il pulsante di controllo del cappuccio per ispezionare il cappuccio adesivo, per confermare che i campioni sono stati acquisiti.
In genere sono necessarie da 10 a 15 sezioni per tappo per l'estrazione dell'RNA. Subito dopo che tutti i campioni sono stati acquisiti, procedere immediatamente all'estrazione dell'RNA per evitare la degradazione dell'RNA. Dopo l'estrazione dell'RNA e l'amplificazione dell'RNA utilizzare un sistema automatizzato di elettroforesi, secondo le istruzioni del produttore per quantificare e qualificare l'RNA antisense.
In questo studio, LCM, il sequenziamento dell'RNA è stato applicato a un piccolo numero di cellule di tre organi embrionali, ogni otto ore su un corso di 48 ore durante la germinazione. È importante regolare correttamente i parametri di taglio per consentire al tessuto di interesse di essere tagliato e slogato con precisione dal tessuto circostante senza bruciare il bordo dell'area selezionata. La ramificazione dell'RNA totale prima dell'amplificazione dell'RNA consente il rilevamento di bande elettroforetiche distinte e picchi fluorescenti di subunità ribosomiche 18 e 28S in campioni di RNA di buona qualità.
L'RNA antisense sintetizzato con successo esporrà una distribuzione unimodale simmetrica delle dimensioni da 100 a 1000 nucleotidi con un picco di circa 300 nucleotidi dopo due cicli di amplificazione. La tracciazione su scala multidimensionale di geni espressi nei diversi tessuti in 48 ore di germinazione, illustra una maggiore somiglianza tra campioni di un singolo tessuto rispetto a tra campioni dallo stesso punto di tempo, ma tessuti diversi. Il numero di geni espressi in modo differenziato aumenta progressivamente nel corso della germinazione in ogni tessuto rispetto al punto di ora zero del tessuto.
In questa analisi rappresentativa, il 25% del plumule, il 34% del radiolo e il 41% dei geni espressi in modo differenziato dello scutello sono risultati espressi esclusivamente all'interno di ciascun tessuto. È importante regolare correttamente i parametri di taglio per un'escissione precisa e lo slogaggio dell'area del selettore dal tessuto circostante senza bruciare il bordo della regione selezionata. Con metodi migliorati di purificazione della cromatina e delle proteine e migliorare lo strumento di spettrometria di massa, LCM può essere utilizzato per impianti di studio epigenomici e proteomici specifici del tipo cellulare.
