Supportato in parte da R01NS064593 e R21ES016636 (KV). Microscopia è stata eseguita presso il VCU - Dipartimento di Neurobiologia e Microscopia strumento Anatomia, sostenuta, in parte, con i fondi NIH NINDS-Centro nucleo concessione 5P30NS047463. Il microscopio confocale disco rotante è stato acquistato con un NIH-NCRR premio (1S10RR027957).

A. Preparazione cellulare <ol><li> Normali fibroblasti umani primari (GM02270) sono stati ottenuti da Repository cella Coriell, Camden, New Jersey, e immortalato con hTERT 6. Le cellule sono state coltivate ed espanse in Cellstar 6 centimetri piatti a mezzi (4 ml) costituiti MEM supplementato con 20% siero fetale bovino (GIBCO), non-essential/essential aminoacidi, vitamine, sodio piruvato, e penicillina / streptomicina (HyClone ). </li><li> Rene embrionale umano 293 (HEK293) cellule sono state ottenute dalla American Type Culture Collection e coltivate ed espanse in Cellstar 6 centimetri piatti. Le cellule sono state mantenute in mezzi (4 ml) costituito da DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale, aminoacidi non essenziali, L-glutammina, e penicillina / streptomicina. </li><li> 53BP1 mCherry-(N-Myc-53BP1 PLPC WT-Puro; Addgene plasmide 19.836) e H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene plasmide 17735) gene di fusione costrutti anche esprimere puromicina o geni di resistenza G418, rispettivamente, sono state trasdotte (fibroblam) o transfettate (HEK293) utilizzando Superfect (Qiagene) nelle cellule e mantenuto sotto la selezione dei farmaci. Manutenzione di fluorescenza è stata verificata periodicamente. </li><li> 24-48 ore prima acquisizione dell&#39;immagine, le cellule sono state tripsinizzate in una singola cella di sospensione e seminate ad una densità bassa su 3,5 centimetri lastre FluroDish fondo di vetro. </li></ol> B. Configurazione Microscopio e acquisizione di immagini Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando il cellulare Zeiss Observer microscopio confocale disco SD filatura dotata di uno stand AxioObserver Z1, un doppio canale Yokagawa CSU-X1A unità disco 5000 la filatura, 2 fotometrici QuantEM 512SC telecamere EMCCD, un 120C HXP a base di fibre illuminatore, 4 laser (un Lasos 100mW multi-linea Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm diodo, 40 mW 561 nm diodo, e 30 mW 635 nm diodo), AOTF, un Pecon XL sistema multiS1 fase di incubazione, incubazione Zeiss moduli (Modulo S O 2, CO 2 Modulo S, S TempModule, Riscaldamento unità XL S) e un Priore motorized fase XY con un inserto NanoScanZ piezo Z. Per minimizzare le aberrazioni sferiche mentre le cellule vive di imaging supportato in un mezzo acquoso, un C-Apochromat 63x/1.20 Acqua / Corr lente obiettivo e Zeiss Immersol fluido immersione W (con un indice di rifrazione n = 1,334) sono stati utilizzati. Per 2 canali imaging confocale, una RQFT 405/488/568/647 specchio dicroico e BP525/50 (verde) e BP629/62 (rosso) sono stati utilizzati filtri di emissione. Il software di sistema utilizzato era Zeiss AxioVision (ver. 4.8.2.0) con AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Fisiologia, Mosaix, Mark &amp; ​​Find, doppia fotocamera, interna 4D, autofocus e 3-D moduli di deconvoluzione. <ol><li> Verificare che la CO2 di gas è in esecuzione per il CO 2 modulo del sistema di incubazione. Se il microscopio è supportato da un antivibrante tavolo aria, accendere l&#39;alimentazione dell&#39;aria (o N 2 gas) per la tabella dell&#39;aria. </li><li> Accendere l&#39;alimentazione per il basamento del microscopio, unità disco rotante, macchine fotografiche, i moduli di incubazione, illuminatore HXP, stadio motorizzato, Argonlaser, e il computer. </li><li> Dopo 1 minuto di tempo di riscaldamento, ruotare la chiave di accensione per il laser Argon su &quot;On&quot;. </li><li> Sul pannello di controllo laser Zeiss, attivare gli interruttori per le linee laser da utilizzare. </li><li> Spegnere l&#39;interruttore a bilico per il controller Lasos Argon laser di &quot;stand-by&quot; a &quot;run laser&quot; e regolare il regolatore della luce al livello ottimale (appena al di sotto del punto in cui l&#39;indicatore verde diventa rosso). </li><li> Avviare il software AxioVision. Nota: l&#39;interfaccia utente per AxioVision può essere personalizzato con menu finestre e pull-down che sono specifici per il microscopio particolare e dei componenti che lo controlla. Come tale, ogni sistema ha un&#39;interfaccia potenzialmente unico. Pertanto, le istruzioni generiche per la manipolazione del software sono forniti in fasi successive, piuttosto che indicazioni per le finestre di software specifici, le schede e / o menu a discesa. </li><li> Circa 1 ora prima di imaging, nel software, individuare i controlli per l&#39;incubatrice eaccendere il riscaldamento per la camera superiore e la piastra stadio. Impostare la temperatura a 37 ° C. Accendere la CO 2 di controllo e impostare il livello del 5%. </li><li> Selezionare la lente dell&#39;obiettivo per l&#39;imaging. In questo studio, un NA 63x/1.20 C-Apochromat acqua / Corr lente obiettivo è stato utilizzato. Nota: Per questo obiettivo, un mezzo immersione con un indice di rifrazione simile all&#39;acqua (Zeiss Immersol fluido immersione W) è necessario. </li><li> Se più posizioni sono separati da campionare un lungo periodo di tempo, essere certi di applicare una quantità sufficiente di medie immersione per assicurare che esso venga realizzato da una posizione all&#39;altra. </li><li> Posizionare il piatto sulla scena e portare la lente obiettivo, a contatto con il fondo. </li><li> Utilizzando sia i controlli microscopio o il software, la luce emessa per gli oculari e selezionare l&#39;widefield filtro impostato per il segnale fluorescente di interesse (per questo studio, &quot;Red&quot; filtro impostato per 53BP1 e un &quot;GFP&quot; filtro impostato per H2B ). &lt;/ Li&gt; <li> Guarda attraverso le lenti oculari, fuoco l&#39;immagine, e individuare un opportuno campo delle cellule. </li><li> Utilizzando il software o controlli microscopio, la luce emessa dalla oculari alla porta con l&#39;unità confocale disco che gira. </li><li> Nel software, accendere il laser appropriato (per questo studio, il laser 561 nm per 53BP1 e la 488 linea nm del laser Argon per H2B). </li><li> Per ciascun canale, regolare l&#39;intensità del laser regolando il acusto-ottico sintonizzabile filtro (AOTF) controllo ad un livello appropriato. </li><li> Selezionare lo specchio dicroico appropriato (RQFT 405/488/568/647) e filtri di emissione (BP 629/62 per 53BP1 e Bp 525/50 per H2B). Aprire l&#39;otturatore all&#39;unità disco rotante. </li><li> Selezionare la finestra &quot;Live&quot; per visualizzare il campo di vista corrente. </li><li> Nel software, aprire il controllo &quot;Camera&quot;, selezionare la telecamera da utilizzare (se un sistema di doppia fotocamera) e impostare il tempo di esposizione di circa 100 ms. Regolare il% e EM guadagnare più ncaNota rio:. L&#39;53BP1-mCherry costrutto appare un po &#39;debole. Abbiamo trovato utile per aumentare il guadagno EM. </li><li> Nel software, aprire il controllo per l&#39;unità confocale disco rotante e regolare la velocità di rotazione del disco inserendo il tempo di esposizione della fotocamera che è stato impostato per catturare un&#39;immagine adatta (ad esempio ~ 100 ms). Fare clic su &quot;Set&quot; per bloccare il cambiamento. </li><li> Aprite &quot;multi-dimensionale acquisizione&quot;. Selezionare la scheda di canale e caricare / selezionare i canali appropriati. Per questo studio, stiamo usando i canali definiti per DsRed (561 nm di eccitazione laser e BP 629/62 filtro per le emissioni) e GFP (488 nm linea laser per l&#39;eccitazione e BP525/50 filtro per le emissioni). </li><li> Per garantire la registrazione dell&#39;immagine, uno specchio dicroico comune (RQFT 405/488/568/647) è stato usato per entrambi i canali. Impostare il software per &quot;Autofocus&quot;. Nota: Vai a Strumenti → Impostazioni editor per modificare le impostazioni MDA. Assicurarsi che la potenza del laser adeguata è impostato (&quot;laser di potenza adeguata&quot; si intende un&#39;impostazione che consenteper eccitare il fluoroforo appropriato minimizzando foto-sbiancamento). </li><li> Nella finestra MDA, selezionare la scheda z-stack. Selezionare &quot;Z-stack in posizione del focus corrente&quot;. Impostare l&#39;intervallo di ~ 10 micron Z-Stack e scegliere &quot;ottimale&quot; per il numero di misure per garantire il campionamento di Nyquist con Z. Nota: la dimensione esatta della Z-Stack dipenderà l&#39;altezza delle vostre cellule. Regolare di conseguenza. </li><li> 23. Fare clic su &quot;Start&quot; e analizzare il risultato z-serie di immagini per verificare che le impostazioni siano appropriate per quello che si sta indagando (ad esempio, in questo studio, è stato importante per l&#39;immagine del nucleo intero). </li><li> Selezionare l&#39;opzione &quot;T&quot; (tempo) tab. Per il nostro esperimento con camptotecina, abbiamo impostato l&#39;intervallo tra timepoints imaging per 5 min e la durata complessiva della sessione per 1 ora per un controllo (non trattati cellule) video. Nota: per minimizzare fotometabolismo delle cellule, l&#39;esperimento deve essere configurato in modo tale che l&#39;AOTF sbozzati il ​​laser tra i punti di tempo di imaging. </li><li> Fo più punti di imaging di cellule diverse nel piatto, nella finestra MDA, selezionare la scheda posizione. Assicurarsi che &quot;&#39;impostazione prima / dopo il punto di tempo&#39; Applica per posizione&quot; sia selezionata. Selezionare &quot;Mark_Find&quot;. Utilizzo della vista &quot;Live&quot;, spostare il piatto intorno e selezionare i campi appropriati di vista. </li><li> Fare clic su &quot;Start&quot; nella multidimensionale acquisizione menu per avviare l&#39;esperimento e registrare un video di controllo (di cellule non trattate). </li><li> Dopo il controllo video, aggiungere il trattamento appropriato (in questo caso, camptotecina 10 pM). Abbiamo registrato sperimentale (farmaco cellule trattate) video ad intervalli 5-10 minuti per 2-4 ore. Nota: Un aspetto importante da considerare è la velocità con cui un dato effetto si verifica dopo il trattamento. Come si vede nel video, 53BP1 foci cominciano a da ~ 5 min dopo l&#39;aggiunta della CPT. Anche se un processo relativamente semplice, l&#39;aggiunta di farmaco per il piatto manualmente e ri-calibrazione del microscopio ci vuole tempo. È necessario tenere conto di questo quando si progetta esperimenti. </li><li> Per il monitoraggio mitosis, abbiamo impostato l&#39;intervallo di 7,5 min e registrati per 4-5 ore (le impostazioni specifiche dipendono dalla linea cellulare utilizzato e la lunghezza del suo ciclo cellulare). Rettifiche di valore potrebbe essere necessario essere fatto per evitare che foto-sbiancamento durante registrazioni più lunghe. </li></ol> C. Image Processing and Analysis Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando il software Volocity (PerkinElmer). Il software utilizzato per acquisire questi dati (AxioVision) ha anche la capacità di elaborare e analizzare le immagini. Gli utenti sono incoraggiati a utilizzare il software a loro disposizione, e consultare la documentazione del caso per quanto riguarda la loro applicazione. <ol><li> Aprire il software Volocity. Creare e nominare una nuova libreria, e importare i file video. </li><li> Per visualizzare i file, di solito si trovano più utile usare la &quot;Extended Focus&quot; impostazione. Questo sovrappone i z-stack fette e, per questo protocollo, ci permette di visualizzare 53BP1 focolai in diverse zone del nucleo. </li><li> Regolare i video, se necessario. Volocity è dotato di una serie di strumenti per migliorare la qualità delle immagini acquisite. Garantendo le impostazioni del microscopio erano appropriati, molto tempo possono essere salvati in modifica in seguito. Spesso, è utile deconvolve le immagini, e regolare la luminosità / contrasto. Le vostre esigenze di editing specifici può variare in base dell&#39;esperimento. </li><li> Aggiungi un timbro relativo tempo e barra di scala. </li><li> Per visualizzare le cellule in 3-D, passare alla &quot;3-D opacità&quot; impostazione. Questo consente la rotazione delle cellule resi 3-D nello spazio, fornendo così molteplici prospettive di strutture di interesse all&#39;interno delle cellule. Nota: E &#39;utile visualizzare le cellule su piani diversi per determinare dove le strutture di viaggio interesse. Per esempio, nel &quot;avanzata Focus&quot; impostazione è difficile discernere che il 53BP1 fa, infatti, dissocia dal DNA durante la mitosi. Tuttavia, questo è evidente in 3-D. </li><li> Filmati e immagini fisse possono essere esportati in una varietà di tipi di file in base alle preferenze dell&#39;utente. </l<html> i&gt; </ol> D. Rappresentante Risultati Un esempio di formazione di foci 53BP1 in risposta al CPT è mostrato in Figura 1. Cellule esposte a forma foci CPT entro 5-10 minuti, e mantenere questi focolai tutta la durata della registrazione. Come mostrato in figura 2, 53BP1 dissocia dalla cromatina allo scoppio della mitosi, formando una nebbia sottile intorno cromosomi condensazione. Come telofase si verifica e la mitosi giunge al termine, 53BP1 ancora una volta aggregati in focolai distinti. Mentre le cellule HEK293 non sono stati esposti a CPT, hanno comunque formato abbondante, foci di riparazione spontanea 53BP1 generato dal danno al DNA endogeno. Questa osservazione ci ha permesso di concludere che 53BP1 non forma fuochi durante la mitosi presto, in linea con una precedente relazione che mostra un effetto simile dopo l&#39;esposizione delle cellule a radiazioni ionizzanti e la droga radiomimetici 5. ure 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Camptotecina (10 pM) e provoca DSBs 53BP1 formazione foci in bicicletta fibroblasti entro 30 minuti di aggiunta del farmaco al mezzo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Figura 2. 53BP1 non formare foci durante la mitosi fino telophase/G1 in cellule HEK293.

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	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. 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F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. 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G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mantenimento dell&#39;integrità genomica è fondamentale per la sopravvivenza delle cellule. La mancata conservare i risultati del genoma in invecchiamento precoce, carcinogenesi o morte 8. C&#39;è forte interesse a discernere come funziona il DDR, derivanti dalla sua importanza per la ricerca di base e clinica. Molte tecniche sono state sviluppate nel corso degli anni per aiutare nello studio di come le cellule di rilevare e riparare i danni del DNA. I metodi tradizionali, quali immunocitochimica e Western...

<table border="1"><tbody><tr><td> Prodotto </td><td> Azienda </td></tr><tr><td> Cellstar cultura piatti </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish piatti di vetro con fondo </td><td> Mondo Strumenti di precisione, Inc. </td></tr><tr><td> MEM supporti </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Amminoacidi </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitamine </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Sodio piruvato </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 PLPC WT-Puro; plasmide 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plasmide 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> Superfect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss cellulare Observer SD Imaging sistema </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (versione 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Olio </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity software (versione 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Rotture del doppio filamento (DSB) sono il DNA più deleteria lesioni una cella può incontrare. Se lasciato non riparati, DSB potenziale grande porto per generare mutazioni e aberrazioni cromosomiche 1. Per evitare questo trauma da catalizzare l&#39;instabilità genomica, è fondamentale per le cellule per individuare DSB, attivare la risposta al danno al DNA (DDR), e riparare il DNA. Quando stimolato, il DDR lavora per preservare l&#39;integrità genomica innescando arresto del ciclo cellulare per consentire la riparazione abbia luogo o forzare la cellula a subire apoptosi. I meccanismi predominanti di riparazione DSB avvenire attraverso nonhomologous end-joining (NHEJ) e ricombinazione omologa riparazione (HRR) (recensione in 2). Ci sono molte proteine ​​la cui attività deve essere orchestrato con precisione per la DDR per funzionare correttamente. Qui, si descrive un metodo per 2 - e 3-dimensionale (D) visualizzazione di una di queste proteine, 53BP1. Il p53-binding protein 1 (53BP1) localizza alle aree diDSB legandosi agli istoni modificati 3,4, la formazione di focolai entro 5-15 minuti 5. Le modifiche degli istoni e di assunzione di proteine ​​e di altri 53BP1 DDR a siti DSB si ritiene di facilitare la riorganizzazione strutturale della cromatina intorno alle aree di danno e contribuire alla riparazione del DNA 6. Al di là di partecipazione diretta nella riparazione, altri ruoli sono stati descritti per 53BP1 nella Ddr, quali la regolazione di un intra-S checkpoint, un G2 / M checkpoint, e l&#39;attivazione di proteine ​​a valle DDR 7-9. Recentemente, è stato scoperto che 53BP1 non forma foci in risposta al danno del DNA indotto durante la mitosi, invece attesa cellule a entrare G1 prima localizzazione per la vicinanza DSBs 6. Proteine ​​DDR come 53BP1 sono stati trovati per associare strutture mitotiche (come cinetocori) durante la progressione attraverso la mitosi 10. In questo protocollo si descrive l&#39;uso di 2 - e 3-D imaging cellule vive per visualizzarela formazione di foci 53BP1 in risposta al danno del DNA agente camptotecina (CPT), così come il comportamento 53BP1 durante la mitosi. Camptotecina è un inibitore della topoisomerasi I che causa principalmente DSBs durante la replicazione del DNA. Per fare questo, abbiamo utilizzato un precedentemente descritto 53BP1-mCherry proteina di fusione fluorescente costruire costituito da un dominio 53BP1 proteina in grado di legare DSB 11. Inoltre, abbiamo utilizzato un istone H2B-proteina di fusione GFP fluorescente costrutto in grado di monitorare la dinamica della cromatina durante il ciclo cellulare, ma in particolare durante la mitosi 12. Imaging cellulare Live in molteplici dimensioni è un ottimo strumento per approfondire la nostra comprensione della funzione delle proteine ​​DDR nelle cellule eucariotiche.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione di un DNA a doppio filamento proteina pausa segnalazione attivato in risposta al danno del DNA e la sua localizzazione durante la mitosi.

Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  Virginia Commonwealth University. Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione di un DNA a doppio filamento proteina pausa segnalazione attivato in risposta al danno del DNA e la sua localizzazione durante la mitosi.

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Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabbricazione di chip di dimensioni Ponteggi per tridimensionale coltura cellulare

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Ricerca

Biologia

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l&#39;imaging cellulare dal vivo

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli oociti

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D Imaging di aggregazione proteica in cellule vive

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La manipolazione delle vie di segnalazione e tridimensionale Imaging in diretta di Sviluppo del villo

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging in idrogel tridimensionali

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine danno al DNA di risposta

Riepilogo

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Microfabbricazione di chip di dimensioni Ponteggi per tridimensionale coltura cellulare

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

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Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine di fusione per l'imaging cellulare dal vivo

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Vivo Imaging delle proteine GFP-etichettati in

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Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per

FRET Imaging in idrogel tridimensionali

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