Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno del NIH (NS047073 a HJC). Anche noi siamo grati a Caterina Kehl per lei i primi esperimenti con Kwik-Sil, che ci ha incoraggiato ad usarlo per la nostra applicazione.

1. Elettrodo Fabrication <ol><li> Per creare l&#39;elettrodo, usare le forbici per tagliare un pezzo di smalto rivestite 0.001 pollici filo di acciaio inox del diametro di circa 2 metri di lunghezza. Allegare una pallina di gomma pane a ciascuna estremità del filo, piegare il filo a metà, e far girare le estremità per creare un doppino, chiamato elettrodo differenziale. </li><li> Nastro entrambe le estremità del filo per evitare svelare. Fare quattro elettrodi differenziale, utilizzando un nastro di colore diverso per ogni elettrodo differenziale a scopo di identificazione (Figura 1A). </li><li> Twist due elettrodi differenziale insieme, lasciando due centimetri non torti da una parte e 1 pollice su l&#39;altra estremità. Ripetere con la coppia di elettrodi rimanenti differenziale (Figura 1B). </li><li> Twist entrambe le serie di due elettrodi differenziale insieme, facendo in modo che le estremità rimangono torti. Tenere il gruppo elettrodi in silicone e applicare la colla casa all&#39;incrocio dei quattro elettrodi differenziale, lasciando l&#39;estremità libere. Hang e consentire la colla per asciugare per almeno 4 ore (Figura 1C). </li><li> Per isolare i rami, giaceva il gruppo elettrodi su un piatto, mobile, tale superficie un pezzo di legno. Si aprono a ventaglio le estremità e fissarli con nastro adesivo. Utilizzare un piccolo pezzo di plastica per elevare il gruppo elettrodi appena prima che i rami, e sicuro che con il nastro. </li><li> In un microscopio da dissezione, utilizzare pinze per rivestire i rami con la colla al silicone. Le estremità lunga da 1 pollice sarà dentro l&#39;animale, per cui dovrebbero avere uno strato molto sottile di colla. Lasciare asciugare la colla per almeno 3 ore. </li><li> Accorciare la 1-pollice lungo termine di un elettrodo differenziale a due centimetri. Su ogni filo, togliere 1 cm di silicone e smalto. Curl un filo nudo in un gancio per la registrazione. Piegare l&#39;altro filo in alto e lontano dal gancio, questo servirà come il filo di terra. Ripetere l&#39;operazione per i rimanenti tre elettrodi. </li><li> Selezionare uno dei quattro elettrodi sul fine da 2 pollici. Usare pinze per raschiare silicone e smalto fuori, esponendo 1 cm di nudo filo di acciaio inossidabile su ciascuno dei 2 fili. Saldare un connettore d&#39;oro a ciascuno dei due fili. Usare un pezzo di nastro di laboratorio per assicurare la fine e di mantenere una separazione tra il suolo ed i perni di registrazione. Ripetere l&#39;operazione per i rimanenti tre elettrodi. </li><li> Collegare un 1-2cm sfera della colla di silicone al cavo, a circa 1,5 cm dalla fine gancio per fissare gli elettrodi dentro l&#39;animale. Lasciare asciugare per almeno un&#39;ora (Figura 1D). <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Dell&#39;Assemblea Fabrication elettrodi. (A) elettrodo differenziale singola costituita da un filo piegato e intrecciato con la sua estremità fissato con nastro adesivo. (B) Due elettrodi differenziale intrecciati insieme, lasciando spazio torti alle estremità. Diverse nastro colorato o un altro contrassegno deve essere utilizzato per identificare le estremità. (C) Tutti gli elettrodi differenziale quattro combinati in un singolo gruppo elettrodi formando un unico cavo, con sedi distaccate degli elettrodi individuali su ciascuna estremità, indicati con colori diversi di nastro. (D) forma finale del gruppo elettrodi. Sulla sinistra, ci sono arricciate ganci per le registrazioni e fili di terra per ogni elettrodo differenziale. Sulla destra, pin del connettore d&#39;oro sono stati saldati i fili per la connessione all&#39;amplificatore. Una palla di ancoraggio del silicone colla è stato anche collocato verso il lato sinistro del gruppo. </li></ol> 2. Preparazione di animali per l&#39;impianto <ol><li> Selezionare un animale sano che pesa circa 350-450g. In risposta a piccoli pezzi di alghe, l&#39;animale deve generare morsi ad intervalli da 3 a 5 secondi. L&#39;intervento completo di impianto di elettrodi dovrebbe durare circa un&#39;ora. </li><li> Per anestetizzare l&#39;animale, si iniettano con il 30% w / v isotonica MgCl 2. Per evitare la perdita di emolinfa e MgCl 2, il sito di iniezione possono essere rivestiti in supercolla prima di rimuovere l&#39;ago. <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Schema che mostra come l&#39;animale è appuntata per l&#39;impianto di elettrodi, e la posizione della ferita (indicato da una barra). </li><li> Lay anestetizzato l&#39;animale in un vassoio dissezione con il suo piede. Di fronte alla testa di animale in poi, spostare l&#39;area di branchie alla vostra sinistra tale che l&#39;animale è parzialmente su un fianco, appoggiato distanza. Definire con precisione i tentacoli anteriori (Figura 2). </li><li> Collocare il vassoio sul palco di un microscopio da dissezione. Sostenere il vassoio in un angolo di circa 20 gradi di elevare la testa e raccogliere il emolinfa nella coda, lontano dalla incisione. </li><li> Dissezione con forbici, avviare una incisione leggermente a destra del eyespot ed estenderlo da 1 a 1,5 centimetri anteriormente. Usa divaricatori attaccato ai bordi del vassoio per tenere aperta l&#39;incisione (Figura 2; bar vicino nota incisione eyespot indicazione). </li><li> Per esporre la massa buccale, utilizzare pinze per sollevare la membrana trasparente sottola pelle e usare le forbici per tagliare un&#39;apertura corrispondente l&#39;incisione principale. Rimboccare i bordi della membrana in divaricatori. </li></ol> 3. L&#39;impianto di elettrodi <ol><li> Posizionare il gruppo elettrodi su un micromanipolatore e spostarlo sopra incisione dell&#39;animale. </li><li> Il nervo radular è più difficile da accedere, e dovrebbe essere affrontata prima. Ci sono due opzioni per l&#39;accesso al nervo radular. </li><li> La prima opzione, che è preferibile, è di guardare sotto il ganglio buccale tra BN1 e BN2. Se un ramo del nervo radular è visibile, utilizzare punta fine pinze piegato in un gancio per sollevare il ramo (Figura 3, ciclo di RN sotto ganglio etichettati 1). </li><li> Se un ramo del nervo radular non è accessibile al di sopra del muscolo, una seconda opzione è quella di accedervi tramite una piccola incisione in I2 accanto al tessuto connettivo alla base del ganglio vestibolare (Figura 3, RN sotto muscolare etichettati 2). L&#39;incisione in I2 deve passare attraverso due strati del muscolo I2. Tenere su il bordo del muscolo incisione con una pinza dritta e usare il forcipe agganciato per tirare fuori un ramoscello di RN. </li><li> Tenendo premuto il nervo con le pinze agganciato, utilizzare un diverso set di pinze per manipolare il gancio elettrodo sul nervo. </li><li> Utilizzare il micromanipolatore per sollevare il gancio in modo che il nervo viene innalzato dalla massa buccale chiara e precisa dei nervi o altri tessuti. Non estendere il nervo. </li><li> Asciugare l&#39;elettrodo con un Kim-Wipe o aspirazione fuori il liquido in eccesso con una siringa. Tensione dell&#39;acqua può causare il coraggio di crollare su se stesso, o un sigillo d&#39;acqua per formare sotto il nervo. In entrambi i casi, l&#39;area deve essere completamente asciutta prima di colla è applicata. </li><li> Applicare una goccia di colla dove la base del gancio è in contatto con la parte inferiore del nervo. Applicare una goccia di soluzione fisiologica o Aplysia emolinfa per impostare la supercolla. Quando la colla è niente di bagnato dovrebbe essere spostato come ottenere collante tra il filo ed il nervo avrebbe bloccato il collegamento elettrico. </li><li> Secco il gancio di nuovo. Mix Kwik-Sil colla su un impacco di ghiaccio. </li><li> Usare la punta di uno spillo di applicare una piccola quantità di Kwik-Sil colla, ricoprendo completamente qualsiasi filo esposto del gancio, ma non il filo di terra. </li><li> Lasciare che la colla da impostare per circa 5 minuti, riaggiustare la colla se si tira fuori dalle sezioni del gancio. La colla è impostato quando si attacca più al tatto con il perno (Figura 4 mostra la configurazione finale). </li><li> Una volta che l&#39;elettrodo nervo radular è impostato, il muscolo I2 è possibile accedere. Nella zona tra BN1 e BN2, usare il forcipe agganciati al gancio e per separare due fasce del muscolo I2 dal resto del muscolo tirando delicatamente le bande verso l&#39;alto. Collegare l&#39;elettrodo con la stessa procedura. </li><li> Nervi buccale 2 e 3 sono facilmente accessibili e gli elettrodi sono collegati con la stessa procedura. </li><li> Una volta che tutti gli elettrodi sono collegati, far scorrere il gruppo elettrodi in l&#39;animale fino alla ancoraggio silicone. </li><li> Sutura l&#39;incisione chiuso intorno al cavo elettrodo sporgente, mantenendo l&#39;ancora dentro l&#39;animale. Supercolla i punti per garantire una buona tenuta. </li><li> Inserire le punte d&#39;oro connettore all&#39;altra estremità dell&#39;elettrodo in un piccolo blocco di polistirolo. Rispedire l&#39;animale verso il serbatoio principale in un contenitore aerato isolamento per il pernottamento di recupero. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Uno schema dell&#39;apparato di alimentazione Aplysia conosciuta come la massa buccale. Vengono mostrati i nervi buccale (BN1, BN2, BN3), il nervo radular (RN) che esce dal fondo del ganglio buccale, poi si tuffa sotto il muscolo, e la posizione sul muscolo I2 cui è collegato l&#39;elettrodo. <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Schema di singolo elettrodo collegato ad un nervo (o muscolare) e incollate in posizione. Si noti che il de-isolata regione del gancio arricciata è in contatto diretto con il nervo (o muscolare), ancorata in posizione con colla, e isolati elettricamente dal mezzo liquido con Kwik-Sil. Si noti inoltre che la punta deinsulated dell&#39;elettrodo di massa è esposto al mezzo fluido. 4. Registrazione <ol><li> Acclimatare l&#39;animale in un contenitore aerato, mentre collegato l&#39;apparecchio di controllo per almeno 1,5 ore. Monitorare il segnale, mentre l&#39;animale è acclimatando per verificare che tutti gli elettrodi sono di lavoro e che i livelli di rumore sono bassi. </li><li> Utilizzare una videocamera per registrare il comportamento alimentare durante l&#39;uso del computer per registrare i segnali dagli elettrodi neurali e muscolari. Sincronizzare i video e le registrazioni degli elettrodi utilizzando un segnale onda quadra che controlla un contatore digitale in vista della telecamera mentre si è contemporaneamente registrato come un canale aggiuntivo sul computer in Axoscope. </li><li> Alimentazione comportamenti sono suscitato dalle tecniche dedescritto nel Morton e Chiel 1993. </li></ol> Anche se gli animali invertebrati non richiedono l&#39;approvazione formale da parte di un uso animale e del comitato istituzionale di cura, ci siamo assicurati che tutti i trattamenti di Aplysia minimizzare i danni e sofferenze agli animali, e che tutte le tecniche chirurgiche sono fatto mentre l&#39;animale è completamente anestetizzato. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. (A) le registrazioni simultanee a quattro canali da un muscolo (il muscolo goniometro I2), e da tre nervi buccale (il nervo radular, RN, nervo buccale 2, BN2, e del nervo vestibolare 3, BN3) durante una risposta deglutizione. (B) Un fermo immagine dal video registrazione simultanea degli animali liberamente comportarsi come ingoia una striscia di alga pretagliate (0,5 cm di larghezza), che è stato segnato a intervalli di 0,5 cm con fasce bianche in modo che i suoi movimenti possono essere facilmente visualizzati come Si nutre.

<ol>
	<li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia.">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).</li><li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia.">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).</li><li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+chronic+single+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes.">A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).</li><li>Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nbsp;Neuromechanics+of+multifunctionality+during+rejection+in+Aplysia+californica.">nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica.</a> J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).</li></ol>

Una innovazione fondamentale che ha fatto queste registrazioni di successo sta combinando gli elettrodi in un unico cavo. Due registrazioni elettrodi sono stati usati in precedenza, ma l&#39;espansione a quattro elettrodi individuali ha portato alla formazione di aderenze chirurgiche che spesso impedito all&#39;animale di fare movimenti di alimentazione normale. Combinando gli elettrodi in un cavo di ridurre la maggior parte degli elettrodi dentro l&#39;animale, che a sua volta riduce la risposta immunitaria e permette ...

<table><tbody><tr><td>Enamel coated stainless steel wire</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>0.001D, coating h</td></tr><tr><td>Household Silicone II Glue</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Sil Adhesive</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duro Qwik-Gel superglue</td><td>Henkel Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-M Systems model 1700 amplifier</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle</td></tr><tr><td>Axoscope 10.1</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gold Connector Pins</td><td>Bulgin</td><td>SA3148/1</td><td></td></tr><tr><td>Gold Connector Sockets</td><td>Bulgin</td><td>SA3149/1</td><td></td></tr></tbody></table>

electrode fabrication and implantation in aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals

Registrazione da nervi e muscoli chiave di<em&gt; Aplysia</em&gt; Durante comportamento alimentare ci permette di studiare i modelli di controllo neurale in un animale intatto. Contemporaneamente la registrazione da nervi e muscoli più ci dà informazioni precise sui tempi di attività neurale. Metodi di registrazione precedente hanno lavorato per due elettrodi, ma lo studio dei nervi o dei muscoli necessari ulteriori combinando e la media delle registrazioni degli animali multiple, che ha reso difficile determinare dettagli di tempi e graduale, a causa della variabilità di risposta alla risposta, e da animale ad animale. L&#39;impianto di quattro elettrodi individuo ha un tasso di successo molto bassa a causa della formazione di aderenze che impediscono di compiere movimenti animali normale alimentazione. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo di fabbricazione di elettrodi che riduce la maggior parte degli elettrodi all&#39;interno dei movimenti degli animali, affinché per l&#39;alimentazione normale. Utilizzando una combinazione di colle per attaccare i risultati elettrodi in un isolamento più affidabile dell&#39;elettrodo che dura più a lungo, rendendo possibile la registrazione per periodi fino a una settimana. La tecnica di fabbricazione che descriviamo potrebbe essere esteso per incorporare diversi elettrodi supplementari e sarebbero applicabili agli animali vertebrati.

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Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Una tecnica è descritta per impiantare quattro<em&gt; In vivo</em&gt; Elettrodi per monitorare il controllo neuromuscolare del comportamento alimentare in<em&gt; Aplysia californica</em&gt;.

Fabbricazione e impianto di elettrodi nel Aplysia californica Per registrazioni multi-canale neurale e muscolare in intatto, Animali liberamente Comportarsi

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

13.0K Views.  Case Western Reserve University. Una tecnica è descritta per impiantare quattro In vivo Elettrodi per monitorare il controllo neuromuscolare del comportamento alimentare in Aplysia californica.

Video: Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Su larga scala di registrazione dei neuroni da sonde mobili in silicio Comportarsi Roditori

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Ricerca

Neuroscienze

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

Alisia Preparazione ganglia per analisi elettrofisiotiche e molecolari di singoli neuroni

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Bioingegneria

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

I cambiamenti di monitoraggio della concentrazione di calcio intracellulare ed efficacia Synaptic nel Mollusco<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

Un<em&gt; In Vitro</emPreparazione&gt; per stimolare e registrare i programmi motori Nutrire con i movimenti fisiologici in<em&gt; Aplysia californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellulare Identificazione neuroni motori per un pool di motore muscolare in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Una procedura per l&#39;impianto Array organizzata di microfili per Recordings singola unità di Awake, Comportarsi Animali

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. Development of these tools is crucial for understanding complex behaviors and cognition and for advancing clinical applications. However, it remains a challenge to densely record from cell populations stably and continuously over long time periods. Many popular electrodes, such as tetrodes and silicon arrays, feature large cross-diameters that produce damage upon insertion and elicit chronic reactive tissue responses associated with neuronal death, hindering the recording of stable, continuous neural activity. In addition, most wire bundles exhibit broad spacing between channels, precluding simultaneous recording from a large number of cells clustered in a small area. The carbon fiber microelectrode arrays described in this protocol offer an accessible solution to these concerns. The study provides a detailed method for fabricating carbon fiber microelectrode arrays that can be used for both acute and chronic recordings in vivo. The physical properties of these electrodes make them ideal for stable and continuous long-term recordings at high cell densities, enabling the researcher to make robust, unambiguous recordings from single units across months.

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

This protocol describes a procedure for constructing carbon fiber microelectrode arrays for chronic and acute in vivo electrophysiological recordings in mouse (Mus musculus) and ferret (Mustela putorius furo) from multiple brain regions. Each step, following the purchase of raw carbon fibers to microelectrode array implantation, is described in detail, with emphasis on microelectrode array construction.

Costruzione e implementazione di array di microelettrodi in fibra di carbonio per registrazioni in vivo croniche e acute

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...

Un sistema di impianto di sonde economico e versatile per l'elettrofisiologia nei topi

The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice

Chronic electrophysiological recordings in rodents have significantly improved our understanding of neuronal dynamics and their behavioral relevance. However, current methods for chronically implanting probes present steep trade-offs between cost, ease of use, size, adaptability, and long-term stability.
This protocol introduces a novel chronic probe implant system for mice called the DREAM (Dynamic, Recoverable, Economical, Adaptable, and Modular), designed to overcome the trade-offs associated with currently available options. The system provides a lightweight, modular and cost-effective solution with standardized hardware elements that can be combined and implanted in straightforward steps and explanted safely for recovery and multiple reuse of probes, significantly reducing experimental costs.
The DREAM implant system integrates three hardware modules: (1) a microdrive that can carry all standard silicon probes, allowing experimenters to adjust recording depth across a travel distance of up to 7 mm; (2) a three-dimensional (3D)-printable, open-source design for a wearable Faraday cage covered in copper mesh for electrical shielding, impact protection, and connector placement, and (3) a miniaturized head-fixation system for improved animal welfare and ease of use. The corresponding surgery protocol was optimized for speed (total duration: 2 h), probe safety, and animal welfare.
The implants had minimal impact on animals&#39; behavioral repertoire, were easily applicable in freely moving and head-fixed contexts, and delivered clearly identifiable spike waveforms and healthy neuronal responses for weeks of post-implant data collection. Infections and other surgery complications were extremely rare.
As such, the DREAM implant system is a versatile, cost-effective solution for chronic electrophysiology in mice, enhancing animal well-being, and enabling more ethologically sound experiments. Its design simplifies experimental procedures across various research needs, increasing accessibility of chronic electrophysiology in rodents to a wide range of research labs.

Autore in primo piano: Comprensione del calcolo neuronale naturalistico attraverso la realtà virtuale e l'elettrofisiologia negli animali

Here, we introduce a lightweight, cost-effective probe implant system for chronic electrophysiology in rodents optimized for ease of use, probe recovery, experimental versatility, and compatibility with behavior.

L'impianto DREAM: un sistema implantare leggero, modulare ed economico per l'elettrofisiologia cronica in topi con testa fissa e a comportamento libero

Chronic electrophysiological recordings in rodents have significantly improved our understanding of neuronal dynamics and their behavioral relevance. ...

Fabbricazione e impianto di elettrodi nel Aplysia californica Per registrazioni multi-canale neurale e muscolare in intatto, Animali liberamente Comportarsi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Su larga scala di registrazione dei neuroni da sonde mobili in silicio Comportarsi Roditori

Alisia Preparazione ganglia per analisi elettrofisiotiche e molecolari di singoli neuroni

I cambiamenti di monitoraggio della concentrazione di calcio intracellulare ed efficacia Synaptic nel Mollusco

Un

Extracellulare Identificazione neuroni motori per un pool di motore muscolare in

Isolamento dei neuroni sensoriali

Una procedura per l'impianto Array organizzata di microfili per Recordings singola unità di Awake, Comportarsi Animali

Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

Costruzione e implementazione di array di microelettrodi in fibra di carbonio per registrazioni in vivo croniche e acute

L'impianto DREAM: un sistema implantare leggero, modulare ed economico per l'elettrofisiologia cronica in topi con testa fissa e a comportamento libero