Questo lavoro è stato sostenuto dalla Israel Science Foundation.

I. La progettazione di un sistema di espressione per il tipo di lievito per DJ III Calibrazione di un sistema appropriato di lievito per l&#39;espressione del III tipo effettore (s) di interesse è un compito importante e può richiedere alcuni tentativi ed errori. Fattori che rivestono un&#39;importanza fondamentale da prendere in considerazione quando si progetta e ottimizzato un tale sistema sono: 1) il promotore di guida espressione del effettrici (s), 2) il numero di copie del gene effettore, 3) il tag epitopo utilizzati per verificare l&#39;espressione della proteina , e 4) il ceppo di lievito. 1) Promotore A causa batterica di tipo III effettori possono essere tossici per le cellule di lievito, un promotore inducibile deve essere utilizzato per controllare la loro espressione. Il promotore GAL1 è comunemente usato per questo scopo e la sua attività è regolata dalla fonte di carbonio presente nel terreno di coltura: è repressa da glucosio e galattosio indotta da. Tuttavia, questo promotore è stato segnalato come un po &#39;che perde in condizioni di reprimere con conseguente tossicità indesiderati. Se un problema analogo si riscontra, è consigliabile ridurre al minimo il numero di copie del gene effettore come descritto di seguito, o per usare promotori inducibili alternative, come il MET3 o CUP1 promotori 1. Qui si descrivono le modalità per l&#39;espressione delle proteine ​​effettrici da un galattosio-promotore inducibile. 2) Gene copia-numero Un ulteriore parametro che incidono sul livello di espressione della proteina è il numero di copie del gene effettore presenti nella cellula. Elevati livelli di espressione si ottengono quando il gene effettore è approvata a 2-micron plasmide (40-60 copie per cellula). Espressione intermedio è ottenuta utilizzando un centromero contenenti plasmide (1-3 copie per cellula), mentre la bassa espressione si ottiene quando il gene effettore è integrato nel genoma del lievito per ricombinazione omologa. Grazie alla combinazione di un centromero contenenti vettore e promotore GAL1 che abbiamo espresso con successo circa 50 effettori della patogeni delle piante Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria e Pseudomonas syringae pv. Pomodoro a livelli rilevabili mediante analisi immunoblot e con perdite trascurabili in condizioni di repressione (Salomon e Sessa , inedito). 3) epitopi tag Se gli anticorpi contro l&#39;effettore di interesse non sono disponibili, un tag epitopo è fusa alla proteina effettore di monitorare la sua espressione da immunoblot. Tag più utilizzati sono Myc, emoagglutinina (HA) o Bandiera, al quale affidabile anticorpi commerciali sono disponibili. Ti consigliamo di utilizzare una sola copia del tag per minimizzare indesiderati effetti deleteri sulla struttura e sull&#39;attività delle proteine ​​effettrici. 4) ceppo di lievito Un requisito fondamentale per il ceppo di lievito da utilizzare per l&#39;espressione è auxotrophy al marcatore del vettore di espressione. E &#39;importante notare che diversi ceppi di lievito possono visualizzare diverse sensibilità di espressione di alcuni effettori. Per esempio, abbiamo osservato che i ceppi BY4741 e W303 hanno sensibilità diverse a diverse Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria effettori (Salomon e Sessa, inedito). Pertanto, è preferibile testare la effettrici (s) di interesse in diversi ceppi di lievito. II. Preparazione dei supporti di lievito Per la crescita di ceppi di lievito che non contengono vettoriale, utilizzare YPD (10 g / l estratto di lievito, 20 g / L peptone e 2% [w / v] glucosio) come mezzo di crescita. Per i mezzi solidi, aggiungere 2% [w / v] agar alla soluzione (se il terreno solido è molto morbido, aggiungere 0,05% [v / v] da uno stock soluzione al 5 N NaOH al mezzo prima di autoclave). Si consiglia di preparare il mezzo senza glucosio nel 90% del volume finale e la sterilizzazione in autoclave. Poco prima dell&#39;uso, riempire il volume al 100% con un filtro-sterilizzata il 20% [w / v] una soluzione di glucosio (conservare la soluzione di glucosio al 20% a 4 ° C per prevenire la contaminazione). Per la crescita di ceppi di lievito contenente un vettore che fornisce prototrophy ad un marcatore (leucina, uracile, istidina o triptofano), l&#39;uso sintetico drop-out medio senza leucina, uracile, istidina e triptofano (6,7 g / L di azoto base di lievito senza aminoacidi , 1,4 g / L di lievito sintetico drop-out supplemento media) e contenente il 2% [w / v] glucosio, o al 2% [w / v] galattosio e 1% [w / v] raffinosio. Per i mezzi solidi, aggiungere 2% [w / v] agar alla soluzione. Si consiglia di preparare il medio nel 90% del volume finale e la sterilizzazione in autoclave. Poco prima dell&#39;uso, riempire il volume al 100% con un filtro-sterilizzato soluzione di glucosio al 20%, o di galattosio, sterilizzata per filtrazione raffinosio soluzione al 20% + 10%, a seconda della fonte di carbonio desiderata (mantenere il glucosio al 20% e il 20% galattosio + soluzioni raffinosio 10% a 4 ° C per prevenire la contaminazione). A seconda del marcatore del vec espressionetor, aggiungere gli altri amminoacidi o uracile prima dell&#39;uso (10 ml / l da un 1 g/100 ml di leucina stock, 10 ml / l da un magazzino 200 mg/100 ml uracile, 2 ml / l da un 1 g/100 ml di brodo istidina, o 2 ml / l da un magazzino 1 g/100 ml triptofano). Nel preparare scorte di leucina e uracile, li sterilizzare in autoclave e tenere a temperatura ambiente. Nel preparare le scorte istidina e triptofano, li sterilizzare filtrando, avvolgere la bottiglia con un foglio di alluminio per proteggere dalla luce, e mantenere a 4 ° C. Nelle procedure descritte di seguito, sintetico drop-out medio integrato con leucina, uracile, istidina e triptofano è designato come sintesi terreno completo. Solido-media piastre possono essere conservate per un massimo di due mesi a 4 ° C. Prima dell&#39;uso, a secco le piastre per 20 minuti in una cappa a flusso laminare sterile a temperatura ambiente. III. Trasformazione di lievito <ol><li> Prima di iniziare la procedura di trasformazione lievito, preparare le seguenti tre soluzioni: il 50% [w / v] polietilene glicole (PEG) 3350 soluzione, un M 1 LIAC pH = 8.0, e una soluzione TE (100 mM Tris pH = 6.85 e 10 mM EDTA pH = 8,0). Filtro-sterilizzare le soluzioni e tenere a 4 ° C. </li><li> Utilizzando una lunga asta di legno o un ansa da inoculo sterile, scegliere una colonia di lievito (1-2 mm di diametro) da un piatto fresco e inoculare 3 ml di YPD in un tubo di polipropilene da 15 ml. Vortex brevemente. Posizionare il tubo di cultura in un rullo e incubare una notte a 30 ° C con rotazione costante. </li><li> Al mattino, rimuovere la cultura dal rullo e centrifugare a 800 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, rimuovere completamente il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di tampone risospensione (10% [v / v] TE soluzione, il 10% [v / v] 1 M soluzione LIAC) e mescolare con il vortex. </li><li> Per ogni plasmide ad essere trasformata e una trasformazione ulteriore controllo, il trasferimento di 100 l di sospensione cellulare ad un microprovette. </li><li> Per ogni tubo, aggiungere 5 ml di DNA a singolo filamento di sperma di salmone (10 mg / ml) e 250-500 ng di DNA plasmidico da trasformare (ad eccezione della provetta di controllo). </li><li> Aggiungere con cautela ad ogni tubo di 650 microlitri di soluzione di trasformazione (10% [v / v] TE soluzione, il 10% [v / v] 1 M soluzione LIAC, 80% [v / v] del 50% [w / v] soluzione di PEG ) e vortice. </li><li> Incubare a 30 ° C per 30 minuti su un rullo. </li><li> Rimuovere i tubi dal shaker, aggiungere 70 ml di DMSO, e mescolare invertendo i tubi di 10-15 volte (non vortice per evitare di rompere le cellule). </li><li> Porre i tubi in un 42 ° C preriscaldata bagnomaria e incubare per 15 min. </li><li> Rimuovere i tubi dal bagnomaria e subito metterli in ghiaccio per 2 minuti. </li><li> Una volta che i tubi si sono raffreddati, li centrifugare a 800 g per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Prendete i tubi della microcentrifuga e rimuovere con attenzione il sopranatante viscoso con una pipetta. </li><li> Risospendere il pellet di cellule di ogni tubo in 150 ml di acqua sterile bidistillata (DDW), e diffondere la sospensione cellulare su un piatto sintetico terreno completo contenente il 2% di glucosio come fonte di carbonio e senza l&#39;aminoacido o nucleotidi a cui il plasmide fornisce prototrophy. </li><li> Lasciare le piastre aperto per 2 minuti e permettere loro di asciugare in una cappa a flusso laminare. Posizionare le piastre in un incubatore a 30 ° C per 2-3 giorni. </li><li> Una volta che le colonie (1-2 mm di diametro) sono apparsi sui piatti, raccogliere circa 10 singole colonie da ogni trasformazione e di trasferirli in un piatto fresco. Quando si trasferiscono le colonie, fare 2 cm x 2 cm patch per permettere la crescita di una grande quantità di cellule di lievito. Incubare le piastre in un incubatore a 30 ° C per due giorni. </li><li> Quando le patch lievito sono cresciuti, rimuovere le piastre dal termostato e sigillare con parafilm. Piastre possono essere conservati a 4 ° C. Trasferimento colonie su una piastra fresco ogni 10-14 giorni. </li></ol> IV. Preparazione di una proteina Estratto di lievito per verificare Espressione Effettistica da Immunoblot <ol><li> Scegli una colonia di lievito (1-2 mm di diametro) da un piatto fresco ad un tubo in polipropilene da 15 ml contenente 3 ml di appropriati terreno sintetico completo integrato con il 2% di glucosio come fonte di carbonio e senza l&#39;aminoacido o nucleotidi a cui il plasmide di scelta fornisce prototrophy. Posizionare il tubo di cultura in un rullo e incubare una notte a 30 ° C. </li><li> Nel giorno seguente, togliere la cultura dal rullo e centrifugare a 800 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere i tubi dalla centrifuga e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 3 ml di DDW sterile e mescolare nel vortex. </li><li> Centrifuga di nuovo, scartare le cellule surnatante e risospendere in 3 ml di DDW sterile. </li><li> Trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in un nuovo tubo 15 ml contenente 3 ml di terreno completo sintetico integrato con il 2% e 1% galattosio raffinosio come fonte di carbonio, e senza l&#39;aminoacido o nucleotidi a cui il plasmide di scelta fornisce prototrophy.Mescolare nel vortex, posto in un rullo, e incubare una notte a 30 ° C. </li><li> Al mattino seguente, trasferire 1 ml della cultura (o più per le culture a bassa densità) ad un microprovette. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 800 g per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Da qui in poi, il lavoro in una cappa aspirante per evitare di inalare β-mercaptoetanolo vapori tossici. Rimuovere con attenzione il sopranatante con una pipetta e risospendere il pellet cellulare in 100 ml di soluzione ghiacciata lisi (4% [v / v] 5 N NaOH, 0,5% [v / v] β-mercaptoetanolo). Mescolare vigorosamente nel vortex e incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione, determinare il volume di HCl (6 N) richiesto per la titolazione 100 l di tampone di lisi a pH 9-10. A questo scopo, versare 10 microprovette in un microlitri 100 rack e trasferimento del tampone di lisi in ciascuno di essi. Aggiungi vari volumi (1-10 microlitri) di HCl (6 N) per ciascuna provetta e mescolare nel vortex. Prelevare un campione e controllare il pH della soluzione con una striscia indicatore di pH. </li><li> Al termine della incubazione, aggiungere il volume di HCl determinata nel passaggio precedente al lisato e mescolare nel vortex (per una migliore accuratezza, la soluzione di HCl posto sul lato del tubo senza inserire la punta nel lisato). </li><li> Aggiungere 50 ml di tampone campione 3x (30% [v / v] glicerolo, il 15% [v / v] β-mercaptoetanolo, il 37,5% [v / v] 500 mM Tris-HCl pH = 6,8, 0,15% [w / v ] di sodio dodecil solfato [SDS] e qualche grano di blu di bromofenolo) al lisato e mescolare nel vortex (se la soluzione diventa gialla, significa che il pH è troppo basso, e un paio di microlitri di soluzione lisi dovrebbero essere aggiunti fino a quando la soluzione diventa blu). </li><li> Far bollire la soluzione lisato per 5 minuti su un blocco di riscaldamento dopo fora un buco nella copertura del microtubo con un ago. </li><li> Rimuovere il microtubo dal blocco di riscaldamento e consentire la soluzione di raffreddamento per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Vortex la soluzione lisato e poi spin down per 10 sec. 30 microlitri di carico su un gel SDS-PAGE per l&#39;analisi immunoblot. </li></ol> V. Spotting analisi per rilevare Effettistica indotta Fenotipi inibizione della crescita <ol><li> Da un piatto fresco prendere una colonia di lievito (1-2 mm di diametro) che trasportano l&#39;espressione plasmide di interesse e inoculare in un tubo da 15 ml in polipropilene, 3 ml di terreno completo sintetico integrato con il 2% di glucosio come fonte di carbonio e senza l&#39;aminoacido acido o nucleotidi a cui il plasmide di espressione fornisce prototrophy. Ripetete la stessa procedura per un ceppo di lievito di controllo che trasporta un plasmide vuoto. Posizionare i tubi di cultura in un rullo e incubare una notte a 30 ° C con rotazione costante. </li><li> Nel giorno seguente, togliere le culture dal rullo e centrifugare a 800 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere i tubi dalla centrifuga e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 3 ml di DDW sterile e mescolare nel vortex. </li><li> Ripetere la fase di centrifugazione e risospendere le cellule in 3 ml di DDW sterile. </li><li> Per determinare la loro densità ottica (OD), trasferire 100 ul di ogni cultura ad un microprovette contenente 900 microlitri DDW e vortice. Versare il contenuto dei tubi in una cuvetta di plastica e misurare l&#39;assorbanza alla lunghezza d&#39;onda di 600 nm (utilizzare come riferimento una cuvetta riempita con 1 ml di DDW). Calcolare il diametro esterno 600 delle culture iniziale moltiplicando l&#39;OD 600 delle culture nella cella di un fattore di diluizione di 10. </li><li> Successivamente, in base al diametro esterno 600 del culture iniziale, preparare sospensioni cellulari (1 ml) con un diametro esterno 600 = 1.0 in microprovette sterili. </li><li> Utilizzando 3 microprovette sterili riempiti con 900 microlitri DDW sterili, preparare tre diluizioni seriali di 10 volte (OD 600 = 0,1, 0,01 e 0,001) da ogni sospensione cellulare (OD 600 = 1,0) preparato nel passaggio precedente. </li><li> Preparare due piastre contenenti sintetico terreno completo senza la aminoacidi o nucleotidi a cui il plasmide di scelta fornisce prototrophy. Il mezzo di una piastra dovrebbe essere completato con 2% di glucosio e quella degli altri piastra con il 2% e 1% galattosio raffinosio. Essiccare le piastre in una cappa a flusso laminare sterile a temperatura ambiente per 20 minuti e metterli su una griglia. </li><li> Per ogni cultura, punto 10 microlitri dai quattro diluizioni in fila su entrambi i reprimendo e indurre i media. </li><li> Dopo spotting, lasciare i piatti aperto il cofano per alcuni minuti. Quando le macchie sono secche, coprire i piatti e metterli in un incubatore a 30 ° C per 2-3 giorni. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, togliere i piatti e analizzare la crescita del lievito. In primo luogo, verificare che le densità di cellule sono simili sulla piastra contenente medio repressione. Poi, confrontare la crescita della cultura che esprime la proteina effettore di interesse con la cultura che trasporta un vettore vuoto sul piatto contenente medio indurre. Nota: effettori possono essere indirizzati processi cellulari che non si limita la velocità di crescita del lievito in condizioni standard di crescita di laboratorio.Per consentire l&#39;identificazione di fenotipi inibizione della crescita per effettori tale, inducendo i media può essere integrato con sostanze che alterano le funzioni cellulari del lievito, aumentando così la loro sensibilità ai effettori. Per un elenco di sostanze chimiche che possono eventualmente essere integrato in questa procedura, fare riferimento a Parsons et al. (2004) 2. </li></ol> VI. Rappresentante Risultati Un lievito rappresentante spotting analisi e l&#39;individuazione di fenotipi inibizione della crescita indotta da effettori espressione di tipo III sono mostrati in fig. 1. In questo esperimento, il tipo III effettori AvrPto, HopAA1-1 e AvrE1 dei Gram-negativi fitopatogeni batterio Pseudomonas syringae pv. Pomodoro (Pst) sono stati espressi dal centromero contenenti pGML10 plasmide nel ceppo di lievito BY4741, e testati per la loro capacità per inibire la crescita del lievito. Lieviti individuo esprime Pst tipo effettori III sotto il controllo del promotore inducibile GAL1 galattosio o con un vettore vuoto sono stati diluiti in serie e placcato sulla repressione (glucosio) o indurre (galattosio) media (Fig. 1). Sulla repressione media, i ceppi di lievito portando plasmidi per l&#39;espressione di AvrPto e HopAA1-1 mostra una crescita simile a quella del ceppo di controllo che contiene un vettore vuoto. Ma sullo stesso supporto, il lievito portando AvrE1 mostrato una crescita leggermente ridotta, probabilmente correlati ad un certo grado di perdita del promotore GAL1 e per l&#39;effetto citotossico di alta AvrE1. In condizioni di induzione, espressione della AvrE1 effettrici ha causato una drastica fenotipo inibizione della crescita riflette la mancanza di colonie in ogni diluizione. Come già osservato da Munkvold et al. 3, espressione di HopAA1-1 ha comportato una grave inibizione della crescita, mentre AvrPto non ha mostrato alcun effetto. <img src="/files/ftp_upload/1865/1865fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Lievito di inibizione della crescita causato dalla espressione della Pseudomonas syringae pv. Pomodoro (Pst) di tipo III effettori AvrE1 e HopAA1-1. Ceppi di lievito (BY4741) contenente il plasmide pGML10, sia vuoto o che trasportano GAL1-driven cassette per galattosio-inducibile espressione di AvrPto , HopAA1-1 o AvrE1, durante la notte sono stati coltivati ​​in terreno completo sintetico integrato con glucosio (2%) come fonte di carbonio, e privo di leucina. Le culture sono stati lavati, normalizzato a OD 600 = 1.0 e seriale 10-diluizioni sono stati avvistati su supporti sintetici completa solido manca leucina e glucosio contenente (2%), o galattosio (2%) e raffinosio (1%). Le fotografie sono state prese dopo 2 e 3 giorni di crescita a 30 ° C per il lievito crescita in glucosio e galattosio dei media, rispettivamente.

<ol>
	<li>Siggers, K. A., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae:+a+versatile+model+system+for+the+identification+and+characterization+of+bacterial+virulence+proteins.">The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins.</a> Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).</li><li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+type+III+secretion+system+effector+repertoire+reveals+several+effectors+that+are+deleterious+when+expressed+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).</li><li>Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+study+bacterial+effectors.">Yeast as a tool to study bacterial effectors.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).</li><li>Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+yeast+screen+to+identify+pathogenic+bacterial+proteins.">A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins.</a> PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).</li><li>Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+role+of+the+CopN+protein+in+Chlamydia+pneumoniae+intracellular+growth.">The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth.</a> Nature. 456, 112-115 (2008).</li></ol>

In questa presentazione, abbiamo illustrato come utilizzare il lievito Saccharomyces cerevisiae in erba come un sistema eterologo per l&#39;espressione di tipo III proteine ​​batteriche effettrici e come identificare effettore indotta fenotipi inibizione della crescita. È importante sottolineare che questi fenotipi possono essere utilizzati in schermi genetici per identificare soppressori dell&#39;impatto negativo di effettori sulla crescita del lievito. Soppressori possono rappresentare bersagli diretti d...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Peptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>291940</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast synthetic drop-out medium supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Y2001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-galactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G0750</td>
<td>&gt;99%; &lt;0.1% glucose</td>
</tr>
<tr>
<td>D-raffinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R0250</td>
<td>&gt;98%</td>
</tr>
<tr>
<td>L-leucine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uracil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>U0750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-histidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H6034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA, single stranded, from salmon testes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D7656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>Desiccate</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4338</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lithium acetate (LiAc)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4958</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris (base)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>4109-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B6131</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dodecyl sulfate sodium salt (SDS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>8.22050.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>67.742</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculation loop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z643009</td>
<td>Sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH indicator strip, pH 6.5-10.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1.09543.0001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

identification of growth inhibition phenotypes induced by expression of bacterial type iii effectors in yeast

Molti batteri Gram-negativi patogeni utilizzano un sistema di secrezione tipo III a traslocare una serie di proteine ​​effettrici nel citosol delle cellule ospiti. All&#39;interno della cellula, tipo di effettori III sovvertire processi host cellulari per sopprimere le risposte immunitarie e favorire la crescita dei patogeni. Numerosi effettori tipo III di patogeni animali e vegetali batteriche sono stati identificati fino ad oggi, ma solo pochi di loro sono ben caratterizzati. Comprendere le funzioni di questi effettori è stata compromessa da una combinazione di ridondanza funzionale nel repertorio effettore di un ceppo batterico dato, gli effetti sottili che possono esercitare per aumentare la virulenza, i ruoli che sono forse specifici per alcune fasi dell&#39;infezione, e le difficoltà di geneticamente la manipolazione di determinati agenti patogeni. Espressione di tipo III effettori nel lievito<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Possono permettere aggirare queste limitazioni e gli aiuti alla caratterizzazione funzionale delle proteine ​​effettrici. Perché il tipo III effettori spesso bersaglio processi cellulari che si conservano tra lievito e altri eucarioti, la loro espressione nel lievito può causare fenotipi inibizione della crescita che può essere sfruttato per chiarire le funzioni effettrici e gli obiettivi. Ulteriori vantaggi di utilizzare il lievito per lo studio funzionale di effettori batteriche includono la loro trattabilità genetica, informazioni sulle funzioni prevista della stragrande maggioranza dei loro ORF e la disponibilità di numerosi strumenti e risorse per gli esperimenti, sia genome-wide e su piccola scala. Qui discutiamo i fattori critici per la progettazione di un sistema di lievito per l&#39;espressione delle proteine ​​batteriche di tipo III effettore. Questi includono un promotore appropriata per la guida l&#39;espressione del gene effettore (s) di interesse, il numero di copie del gene effettore, il tag epitopo utilizzati per verificare l&#39;espressione della proteina, e il ceppo di lievito. Vi presentiamo le procedure di indurre l&#39;espressione di effettori nel lievito e per verificare la loro espressione mediante immunoblotting. Inoltre, si descrive un test spotting su piastre di agar per l&#39;identificazione di fenotipi crescita effettrici indotte inibizione. L&#39;utilizzo di questo protocollo può essere estesa allo studio dei fattori di patogenicità consegnato nella cellula ospite da qualsiasi agente patogeno e il meccanismo di traslocazione.

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Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

In questo video, si descrive una procedura per l&#39;espressione di effettori batterica di tipo III nel lievito e l&#39;individuazione di fenotipi crescita effettrici indotte inibizione. Fenotipi quali può essere successivamente sfruttato per chiarire le funzioni effettrici e gli obiettivi.

Identificazione dei fenotipi inibizione della crescita indotta da Espressione di effettori batterica di tipo III nel lievito

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.7K Views.  Tel Aviv University. In questo video, si descrive una procedura per l'espressione di effettori batterica di tipo III nel lievito e l'individuazione di fenotipi crescita effettrici indotte inibizione. Fenotipi quali può essere successivamente sfruttato per chiarire le funzioni effettrici e gli obiettivi.

Video: Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Ricerca

Biologia

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Espressione di proteine ​​ricombinanti nel lievito Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Consegna batterica di RNAi per DJ: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

I saggi di crescita per valutare la tossicità poliglutamina nel lievito

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Quantificazione di orofacciale fenotipi in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

Analisi precisa, High-throughput di crescita batterica

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Analisi molecolare di transizione endoteliali mesenchimali indotta dalla trasformazione di segnalazione di fattore di crescita-β

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Identificazione dei fenotipi inibizione della crescita indotta da Espressione di effettori batterica di tipo III nel lievito

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