I batteri intracellulari secernono proteine dell'effettore nell'ospite che possono manipolare le vie biologiche per promuovere la sopravvivenza degli agenti patogeni. Rivelare i bersagli ospiti degli effettori è essenziale per comprendere agenti patogeni intracellulari come la clamidia trachomatis. Gli schermi di tossicità e soppressore del lievito possono fornire informazioni chiave sul bersaglio biologico naturale delle proteine dell'effettore batterico e possono essere particolarmente utili quando un partner legante è sconosciuto.
Dimostriamo qui la tossicità del lievito e i test soppressori per lo screening delle proteine dell'effettore Chlamydia trachomatis, ma questa tecnica è stata utilizzata anche per caratterizzare gli effettori Legionella pneumophila e Coxiella burnetii. Inizia inoculando cinque millilitri di brodo a goccia singola con la singola colonia di lievito trasformata con la proteina dell'effettore contenente plasmide. Utilizzare lievito trasformato con il solo vettore come controllo negativo e incubare l'inoculo durante la notte a 30 gradi Celsius mentre si trema.
Il giorno successivo, aggiungere 180 microlitri di acqua sterile ai pozzi da A2 a A6 di una piastra da 96 pozza. Vortice la coltura notturna e aggiungere 180 microlitri di lievito al pozzo A1. Quindi diluire serialmente il lievito nei pozzi con acqua. Utilizzare una pipetta multicanale per individuare cinque microlitri di ogni diluizione su singole piastre di agar di galattosio drop-out e incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 48 ore.
Dopo l'incubazione, valutare visivamente la tossicità confrontando la crescita del lievito esprimendo la proteina effettore coltivata sul supporto contenente galattosio con la crescita del lievito che esprime il solo vettore. Inoculare 100 millilitri del singolo brodo drop-out con un millilitro del brodo di lievito precedentemente preparato e incubarlo per 16-24 ore a 30 gradi Celsius con scuotimento a 150 giri/min. Il giorno successivo, aggiungere gli interi 100 millilitri della coltura notturna a 900 millilitri di brodo a goccia singolo preri riscaldato e incubare il pallone per quattro o cinque ore a 30 gradi Celsius mentre si trema.
Dopo l'incubazione, pellet la coltura a 6.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 250 millilitri di acqua sterile. Ripetere la centrifugazione e scartare il supernatante.
Quindi rimospendare il pellet in 250 millilitri di un acetato di litio millimolare. Pellettare la coltura mediante centrifugazione, rimuovere l'acetato di litio e rimorsi il pellet in 9,6 millilitri del 50%PEG 3350. Quindi aggiungere i reagenti di trasformazione come descritto nel manoscritto e regolare il volume a 15 millilitri con acqua sterile invertendo delicatamente per mescolare.
Incubare la miscela a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi aggiungere 750 microlitri di DMSO e incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per altri 30 minuti. L'aggiunta del DMSO prima dello shock termico è fondamentale per ottenere un'elevata efficienza di trasformazione.
Dopo l'incubazione, pelletare il lievito centrifugando a 3.000 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e lavare il pellet con 10 millilitri di acqua sterile, quindi ripetere la centrifugazione per pellettare il lievito. Resuspend il pellet in otto millilitri d'acqua.
Determinare l'efficienza di trasformazione diluendo il campione da uno a 10 e placcando 100 microlitri di ogni diluizione su un doppio agar drop-out. Quindi placcare 200 microlitri del campione su piastre di agar di galattosio a doppia caduta e incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 48-96 ore o fino a quando non compaiono colonie. Una volta che le colonie sono apparse, rattopparle su un doppio agar galattosio drop-out e incubarle per altre 24-48 ore.
Utilizzare parte del cerotto per inoculare cinque millilitri di brodo doppio drop-out e incubare l'inoculo durante la notte a 26 gradi Celsius con scuotimento a 150 giri/min. Il giorno successivo, aggiungere 180 microlitri di acqua sterile a cinque pozzi di una piastra da 96 po 'a partire dal pozzo A2. Vortice il mix culturale notturno. Aggiungere 180 microlitri di lievito al pozzo A1 e diluirlo serialmente utilizzando l'acqua nei pozzi da A2 a A6. Individuare cinque microlitri di ogni diluizione su singoli glucosio drop-out e singole piastre di agar di galattosio drop-out assicurandosi di includere il solo effettore tossico come controllo.
Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 48 ore, quindi confrontare la crescita del lievito con il solo effettore tossico con la crescita del lievito con il potenziale soppressore. Per confermare i soppressori che hanno dimostrato una tossicità ridotta rispetto al solo effettore tossico, isolare il plasmide secondo le indicazioni manoscritte e ritras trasformarlo nel lievito tossico. Inoculare il doppio brodo di glucosio con una colonia dalla piastra di trasformazione.
Incubarlo durante la notte e individuare il doppio agar di glucosio e galattosio per confermare la soppressione della tossicità. Prima di eseguire lo schermo del soppressore del lievito, le proteine dell'effettore di interesse sono state testate per la tossicità nel lievito. La proteina di interesse è stata espressa nel lievito sotto il controllo di un promotore inducibile di galattosio e la crescita sul galattosio è stata confrontata con la crescita del glucosio.
Quando il CT229 è stato testato per la tossicità, sono state osservate colonie più piccole e soppressione della crescita. Idealmente, si dovrebbe osservare una diminuzione da due a tre tronchi per procedere con gli schermi soppressori di lievito. Lo schermo del soppressore è stato condotto trasformando il ceppo tossico con la libreria genomica del lievito pYAP 13 e placcando i trasformatori sull'agar di galattosio.
I cloni soppressori ottenuti sono stati avvistati su un doppio agar di galattosio drop-out per confermare la soppressione della tossicità. I soppressori pSup1 e pSup2 sopprimevano la tossicità della proteina effettore, mentre pSup3 no. Queste procedure richiedono un'attenta attenzione ai dettagli oltre al lavoro preparatorio critico, incluso avere grandi quantità di supporti e piastre pronti prima di eseguire l'esperimento.
Una volta identificati i soppressori, possono essere eseguiti esperimenti per verificare le interazioni con l'effettore di interesse, tra cui abbattimenti, colocalizzazione dell'immunofluorescenza, knockout dell'effettore o eliminazione dei fattori ospiti identificati negli schermi. Lo sviluppo di questa tecnica per gli effettori clamidia ha permesso una rapida caratterizzazione preliminare delle proteine dell'effettore e ha contribuito a concentrare i nostri sforzi sulla chiarire i meccanismi molecolari sottostanti che mediano le interazioni patogene ospiti.
