Questo lavoro è stato sostenuto da NIH National Institute of Neurological Disorder and Stroke (NINDS) (NS049442).&gt;

Risospendere peptide β-amiloide Prima di iniziare sono pronti: <ul><li> Aβ 1-42 (polvere liofilizzata) </li><li> 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP) </li><li> Low-binding tubi in polipropilene microcentrifuga (1,5 ml) </li><li> Hamilton siringa a tenuta di gas con stop tuffo Teflon (250 microlitri) </li><li> Dimetilsolfossido (DMSO) </li></ul><ol><li> Lasciare Aβ liofilizzato 1-42 equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti per evitare la condensa dopo l&#39;apertura del flacone peptide. </li><li> Sotto la cappa, risospendere peptidi Aβ 1-42 in HFIP ghiacciata per ottenere una soluzione 1 mM e vortex la soluzione per alcuni secondi. </li><li> Utilizzando una siringa di vetro con tappo a tenuta di gas Hamilton teflon, subito dividere il Aβ 1-42 / HFIP soluzione altrettanto in tre fiale in polipropilene e sigillare le fiale. </li><li> Le fiale vengono quindi incubate per 2 ore per consentire monomerization Aβ. Quindi, aprire le fiale e concentrare la soluzione Aβ 1-42 / HFIP sotto vuoto usando una centrifuga SpeedVac (800 g, temperatura ambiente) fino a quando un film peptide chiaro si osserva sul fondo dei flaconi. Controllare accuratamente la temperatura all&#39;interno della centrifuga SpeedVac per evitare il degrado peptide (max 25 ° C). </li><li> Sigillare le fiale e conservare le aliquote a -80 ° C. Pellicola Aβ può essere conservato per 6 mesi. </li><li> Risospendere un film con l&#39;aggiunta di DMSO per ottenere una concentrazione fino a 5 mm Aβ 1-42. Sonicare a bagnomaria per 10 minuti per garantire la completa risospensione. </li><li> Questa aliquota 5mM Aβ 1-42 soluzione in fiale in polipropilene. Sigillare tutti i flaconi e conservarli a -20 ° C. Aliquote vanno scongelati solo una volta. Attenzione alla condensa l&#39;acqua all&#39;interno del congelatore. Peptidi in soluzione degrada molto facilmente. </li></ol> Oligomerizzazione Prima di iniziare sono pronti: <ul><li> Aβ 1-42 / DMSO (5mm) </li><li> Tampone fosfato sterile </li><li> Low-binding tubi in polipropilene microcentrifuga (1,5 ml) </li><li> Low-binding polipropilene provette (50 ml) </li></ul><ol><li> Diluire il Aβ ottenuto 5mM 1-42 / aliquota DMSO con tampone fosfato sterile (fino a 100 l). </li><li> Vortex per 30 secondi e poi incubare per 12 ore a 4 ° C </li></ol> Fetta trattamento dell&#39;ippocampo Durante il trattamento fettine di ippocampo, è importante per evitare la mancanza di specifiche adesione peptide su bicchieri, superfici tubo per perfusione, e la camera di registrazione. Usare preferibilmente a basso legame tubi e contenitori in polipropilene. Evitare l&#39;uso di oggetti di vetro o di plastica generico-ware. Mezzi di perfusione deve essere siero o albumina-free. Perfusione Aβ Prima di iniziare sono pronti: <ul><li> Oligomerized Aβ 1-42 </li><li> Registrazione del buffer (in mm: 124 NaCl, 4.4 KCl, 1 Na 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, e 10 di glucosio) </li><li> Registrazione elettrofisiologica set-up con camera di interfaccia </li><li> Trasversale fettine di ippocampo incubate in un tampone di registrazione ossigenato per almeno 90 minuti dopo la dissezione (T = 29 ° C; tasso di perfusione costante = 2 ml / minuto) </li></ul><ol><li> Immediatamente prima l&#39;esperimento, diluire il Aβ oligomerized 1-42 aliquota alla concentrazione di lavoro appropriati (200 nm o superiore) in un tubo in polipropilene con pre-ossigenato buffer di registrazione. </li><li> Profumato il Aβ 1-42 soluzione per 20 minuti per le fette prima dell&#39;induzione della plasticità sinaptica. </li></ol> Induzione di plasticità e di follow-up <ol><li> Tipicamente, il modello più diffuso di plasticità sinaptica è la LTP. Essa può essere indotta attraverso la stimolazione tetanica di una sinapsi dato nell&#39;ippocampo. Registriamo risposte campo da sinapsi tra le proiezioni del Shaffer collaterali e neuroni piramidali CA1 nel radiatum strato. Il nostro stimolazione tetanica è costituito da una stimolazione scoppio theta che comprende 3 treni separati da intervalli di 15 secondi. Ogni treno è composto da 10 scatti a 5 Hz dove ogni raffica comporta 5 impulsi a 100 Hz. Applicare la stimolazione tetanica subito dopo la perfusione di Aβ oligomerized è stata completata. </li><li> Subito dopo la stimolazione tetanica tornare a perfusione con buffer di registrazione normale. Mantenere una velocità costante di perfusione, temperatura della camera di registrazione e la corretta ossigenazione per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li></ol> Risultati rappresentative e possibili problemi La Aβ oligomerized secondo il protocollo classico di Stine et coll. 1, genera monomeri Aβ e una varietà di oligomeri di diverse dimensionis (dimero, trimero, ecc) La perfusione di oligomerized Aβ 1-42 porta a LTP diminuita in Aβ trattati con fette rispetto a fette di controllo. Nelle nostre condizioni sperimentali, in cui 3-5 mesi topi vecchi C57BL/6J maschi sono utilizzati, LTP in 200 nM Aβ trattati con fette è in media del 150% dei valori di base a due ore dopo la stimolazione tetanica, mentre a fette di controllo i valori sono LTP in media 200-250% di baseline2. In alcuni casi, il trattamento con Aβ potrebbe non riuscire a ridurre la LTP ippocampale. Diversi errori critici che potrebbero verificarsi comprendono pellicola durante l&#39;asciugatura eccessiva concentrazione di Aβ e oligomerizzazione incompleta. Perfusione Aβ in fettine di ippocampo potrebbe essere un&#39;altra fonte di preoccupazione a causa delle proprietà fisico-chimiche del peptide Aβ in soluzione, che è incline a non specifica adesione alla plastica. Risoluzione dei problemi di queste questioni è discusso di seguito.

<ol>
	<li>Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis.">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).</li><li>Vitolo, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+-peptide+inhibition+of+the+PKA/CREB+pathway+and+long-term+potentiation:+reversibility+by+drugs+that+enhance+cAMP+signaling.">Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).</li><li>Puzzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picomolar+amyloid-beta+positively+modulates+synaptic+plasticity+and+memory+in+hippocampus.">Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus.</a> J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).</li><li>Lewczuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides.">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52, 332-334 (2006).</li><li>Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+synaptic+dysfunction+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease.</a> Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).</li><li>Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+of+LTP+in+rat+hippocampus+in+vivo+by+beta-amyloid+precursor+protein+fragments.">Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments.</a> Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).</li><li>Itoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices+of+beta-amyloid-infused+rats.">Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats.</a> Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).</li><li>Walsh, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+secreted+oligomers+of+amyloid+beta+protein+potently+inhibit+hippocampal+long-term+potentiation+in+vivo.">Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo.</a> Nature. 416, 535-539 (2002).</li><li>Lambert, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nonfibrillar+ligands+derived+from+Abeta1-42+are+potent+central+nervous+system+neurotoxins.">nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).</li><li>Gong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+hydrolase+Uch-L1+rescues+beta-amyloid-induced+decreases+in+synaptic+function+and+contextual+memory.">Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory.</a> Cell. 126, 775-788 (2006).</li><li>Trinchese, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+calpains+improves+memory+and+synaptic+transmission+in+a+mouse+model+of+Alzheimer+disease.">Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease.</a> J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).</li></ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla Columbia University IACUC.

Come descritto in precedenza, diversi problemi nella preparazione di Aβ oligomerici può provocare LTP inalterata. Un modo per valutare se il degrado Aβ o la mancanza di oligomerizzazione Aβ potrebbe essersi verificato è quello di valutare la preparazione Aβ con TRIS-Tricine PAGE / analisi Western Blotting e ultracentrifugazione analitica (non descritte in questo protocollo). Quando Western Blotting campioni sono preparati in condizioni non-denaturing/non-reducing, una preparazione di successo dovrebbe generare una...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>A&beta; 1-42 (lyophilized) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American Peptide Co.</td>
<td>62-0-80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>52517</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biotium</td>
<td>90082</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50mL Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>05-538-67</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen</td>
<td>MCT-150-L-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate-Buffered Saline pH 7.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen-Gibco</td>
<td>10010-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GASTIGHT Syringes 250 &mu;L</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>1725</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bath sonicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Branson</td>
<td>3510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Savant SpeedVac Concentrator System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various distributors</td>
<td>SC 110A</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of oligomeric &beta;-amyloid1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices

Riduzione di valore delle connessioni sinaptiche è probabile che alla base della amnesico sottili cambiamenti che si verificano nelle prime fasi del morbo di Alzheimer s (AD). β-amiloide (Aβ), un peptide prodotto in grandi quantità in AD, è noto per ridurre potenziamento a lungo termine (LTP), un cellulare correlato di apprendimento e memoria. Infatti, compromissione LTP causata da Aβ è un utile paradigma sperimentale per lo studio delle disfunzioni sinaptiche nei modelli dC e lo screening per i farmaci in grado di mitigare tali menomazioni o ritorno sinaptica. Studi hanno dimostrato che Aβ produce l&#39;interruzione LTP preferenzialmente attraverso la sua forma oligomerici. Qui forniamo un protocollo dettagliato per LTP da compromettere la perfusione di oligomerized sintetico Aβ1-42 peptide su fettine di ippocampo acuta. In questo video, delineiamo un passo-passo procedura per la preparazione di Aβ oligomerici<sub&gt; 1-42</sub&gt;. Poi, seguiamo un esperimento individuale in cui è ridotta LTP in fettine di ippocampo esposti a Aβ oligomerized<sub&gt; 1-42</sub&gt; Rispetto a fette in un esperimento di controllo dove non Aβ<sub&gt; 1-42</subEsposizione&gt; era accaduto.

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Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Una caratteristica della malattia di Alzheimer è l&#39;elevazione di Aβ<sub&gt; 1-42</sub&gt; Peptide. Qui forniamo un protocollo per la preparazione di Aβ sintetico<sub&gt; 1-42</sub&gt; Oligomeri, che danneggia dell&#39;ippocampo potenziamento a lungo termine, un cellulare correlato di memoria. Questa procedura è utile per lo studio dei meccanismi di Aβ indotta lo screening della patologia e della droga.

Preparazione di oligomeriche β-amiloide 1-42 E induzione di Impairment plasticità sinaptica in fettine di ippocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

preparation-oligomeric-amyloid1-42-induction-synaptic-plasticity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

23.0K Views.  Columbia University. Una caratteristica della malattia di Alzheimer è l'elevazione di Aβ 1-42 Peptide. Qui forniamo un protocollo per la preparazione di Aβ sintetico 1-42 Oligomeri, che danneggia dell'ippocampo potenziamento a lungo termine, un cellulare correlato di memoria. Questa procedura è utile per lo studio dei meccanismi di Aβ indotta lo screening della patologia e della droga.