Per iniziare, preparare due millilitri di formalina al 4% o qualsiasi altro fissativo appropriato. Tieni anche una capsula di Petri, una pinza e delle forbici chirurgiche pronte prima di iniziare la procedura. Mettere il pesce criolesionato correttamente eutanasia in una capsula di Petri contenente acqua deionizzata.
Usando le forbici, eseguire un taglio attraverso il corpo, anteriore e posteriore al peduncolo caudale. Lascia che il tessuto sanguini nell'acqua deionizzata all'interno della capsula di Petri. Usando una pinza, raccogliere e trasferire il peduncolo caudale nella soluzione fissativa preparata in un tubo di microcentrifuga.
Capovolgere con attenzione il tubo più volte. Prima di montare, lavare il fazzoletto fisso in PBS per 10 minuti su un bilanciere. Quindi trasferirlo in un tubo di microcentrifuga da due millilitri contenente una soluzione di saccarosio al 30% in acqua deionizzata, pre-raffreddato a quattro gradi Celsius e capovolgere delicatamente il tubo più volte.
Lasciare il tubo in posizione verticale a 4 gradi Celsius per almeno 24 ore. Riempire uno stampo incorporante con uno strato di cinque millimetri di supporto di montaggio OCT. Usando una pinza, posizionare il peduncolo caudale sul fondo dello stampo.
Regola il suo orientamento per sezioni trasversali o coronali. Lasciare congelare il mezzo in una scatola di ghiaccio secco. Non appena il tessuto è stabilizzato nella posizione desiderata, riempire il resto dello stampo prima che l'OCT si congeli completamente.
Conservare lo stampo a 80 gradi Celsius per almeno un'ora prima di sezionare il tessuto utilizzando un criostato. L'entità della criolesione in diversi giorni dopo la criolesione, o DPCI, è stata analizzata nelle sezioni del peduncolo caudale utilizzando la colorazione tricromica composta da blu anilina, fuschin acido e arancio-G. Le aree danneggiate sono state determinate dall'assenza di colorazione arancione.
A 4 e 7 dpci, la sezione trasversale mostrava muscoli scheletrici ampiamente degenerati nel fianco criolesionato del corpo. L'analisi di immunofluorescenza ha mostrato che, a 4 DPCI, il lato danneggiato del peduncolo caudale conteneva abbondanti cellule DAPI-positive ma poca o nessuna F-actina e tropomiosina 1, indicando muscoli degenerati. A 7 dpci, la tropomiosina 1 e l'actina F potrebbero essere rilevate nella ferita, vicino alla linea mediana verticale del corpo, indicando l'inizio della formazione di nuove miofibre.
A 30 dpci, entrambi i lati del corpo hanno mostrato una distribuzione simile della colorazione F-actina, indicando un efficiente ripristino del muscolo scheletrico.
