Zebrafish offre un prezioso modello di rigenerazione neurale a causa della loro capacità di recuperare da lesioni del midollo spinale. Questo metodo descrive la resistenza al nuoto e il comportamento di nuoto come letture della riparazione funzionale del midollo spinale. Questa tecnica fornisce una valutazione affidabile e quantificabile della resistenza al nuoto e del comportamento di nuoto nel pesce zebra adulto.
Questi metodi sono ugualmente applicabili agli studi sullo sviluppo neuromuscolare e muscolo-scheletrico, sulla malattia e sulla rigenerazione. Per valutare la resistenza al nuoto, aprire il software di controllo della velocità del flusso. Fai clic sulla casella Esperimento e deseleziona Uswim e Uwater.
Quindi modificare la velocità del flusso nella casella Uwater in basso a sinistra per regolare le velocità della corrente dell'acqua. Per avviare un protocollo automatico, fare clic sulla casella Avvia registrazione. Nella finestra di dialogo che si apre, scegli Automatizzato dall'elenco a discesa.
Per aprire un file di protocollo salvato in precedenza, fare clic sull'icona del file accanto al file di protocollo. Quindi, impostare il file di output facendo clic sull'icona del file accanto al file di registro. Nella finestra di Esplora file che si apre, assegna un nome al file di output e salvalo nella posizione desiderata.
Quindi, impostare una finestra timer split lap per garantire l'accesso simultaneo al software di controllo della velocità del flusso e alle finestre del timer sullo schermo del computer. Successivamente, allestisci un acquario per ospitare i pesci esausti dopo la loro rimozione dal tunnel di nuoto. Riempire il serbatoio di raccolta e un lungo tubo di cloruro di polivinile con acqua del sistema zebrafish.
Posizionare un'estremità del tubo preriempito nel serbatoio di raccolta e un'altra nel serbatoio tampone, assicurandosi che l'acqua possa fluire liberamente dal serbatoio tampone nel serbatoio di raccolta. Bloccare l'estremità superiore del tubo con una clip legante per impedire il flusso d'acqua e utilizzare la clip legante per controllare il deflusso dell'acqua secondo necessità. Chiudere il tunnel di nuoto con il coperchio di resistenza al nuoto prima di posizionare un gruppo di pesci all'interno del tunnel di nuoto.
Per acclimatare il pesce al tunnel di nuoto e alla direzione del flusso, avviare il timer split lap e regolare la velocità corrente a zero centimetri al secondo per i primi cinque minuti, nove centimetri al secondo per i successivi cinque minuti e 10 centimetri al secondo per i successivi cinque minuti. Dopo l'acclimatazione, apri il protocollo e avvia il programma di controllo automatico della velocità del flusso, che aumenterà la velocità della corrente dell'acqua di due centimetri al secondo ogni minuto. Monitorare il pesce per esaurimento.
I pesci esausti saranno spinti verso la parte posteriore del tunnel di nuoto. Per assicurarti che un pesce sia esausto, tocca delicatamente l'estremità posteriore del tunnel o crea un'ombra su quell'area per stimolare il pesce a nuotare. I pesci esausti non hanno risposto allo stimolo dello startle e giacevano piatti all'estremità posteriore del tunnel.
Quando un pesce è esausto, sblocca il tubo di raccolta del pesce. Apri la finestra del tunnel di nuoto e raccogli il pesce nella vasca di raccolta. Registra il tempo all'esaurimento usando il timer split lap.
Dopo che tutti i pesci sono stati esauriti e raccolti nella vasca di raccolta, fare clic sul pulsante Arresto di emergenza sul software di controllo della velocità del flusso e arrestare il timer. Per acquisire filmati per il test del comportamento di nuoto, posizionare un gruppo di pesci nel tunnel di nuoto e chiudere il tunnel utilizzando un coperchio standard completamente chiuso. Quindi, apri una nuova finestra di registrazione e assegna un nome al file.
Non fare ancora clic su Registra. Prima di iniziare un nuovo esperimento, posiziona un tovagliolo di carta o un pezzo di tessuto sul lato del tunnel di nuoto per assicurarti che tutti i comportamenti siano dovuti al nuoto dei pesci e non a una risposta di spavento causata dal movimento nell'ambiente. Dopo esserti assicurato che l'acqua sia calma e che non si muovano increspature attraverso l'inquadratura, fai clic su Registra nella finestra del software della fotocamera per iniziare a registrare il file del filmato.
Quindi fare clic su Avvia nel software di controllo della velocità del flusso per iniziare il protocollo, che continuerà ininterrottamente. Guarda il filmato per assicurarti che nessun fotogramma venga lasciato cadere, che non ci siano bolle nel campo visivo e che tutti i pesci siano registrati. Una volta completata la registrazione del filmato, fare clic su Arresto di emergenza per terminare il protocollo di controllo della velocità del flusso e verificare che il file di output dei dati venga salvato automaticamente.
Quindi, chiudi la finestra di registrazione per salvare il file filmato. Dopo la registrazione, rimuovere il coperchio. Recupera con cura i pesci e riportali al loro acquario.
Per analizzare i filmati acquisiti, aprire il tracking_v2. ijm script in Fiji e fare clic su Esegui per iniziare il programma. Nella finestra popup, scegli la cartella contenente i filmati di comportamento del nuoto da monitorare e fai clic su Apri.
Cerca il fotogramma uno dei primi filmati, una finestra di dialogo e la regione di interesse, o ROI manager, che verrà visualizzata. Seguire le indicazioni fornite nella finestra di dialogo e creare un ROI nella parte inferiore della camera del tunnel di nuoto. Quindi fare clic su OK e assicurarsi che non vengano visualizzati angoli neri.
La finestra di soglia si aprirà insieme a un fotogramma con soglia modificata. Cambia la combinazione di colori da bianco e nero a rosso e regola il valore massimo fino a quando il fotogramma uno mostra solo il pesce in rosso e nient'altro. Registrare la soglia e fare clic su OK nella finestra di dialogo.
Per allineare, assemblare e acquisire statistiche descrittive, aprire il SwimBehavior_v7-3. Script R in RStudio e fare clic su Sorgente nell'angolo in alto a destra della sezione script. In una nuova finestra che si apre, scegli la cartella contenente il _raw.
csv generati da Fiji e fare clic su Apri. Il programma verrà eseguito automaticamente. Nella finestra di dialogo popup, conferma il numero di pesci in ogni film.
Fare clic su Sì se i numeri indicati sono corretti o no se i numeri non sono corretti. Una volta allineati i file, verificare la presenza di un _aligned appena generato. csv.
Dopo essersi assicurato che il programma combini i dati, esegua statistiche e stampi grafici di output, verificare la presenza dei file di analisi generati in una nuova cartella denominata Risultati all'interno della cartella padre contenente il _raw. csv e _aligned. csv.
La resistenza al nuoto valutata a due, quattro e sei settimane dopo l'infortunio ha mostrato una perdita del 60% della capacità di resistenza al nuoto a due settimane. Il pesce rigenerante ha gradualmente riacquistato la resistenza al nuoto a quattro e sei settimane dopo l'infortunio. Nel test del comportamento di nuoto, i controlli nuotavano costantemente nella parte anteriore della camera del tunnel di nuoto corrispondente a una posizione Y elevata.
Al contrario, a due settimane dall'infortunio, i pesci feriti non potevano mantenere una capacità di nuoto costante contro corrente. Di conseguenza, le loro piste di nuoto sono più irregolari, con una diminuzione complessiva della posizione Y. La posizione Y è aumentata a quattro e sei settimane dopo l'infortunio, indicando che gli animali rigeneranti hanno gradualmente riacquistato la loro capacità di nuotare.
Inoltre, rispetto ai controlli illesi, gli animali lesionati a due settimane dopo l'infortunio erano marcatamente meno attivi, bloccati nel quadrante posteriore del tunnel di nuoto e perdevano la loro capacità di nuotare contro le basse velocità correnti. Coerentemente con la loro innata capacità di raggiungere il recupero funzionale, gli animali lesionati hanno gradualmente normalizzato i parametri di comportamento del nuoto a quattro e sei settimane dopo l'infortunio. L'uso del software di controllo della velocità del flusso in questo protocollo è facoltativo.
L'alternativa è controllare manualmente il motore della corrente d'acqua. I saggi descritti in questo studio possono essere utilizzati per il pre-screening per fenotipi neurali, muscolari o scheletrici. Il tessuto di interesse può quindi essere raccolto per l'esame istologico o molecolare.
Il nostro laboratorio e altri hanno utilizzato questo protocollo per identificare i geni necessari per la riparazione neurale innata e i fattori che sono sufficienti per migliorare la rigenerazione neurale.
