Ringraziamo V. Zimmermann per un&#39;eccellente assistenza tecnica e per la cura dei pesci. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero, numero di concessione: 310000_120611.

1. Attrezzature Set-up <ol><li> Lo strumento principale utilizzato per eseguire cryoinjury è la criosonda, la penna strumento simile che è fatto di acciaio inossidabile (Figura 1A). La maniglia cilindrica lunghezza di 40 mm e ha un diametro di 8 mm. La punta dell&#39;applicatore è di 6 mm e 0,8 mm di diametro. La giunzione tra la punta e il manico è conico 4 mm di lunghezza. Inoltre, il manico della sonda criogenica deve essere isolata con un tubo di plastica e nastro per evitare congelamento delle dita tenendo l&#39;utensile durante la procedura. </li><li> Altri materiali che sono necessari per la criochirurgia sono uno stereomicroscopio, pinze taglienti, forbici micro molla dissezione e una pipetta di plastica. Inoltre preparare un becher per anestetizzare il pesce e un cucchiaio di plastica per il trasferimento del pesce. </li><li> Durante l&#39;intervento, il pesce è messo su una spugna umida con il suo up lato ventrale (Figura 1B). Per mantenere l&#39;animale in una procedura stabile, unoscanalatura appropriato deve essere tagliato manualmente la spugna. </li><li> Preparare una vasca con acqua sistema per trasferire il pesce dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Impostare un timer prima doppietta con un conto alla rovescia di 10 secondi e poi automaticamente un conto alla rovescia di 24 secondi. </li></ol> 2. La procedura Cryoinjury <ol><li> Far raffreddare il criosonda immergendo la punta in 3-5 cm di azoto liquido per almeno 3 min. </li><li> Anestetizzare uno zebrafish adulto immergendo in tricaine 0,02% fino a quando il pesce diventa sulla sua schiena e le sue branchie quasi smettono di muoversi (circa 90 secondi). </li><li> Trasferire il pesce con un cucchiaio di plastica ad una spugna umida che è stato tagliato a tenere un pesce capovolto (figura 1B). Tenere fermo il pesce con una pinza che utilizzano mano non dominante. Individuare visivamente il margine posteriore mediale del cuore e usare le forbici iridectomia diritte per perforare la pelle. (Figura 1C). </li><li> Fate un piccolo (circa 2 mm) incisione sopra il cuore di cutting dritto anteriormente attraverso la pelle, i muscoli (Figura 1D). Non tagliare attraverso l&#39;apparato osseo branchiale, in modo da uccidere l&#39;animale. </li><li> Strappare delicatamente lo strato epiteliale argenteo del ipoderma (Figura 1E) con la punta delle forbici per avere un accesso diretto al ventricolo battere. Non inserire le forbici più in profondità nella cavità del corpo, come questo puntura volontà del cuore. Il cuore deve essere ben visibile, e nessun sanguinamento esteso dovrebbe avvenire durante la toracotomia (Figura 1F). </li><li> Avviare il timer programmato che è stato impostato per 10 secondi seguiti da 24 secondi. In 10 secondi estrarre la criosonda dal azoto liquido. Assicurarsi che non ci sia più azoto sulla criosonda scuotendo delicatamente. Stendere l&#39;incisione lateralmente con pinze per aprire il torace (Figura 1F). </li><li> Una volta che il timer anelli 10 secondi, ma immediatamente toccare delicatamente il ventricolo con la punta del pre-raffreddato criosonda (Figura 1G). </li><li> Una volta che gli anelli di timer 24 secondi, versare 2-3 ml di acqua sistema che utilizza una pipetta di plastica sul petto per liberare il criosonda dal tessuto, e trasferire i pesci nella vasca con l&#39;acqua del sistema. </li><li> Il pesce dovrebbe riavviare la respirazione dopo pochi secondi, e poi dovrebbe riprendere il nuoto. Se non respira, dopo circa 45 secondi, stimolare l&#39;animale spruzzando acqua nelle branchie con una pipetta di plastica fino a quando non comincia a respirare da solo. Nella nostra esperienza, 95% del pesce sopravvivere chirurgia, e tutti i decessi si verifica il giorno dell&#39;intervento. Non sarà necessario per suturare incisioni. </li></ol> 3. Cuore Raccolta e Fixation <ol><li> Preparare 1 ml di formalina al 2% in una provetta per il fissaggio del cuore, due pinze, forbici micro-dissezione e la spugna umida fessura. </li><li> Al giorno selezionato dopo cryoinjury, euthanize il pesce in 0,1% tricaine per 5 minuti. </li><li> Posizionare ilpesce lato ventrale in su in un umido, spugna fessura. Fare un grande (circa 4 mm) incisione al di sopra del cuore attraverso la cartilagine branchiale con le forbici micro dissezione. Aprire ampiamente l&#39;incisione con una pinza (Figura 1 H). </li><li> Stringere off arterioso bulbo, una struttura bianca anteriore al ventricolo (Figura 1 HI), e rimuovere il cuore dalla cavità tirandolo. A tutto il cuore sezionato 1J è mostrato nella figura e figura 2A. </li><li> Posizionare fino a 3 cuori in una provetta con 1 ml di 2% formalina. Delicatamente ruotare la provetta diverse volte e tenerlo notte a 4 ° C. </li></ol> 4. Cuore di montaggio <ol><li> Sciacquare i cuori in PBS per 5 minuti. Trasferire i cuori in 10 mL del 30% di saccarosio che dovrebbe essere pre-raffreddato a 4 ° C, e mescolare delicatamente. Il campione deve inizialmente galleggiare sulla superficie della soluzione di saccarosio. Continuare incubazione per 1 ora e 20 minuti a 4 ° C. Dopoquesto tempo, i cuori si depositano sul fondo della provetta. </li><li> Preparare una scatola con ghiaccio secco. Prendere uno stampo incorporamento, e versare un strato 5 mm di mezzo ottobre montaggio sul fondo dello stampo. </li><li> Con pinze posizionare il cuore nel T OC mezzo di montaggio nello stampo. Sotto lo stereomicroscopio, regolare l&#39;orientamento del campione per raggiungere l&#39;apice ventricolare sul fondo dello stampo, e il bulbo arterioso verso l&#39;alto. </li><li> Mettere gli stampi con il campione in ghiaccio secco. Quando il mezzo di montaggio inizia a congelare, riempire il resto dello stampo con il mezzo ottobre e lasciar congelare completamente. Mantenere il stampo per almeno 1 ora a -80 ° C prima sezionamento. Il campione congelato può essere conservato per molti mesi a -80 ° C. </li></ol> 5. Hearts sezionamento <ol><li> Impostare un criostato con una dimensione di taglio di 16 um, una temperatura del vano di -24 ° C e la temperatura del campione a -22 ° C. </li><li> Posizionare il blocco congelato con lacampione nel criostato e fissare l&#39;orientamento di iniziare il taglio parallelo al fondo del blocco. </li><li> Preparare sei Superfrost-più diapositive per un blocco e far di conto loro di 1 a 6. Iniziare a tagliare fino a quando il tessuto viene raggiunto, e tagliare il blocco di tutto il campione con una lametta. </li><li> Per ottenere 6 repliche di un cuore, prendere la prima sezione sulla slitta 1, la seconda sezione sulla slitta 2, il terzo sulla slitta 3, ecc Dopo aver posizionato la sezione sesta slitta 6, riavviare con scivolo 1 e proseguire fino alla intero organo viene tagliato. Raccogliere due file di circa 8 sezioni sul vetrino (Figura 3). </li><li> Lasciare le diapositive asciugare per 1 ora a temperatura ambiente. Conservarli per un massimo di 1 anno in contenitori ben chiusi a -20 ° C. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Rappresentante lesione cardiaca a seguito di questo protocollo è mostrato in tutto il cuore sezionati a 4 DPCI (post cryoinjury giorni; figura 2D-F). Per visualize il tessuto miocardico in vivo, abbiamo utilizzato pesce transgenico che esprime EGFP e DsRed2 nucleare sotto il controllo di cardio-specifica cmlc-2 promotore 11,12. L&#39;assenza di EGFP e DsRed2 segnali fluorescenti delimitata un disco a forma zona infartuata lungo la parete laterale apicale-ventricolare. Per eseguire le analisi cellulari e molecolari del tessuto, i cuori sono stati fissati e sezionati con un criostato. Un vetrino rappresentante con una serie consecutiva di sezioni trasversali del cuore è mostrato in Figura 3. Le sezioni possono essere analizzati con metodi diversi (Figura 4). Per determinare l&#39;entità della rigenerazione cardiaca rispetto cicatrici, abbiamo eseguito l&#39;analisi istologica con fucsina acida Orange-G (AFOG) colorazione, che etichetta modo differenziato i tessuti cardiaci e fibrotica 9. Le analisi di espressione genica sono stati raggiunti secondo la procedura di ibridazione in situ <sup&gt; 13. Per rilevare la distribuzione delle proteine ​​marker, abbiamo applicato immunofluorescenza con anticorpi specifici 9. Una combinazione di procedure di colorazione diverse porta alla identificazione di meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella cryoinjury cardiaca seguente rigenerazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig1.jpg" /> Figura 1. Induzione cryoinjury del ventricolo nel zebrafish adulto. (A) Una fotografia del criosonda. (B) Un zebrafish adulto è posizionato nella fessura della spugna con il lato ventrale alto. (CF) incisione del torace per accedere al cuore. (C) Un piccolo taglio attraverso la pelle ed i muscoli viene fatta tra i due pinne pettorali (linea rossa). (D) Le forbici sono inseriti l&#39;incisione per tagliare la pelle a seguito freccia rossa. (E) Sotto la pelle, l&#39;ipoderma sottile strato di argento (circondata da linea blu tratteggiata) è gentilmente aperto per accedere al cuore. (F) L&#39;incisione si sviluppa con lapinza e il ventricolo battendo (freccia verde) è accessibile ai cryoinjury. (G) Il criosonda freddo viene delicatamente inserito nel petto per toccare il cuore. (HJ) Cuore di raccolta. (H) A incisione profonda e di lunga avviene attraverso gli archi branchiali del torace per accedere alla cavità pericardica. Due strutture cardiache sono visibili: bulbo arterioso (freccia bianca) e il ventricolo (freccia verde). (I) Il bulbo arterioso è tenere con una pinza e tirò fuori dalla cavità del corpo. (J) Il cuore è escisse dalla del corpo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig2.jpg" /> Figura 2. Controllo Rappresentante e cuori cryoinjured sezionati da adulto zebrafish transgenici che esprimono EGFP e DsRed2 nucleare in cardiomiociti. (AC) illeso cuore. (A) L&#39;illuminazione a campo scuro mostra il ventricolo (V), bulbo arterioso (Ba, bianco) e le valvole (Va), dove è stato legato l&#39;atrio al ventricolo. (B e C) immagini fluorescenti di t<html> egli intatta EGFP visualizzazione ventricolo e DsRed2 espressione in cardiomiociti. (DF) Cuore a 4 giorni dopo cryoinjury (4 DPCI) (D) L&#39;illuminazione a campo scuro rivela un disco a forma di infarto (linea gialla tratteggiata). (EF) Cardiomyocyte marcatori EGFP e DsRed2 non vengono rilevati nella zona dell&#39;infarto, indicando il miocardio danneggiato (circondata dalla linea tratteggiata). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig3.jpg" /> Figura 3. Sezionamento del cuore. (A) cuore intero con il disegno di sezioni trasversali a partire dal fondo del cuore (1 e 2, in rosso) verso l&#39;alto del cuore (3 e 4 in verde). (B) Fotografia di una diapositiva con una serie di sezioni trasversali consecutive colorate con AFOG (Fuchsin Acid Orange-G). Le prime sezioni (1 e 2, quadrati rossi) contengono l&#39;apice ventricolare, e le ultime sezioni del cuore (3 e 4, piazze verdi) comprendono bulbo arterioso. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg &quot;/&gt; Esempi Figura 4. Di analisi eseguita su sezioni cuore a 7 ​​giorni dopo cryoinjury. (A) AFOG (fucsina acida Orange-G) etichette di colorazione delle cellule muscolari sane in arancione, il tessuto cicatriziale che contiene collagene in blu e in rosso di fibrina. (B) In ibridazione in situ della catena pesante della miosina ventricolare (vmhc) visualizza mRNA intatto miocardio (colorazione blu). Il tessuto danneggiato è privo della trascrizione del gene cardiaco (linea rossa tratteggiata). (C) Immunoassaying di tropomiosina (verde) le etichette cardiomiociti integro e non tessuti danneggiati (circondata con la linea tratteggiata). DAPI (blu) macchie i nuclei di tutte le cellule. (D) cardiomiociti geneticamente etichettati espressa DsRed2 (rosso) nella loro nuclei. DAPI (blu) etichetta tutti i nuclei. La zona infartuata non contiene DsRed2 cellule positive (bianche linea tratteggiata).

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Singh, B. N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J. P., Weaver, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+of+newt:+a+recipe+for+regeneration.">Heart of newt: a recipe for regeneration.</a> J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).</li><li>Ausoni, S., Sartore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fish+to+amphibians+to+mammals:+in+search+of+novel+strategies+to+optimize+cardiac+regeneration.">From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration.</a> J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).</li><li>Borchardt, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+regeneration+in+non-mammalian+model+systems:+what+are+the+differences+between+newts+and+man.">Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man.</a> Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).</li><li>Bos, E. J. v. a. n. d. e. n., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+cryoinjury-induced+myocardial+infarction+in+the+mouse:+a+comparison+with+coronary+artery+ligation.">A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-H1300 (2005).</li><li>van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoinjury:+a+model+of+myocardial+regeneration.">Cryoinjury: a model of myocardial regeneration.</a> Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).</li><li>Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cryoinjury+induced+necrotic+heart+lesions+in+zebrafish+is+associated+with+epicardial+activation+and+cardiomyocyte+proliferation.">Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+heart+regenerates+after+cryoinjury-induced+myocardial+infarction.">The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction.</a> BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).</li><li>Gonz&#225;lez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptin+and+pontin+antagonistically+regulate+heart+growth+in+zebrafish+embryos.">Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos.</a> Cell. 111, 661-672 (2002).</li><li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate.">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li><li>Chablais, F., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF+signaling+between+blastema+and+wound+epidermis+is+required+for+fin+regeneration.">IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration.</a> Development. 137, 871-879 (2010).</li><li>Baust, J. G., Gage, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+cryosurgery.">The molecular basis of cryosurgery.</a> BJU Int. 95, 1187-1191 (2005).</li><li>Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+the+pathogenesis+of+heart+disease:+mechanisms+and+significance.">Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance.</a> Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).</li></ol>

La ricerca sperimentale sugli animali è stato approvato dall&#39;ufficio veterinario cantonale di Friburgo.

Cryoinjury è definito come il danno del tessuto controllata mediante l&#39;applicazione di estrema precisione freddo 14. Diretta shock termico distrugge le cellule dalla distruzione proteina intracellulare e da formazione di cristalli di ghiaccio liquido che rompe la membrana plasmatica. Di conseguenza, le cellule danneggiate muoiono nei processi di apoptosi e necrosi 14. Entrambi questi meccanismi di morte cellulare hanno dimostrato di contribuire alla perdita di tessuto dopo infarto miocardico 15. Così, cryoinjury rappresenta un modello adeguato di indurre un infarto cardiaco. Diversi studi hanno segnalato questo metodo ben dimostrato nei mammiferi, tra cui topi, ratti, conigli e maiali 6,7. L&#39;adattamento del protocollo cryoinjury in zebrafish permette una discussione più comparativo sulla risposta infarto tra specie diverse. Due altri gruppi sviluppato in modo indipendente la procedura cryoinjury per il cuore zebrafish adulto. Le differenze principali sono la surmetodi di Gery, il tipo di strumenti ed applicata tempo di congelamento. Nello studio di González-Rosa et al., Il pericardio è stato aperto per strappo del tessuto invece di taglio. Hanno usato 0,3 mm in rame filamento collegato ad un tubo poliammide pre-raffreddato in azoto liquido per congelare il cuore per alcuni secondi fino scongelamento potrebbe essere osservato 10. Nello studio di Schnabel et al., Un pezzo conico di ghiaccio secco di 20 mm di lunghezza con una punta di 2 mm nel suo diametro è stato utilizzato per toccare il cuore per 10 secondi 8. I due gruppi ottenuti danno ventricolare attraverso la morte del miocardio. Il vantaggio del nostro metodo è più riproducibile una deposizione di collagene ricco di cicatrice, che imita meglio le prime risposte guarigione infarto osservate nei sistemi di mammiferi. La fase critica durante la procedura di cryoinjury in zebrafish sta facendo una incisione attraverso la pelle e il sacco pericardico senza pungere il cuore sottostante. A Effettuare correttamentechirurgia d provoca piccolo sanguinamento. Sanguinamenti indica una puntura accidentale del ventricolo con le forbici. In tali casi, gli animali deve essere retratto dall&#39;esperimento. Al fine di evitare la puntura del cuore, il punto di forbici dovrebbe mirare a un angolo basso alla pelle. Un altro aspetto importante per creare una lesione riproducibile è l&#39;esatto posizionamento della sonda criogenica freddo sul ventricolo per la durata ottimale preciso. Troppo breve tempo di congelamento si tradurrà in infiammazione con la morte delle cellule poco. Congelamento prolungata, invece, può causare danni del cuore, che può portare ad una maggiore mortalità degli animali. Abbiamo determinato che il tempo ottimale per tenere il ventricolo negli intervalli stato congelato tra 23-26 secondi per un zebrafish lunga di 2 cm adulti, e può variare dipendentemente dalla dimensione degli animali. Poiché il protocollo è molto semplice e rapido, non ci sono limiti sperimentalini nel sottoporre numero sufficiente di animali per ottenere adeguate repliche biologiche. Il trattamento criochirurgico è molto ben tollerato dagli animali. Raccolta dei cuori a tempi diversi dopo cryoinjury consente caratterizzazione dettagliata delle fasi successive durante il processo di rigenerazione. L&#39;analisi sperimentale dei cuori cryoinjured possono includere 1) visualizzazione di trascrizione genica mediante ibridazione in situ, 2) il rilevamento della distribuzione proteina mediante colorazione immunofluorescente, 3) l&#39;imaging istologica di strutture diverse. Comprendere i processi di guarigione chiave dopo infarto miocardico in zebrafish avrà un impatto sul campo della biologia rigenerativa. Inoltre, potrebbe essere di beneficio per la progettazione di nuovi approcci terapeutici nella medicina rigenerativa.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Micro forbici primavera sezionare </td><td> Roboz Surgical Instrument Co., Inc. </td><td> RS-5602 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Formaldeide ~ 36% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 47630 </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84100 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek ottobre composto </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Slides SuperFrost Plus </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Peel-A-Way Stampi - stampi usa e getta Incorporare troncati T8 </td><td> Polyscience, Inc. </td><td> 18985 </td></tr></tbody></table>

induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury

Il cuore dei mammiferi non è in grado di rigenerazione significativa a seguito di una lesione acuta, come infarto miocardico 1. Al contrario, anfibi e pesci teleostei urodele mantenere una notevole capacità di rigenerazione cardiaca con poca o nessuna cicatrice per tutta la vita 2,3. Non si sa perché solo alcuni vertebrati non-mammiferi in grado di ricreare un organo completo dai tessuti rimanenti 4,5. Per capire le differenze molecolari e cellulari tra le risposte di rigenerazione in specie diverse, abbiamo bisogno di usare approcci simili per indurre le lesioni acute. Nei mammiferi, il modello più frequentemente usato per studiare la riparazione è stata ischemia cardiaca acuta dopo una legatura dell&#39;arteria coronaria o di distruzione dei tessuti dopo cryoinjury 6,7. La rigenerazione cardiaca in tritoni e zebrafish è stata prevalentemente studiata dopo una resezione parziale del 2,3 apice ventricolare. Recentemente, diversi gruppi hanno establmentata la tecnica cryoinjury in 8-10 zebrafish adulti. Questo metodo ha un grande potenziale perché consente una discussione comparativa dei risultati ottenuti dalle specie di mammiferi e non mammiferi. Qui, vi presentiamo un metodo per indurre una riproducibile a forma di disco infarto del ventricolo zebrafish da cryoinjury. Questo modello pregiudizio si basa su un rapido congelamento-scongelamento tessuto, che provoca la morte cellulare massiccia di circa il 20% dei cardiomiociti della parete ventricolare. In primo luogo, una piccola incisione è stata effettuata mediante il torace con le forbici iridectomia per accedere al cuore. La parete ventricolare è stato congelato applicando direttamente per 23-25 ​​secondi una criosonda acciaio inossidabile preraffreddata in azoto liquido. Per interrompere il congelamento dell&#39;acqua cuore, pesce a temperatura ambiente è stato caduto sulla punta della sonda criogenica. La procedura è ben tollerata da animali, con un tasso di sopravvivenza del 95%. Per caratterizzare il processo di rigenerazione, i cuori eranoraccolti e fissati in giorni diversi dopo cryoinjury. Successivamente, il campione sono stati incorporati per criosezionamento. I vetrini con sezioni sono state preparate per l&#39;analisi istologica, ibridazione in situ e immunofluorescenza. Questo impegno accresce la nostra comprensione dei fattori che sono necessari per la plasticità rigenerativa nel zebrafish, e di fornire nuove intuizioni nella macchina di rigenerazione cardiaca. Una comprensione concettuale e molecolari della rigenerazione cardiaca in zebrafish avrà un impatto sia della biologia dello sviluppo e della medicina rigenerativa.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury at JoVE.com

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Zebrafish rappresenta un modello importante per studiare i meccanismi di rigenerazione cardiaca nei vertebrati. Qui vi presentiamo un protocollo per l&#39;induzione di un infarto cardiaco in zebrafish adulti usando cryoinjury. Questo metodo comporta la morte cellulare massiccio entro il 20% della parete ventricolare, simile a quella osservata in infarti mammiferi.

L&#39;induzione di infarto miocardico in Zebrafish adulti usando Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

induction-of-myocardial-infarction-in-adult-zebrafish-using-cryoinjury

Research

JoVE Journal

Medicine

22.0K Views.  University of Fribourg, Fribourg, Switzerland. Zebrafish rappresenta un modello importante per studiare i meccanismi di rigenerazione cardiaca nei vertebrati. Qui vi presentiamo un protocollo per l'induzione di un infarto cardiaco in zebrafish adulti usando cryoinjury. Questo metodo comporta la morte cellulare massiccio entro il 20% della parete ventricolare, simile a quella osservata in infarti mammiferi.

Video: Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Infarto acuto del miocardio in topi

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Ricerca

Medicina

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

Infarto miocardico e funzionale Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimal procedura chirurgica invasiva di indurre infarto miocardico nei topi

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Reliable and accurate outcome assessment is the key for translation of preclinical therapies into clinical treatment. The current paper describes how to assess three clinically relevant primary outcome parameters of cardiac performance and damage in a pig acute myocardial infarction model.

La valutazione dell&#39;outcome primario in un modello suino di infarto miocardico acuto

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Infarto del miocardio in topi neonati, un modello di rigenerazione cardiaca

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Real-time Pressure-volume Analysis of Acute Myocardial Infarction in Mice

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any potential therapeutic approach directed against acute left ventricular (LV) dysfunction. Current imaging modalities (e.g., echocardiography and magnetic resonance imaging) have several limitations since data on LV pressure cannot directly be measured. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion could serve as a novel method for a real-time evaluation of LV function.
At the beginning of the procedure, mice were anesthetized followed by endotracheal intubation. For LV catheterization, the right carotid artery was exposed via middle-neck incision. The catheter was introduced and placed into the LV cavity. Left thoracotomy was conducted and the left main coronary artery (LCA) was ligated. To induce reperfusion, the suture was released after 45 min. Pressure-volume data was recorded at all times.
Ligation of the LCA caused a decrease in LV systolic function as evidenced by a 30% reduction in stroke volume, LV ejection fraction (EF), and cardiac output. Maximum dP/dt as a parameter for LV contractility was also significantly reduced and diastolic function was severely impaired (minimum dP/dt -40%). Reperfusion over a period of 20 min did not lead to a complete recovery of LV function.
Real-time pressure-volume analysis served as a valid procedure for monitoring cardiac function during acute myocardial infarction in mice. Maintaining stable anesthesia and a standardized surgical approach was crucial to ensure valid results. As the early phase of acute myocardial infarction is critical for morbidity and mortality, the delineated method could be beneficial for preclinical evaluation of new strategies for cardioprotection.

Acute myocardial infarction in mice induces acute but incompletely characterized changes in left ventricular (LV) function. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion serves as a novel method for a real-time evaluation of LV function.

Analisi in tempo reale pressione-volume di infarto miocardico acuto nei topi

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Un modello di criolesionismo per studiare l'infarto miocardico nel mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

A Modified Simple Method for Induction of Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI remodeling and evaluation of novel therapeutics. Different methods (e.g., isoproterenol treatment, cryoinjury, coronary artery ligation, etc.) have been used to induce MI. Compared with isoproterenol treatment and cryoinjury, coronary artery ligation may better reflect the ischemic response and chronic remodeling after MI. However, traditional methods for coronary ligation in mice are technically challenging. The current study describes a simple and efficient process for induction of MI in mice with readily available materials. The mouse chest skin was cut open under stable anesthesia. The heart was immediately externalized through the intercostal space after blunt separation of the pectoralis major and pectoralis minor. The left anterior descending branch (LAD) was ligated with a 6-0 suture 3 mm from its origin. Following LAD ligation, staining with 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) indicated successful induction of MI and temporal changes of post-MI scar size. Meanwhile, survival analysis results showed overt mortality within 7 days after MI, mainly due to cardiac rupture. Moreover, post-MI echocardiographic assessment demonstrated successful induction of contractile dysfunction and ventricular remodeling. Once mastered, an MI model can be established in mice within 2-3 min with readily available materials.

Under adequate anesthesia, the mouse heart was externalized through the intercostal space, and myocardial infarction was successfully induced by ligating the left anterior descending artery (LAD) using materials readily available in most laboratories.

Un metodo semplice modificato per l'induzione dell'infarto miocardico nei topi

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI ...