Per iniziare, utilizzare forbici o cesoie per impieghi gravosi per tagliare l'estremità del tappo a 0.5 millimetri dal fondo conico di una provetta per microcentrifuga da 1.5 millilitri. Metti un pezzo di lana di vetro nel tubo tagliato per coprire il foro centrale. Posizionare un'unità filtrante in lana di vetro assemblata in una provetta sterile per microcentrifuga da 1,5 millilitri ed etichettare la provetta.
Successivamente, tagliare una piastra PCR a 96 pozzetti senza bordatura in sei rack di supporto a due colonne. Capovolgere le rastrelliere a due colonne in modo che i fondi conici dei pozzetti siano rivolti verso l'alto. Metti il rack in una capsula di Petri di vetro contenente carta da filtro umida e coprila con il coperchio per creare una camera di umidità per le guaine fogliari.
Per raccogliere i conidi dalla sporulante Colletotrichum graminicola, aggiungere tre o quattro millilitri di acqua deionizzata sterile nel piatto. Usando un pestello sterile a punta conica, raschiare uniformemente su tutta la piastra per staccare le spore dall'agar. Aggiungere asetticamente un millilitro di sospensione di spore su un'unità filtrante in lana di vetro e lasciare che le spore fluiscano nella provetta di raccolta per gravità.
Centrifugare la sospensione di spore filtrate a 3.500 g per cinque minuti e versare il liquido in un contenitore autoclavabile. Aggiungere un millilitro di acqua deionizzata sterile nella provetta di raccolta e agitare delicatamente per risospendere le spore pellettate. Anche in questo caso, centrifugare la sospensione e risospendere le spore per la quantificazione in 300-500 microlitri di acqua deionizzata.
Utilizzare un emocitometro al microscopio composto con un ingrandimento di 100 volte per determinare la concentrazione di spore. Quindi preparare 500.000 spore per millilitro di sospensione con acqua deionizzata. Per rimuovere la guaina dalla prima foglia vera delle piantine a due stadi.
Far scorrere una miniatura lungo il margine sovrapposto della guaina e allentarla delicatamente dallo scivolo. Tagliare la guaina fogliare recuperata in segmenti da tre a cinque centimetri. Srotolare con cura ogni segmento per esporre lo strato epidermico interno.
Applicare 20 microlitri di sospensione di spore fungine sulla superficie interna al centro della guaina sopra la nervatura centrale. Posizionare le guaine fogliari inoculate orizzontalmente, con una nervatura centrale posizionata in basso, in una piastra di Petri di vetro contenente carta da filtro inumidita. Successivamente, posizionare le piccole camere di umidità in una scatola trasparente rivestita con carta di germinazione inumidita, coprire la scatola di conservazione con un coperchio e incubare a 23 gradi Celsius sotto illuminazione continua per il tempo previsto.
Controllare regolarmente le caselle per segni di malattia sulle guaine.
