Gli autori desiderano ringraziare il Maize Genetics Cooperation, il Maize Cell Genomics Project, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers University, NJ) e Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) per aver fornito gli stock mutanti e transgenici, così come Robert F. Baker e Alexander Jurkevich dell'Advanced Light Microscopy Core presso l'Università di Missouri-Columbia per la loro assistenza con la microscopia confocale. JMR è stato supportato dalla J. William Fulbright Fellowship, dal Diane P. and Robert E. Sharp Fund e dal Plant Genome Research Program (IOS-1546873) della National Science Foundation a PM. CDTC, CMRV, EDCDP e RJRR sono supportati dal programma di borse di studio dell'Ateneo College. CDTC, EDCDP e RJRR sono supportati dalla borsa di studio universitaria DOST-SEI S & T. DODL è supportato da P. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. RJRR è supportato da Aiducation International-Pathways to Higher Education Scholarship. Questo lavoro è stato sostenuto dalla School of Science and Engineering e dalla Rizal Library, Ateneo de Manila University.

Metodi migliorati per l'imaging dei Primordia delle foglie di mais

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

Presentiamo due metodi per preparare i primordi delle foglie di mais per l'imaging cellulare. Il primo metodo (sezione 2 del protocollo) consente la misurazione del primordium per l'analisi della sezione trasversale, mentre il secondo metodo (sezione 3 del protocollo) consente lo srotolamento e l'appiattimento del primordium per l'analisi a montaggio completo. Questi metodi facilitano l'imaging cellulare dei FP nei primordi24 delle foglie di mais (come mostrato nelle Figure 4 e 5) e forniscono soluzioni semplici alle sfide legate allo sviluppo delle foglie di mais per lo sviluppo dell'imaging. La sezione 2 del protocollo riduce il tempo di dissezione e migliora l'accuratezza del campionamento misurando i primordi prima del sezionamento piuttosto che basarsi esclusivamente sui parametri di stadiazione 9,16. Con il nano nastro disponibile in commercio, la sezione 3 del protocollo risolve l'annoso problema dell'imaging dei primordi a foglia intera nel mais. Questo protocollo migliora il metodo precedente, che utilizzava il tubo di dialisi 31, ed è un'alternativa molto più economica alla TC e alla risonanza magnetica11,32,33. Tuttavia, quando si tratta di visualizzare i tratti anatomici delle foglie e produrre risultati ottimali, entrambi i protocolli hanno alcune limitazioni, che sono delineate nella Tabella 2 e sono discusse più dettagliatamente di seguito.
Nella sezione 2 del protocollo, abbiamo riscontrato difficoltà a visualizzare i contorni delle cellule in sezioni trasversali spesse dei primordi fogliari e la controcolorazione con coloranti fluorescenti leganti la parete cellulare o la membrana plasmatica non ha fornito risultati soddisfacenti. Ad esempio, FM 4-64 ha prodotto risultati subottimali rispetto al marcatore FP della membrana plasmatica, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figura 3A-D). Per superare questa limitazione, si consiglia di utilizzare un vibratomo per produrre sezioni di tessuto più sottili (~ 0,1 mm)58 che consentiranno una vivida imaging a campo chiaro dei contorni delle cellule o l'ottimizzazione del protocollo di controcolorazione47,59.
Nella sezione 3 del protocollo, la limitazione principale è la difficoltà di montare l'anta senza strappi, danni o bolle d'aria, come dettagliato nei passaggi del protocollo 3.2.5-3.2.6 (Figura 3E-K). Poiché la foglia di mais è bilateralmente simmetrica, una montatura a mezza foglia piuttosto che una montatura a foglia intera può essere sufficiente per la visualizzazione9. Per fare questo, il primordio può essere tagliato con una lama di rasoio lungo l'asse longitudinale dopo averlo srotolato fino alla nervatura centrale, consentendo solo la metà della foglia da montare. Un'altra limitazione della sezione 3 del protocollo è che lo spessore della foglia può limitare la risoluzione ottica del segnale fluoroforo durante l'imaging profondo. Per risolvere questo problema, è possibile utilizzare una tecnica di pulizia dei tessuti60. Tuttavia, abbiamo scoperto che ClearSee61, un reagente di compensazione comunemente usato per l'imaging dei tessuti vegetali, non è compatibile con il protocollo perché provoca il distacco del campione e del coprislip dal nano nastro. Una potenziale soluzione a questo problema potrebbe essere quella di applicare una membrana semipermeabile31 sul campione fogliare, consentendo di trattarlo con la soluzione di compensazione mentre viene tenuto in posizione dal nano nastro. Tale metodo che consente di applicare soluzioni liquide alla foglia non arrotolata potrebbe anche essere utilizzato per tecniche di ibridazione e immunolocalizzazione dell'RNA intero in situ, che sono state precedentemente ottimizzate per lo sviluppo di infiorescenze di mais ma non per primordi a foglia intera62,63.
Abbiamo descritto i protocolli per il mais, che ha grandi primordi fogliari anche nella fase di semina. Altre specie di erba con primordi fogliari molto più piccoli, come riso, orzo, grano, Setaria e Brachypodium 16,23,64,65,66, possono richiedere l'uso di ulteriori strumenti di precisione per applicare efficacemente questi protocolli. Inoltre, questi protocolli non erano destinati all'imaging di cellule vive, che cattura i processi dinamici in tempo reale di formazione dei tessuti e le risposte cellulari. Tuttavia, poiché le sonde fluorescenti, le tecnologie di imaging e le capacità di calcolo continuano a progredire nell'imaging di cellule vive per le piante67, la ricerca futura potrebbe basarsi su questi protocolli per sviluppare strategie di imaging di cellule vive su misura per le caratteristiche uniche dei primordi delle foglie d'erba.

Le colture erbacee sono una delle principali fonti di cibo e biocarburanti per la popolazione mondiale1 e migliorare l'anatomia delle foglie ha il potenziale per aumentare la loro produttività 2,3. Tuttavia, la nostra attuale comprensione di come l'anatomia delle foglie è regolata nelle erbe è limitata4 e richiede l'analisi dei primordi fogliari, poiché molti tratti anatomici e fisiologici della foglia sono predeterminati all'inizio dello sviluppo 5,6,7. Le tecniche di imaging cellulare, come la fluorescenza e l'imaging confocale, sono indispensabili per studiare l'anatomia delle foglie di erba e i tratti cellulari, ma queste tecniche sono difficili da applicare ai primordi delle foglie di erba perché sono profondamente inguainate e arrotolate all'interno della spirale fogliare. Abbiamo affrontato questo problema sviluppando metodi per la preparazione di sezioni trasversali e supporti a foglia intera srotolati per la fluorescenza e l'analisi confocale dei primordi delle foglie di mais, un sistema modello per lo studio dell'anatomia e dello sviluppo delle foglie di erba 2,8.
La foglia di mais, come tutte le foglie d'erba, è costituita da una lama a forma di cinghia con una guaina che avvolge il gambo e sviluppa germogli 9,10,11,12,13. Le foglie si sviluppano dal meristema apicale del germoglio (SAM) in uno schema distico, dove ogni nuova foglia inizia nella posizione opposta della foglia precedente, risultando in due file di foglie lungo l'asse verticale (Figura 1A)14 . Lo stadio di sviluppo di ciascun primordio fogliare è identificato dalla sua posizione rispetto al SAM, con il primordio più vicino designato come plastocrono1 (P1) e i seguenti primordi designati come P2, P3 e così via (Figura 1B, C) 2. Durante lo sviluppo (Figura 1D), il primordio fogliare appare prima come un contrafforte a forma di mezzaluna attorno alla base del SAM (P1), e poi cresce in un primordio a forma di cappuccio che si estende sul meristema (P2)9,10,11. I margini basali del cappuccio si espandono lateralmente e si sovrappongono l'un l'altro mentre la punta cresce verso l'alto, formando un primordio a forma di cono (P3-P5)10. Il primordio cresce quindi rapidamente in lunghezza, e il bordo della guaina-lama alla base diventa più prominente con la formazione del ligule, la proiezione frangia sul lato adassiale della foglia (P6/P7). Infine, la foglia si srotola mentre emerge dalla spirale durante la crescita allo stato stazionario, in cui le cellule in divisione sono limitate all'interno della piccola regione basale della lama, formando un gradiente con cellule in espansione e differenziazione lungo l'asse prossimale-distale (P7/P8)15. L'apice del germoglio di una piantina di mais contiene più primordi in diversi stadi di sviluppo, rendendolo un modello eccellente per studiare lo sviluppo delle foglie8.
Un'analisi accurata dello sviluppo precoce delle foglie richiede la stadiazione o l'uso di criteri standardizzati per definire fasi distinte dello sviluppo del primordium in relazione ad altri parametri morfologici o di crescita. Poiché i primordi fogliari sono nascosti all'interno del germoglio d'erba, i ricercatori in genere usano parametri come l'età della pianta o la dimensione delle foglie emergenti come predittori per gli stadi e le dimensioni dei primordi fogliari 9,16. Nel mais, l'età cronologica della pianta è determinata dal numero di giorni dopo la semina o la germinazione (DAP/DAG)17,18. Lo stadio vegetativo (stadio V) è determinato dalla foglia più alta con un colletto visibile, una linea chiara sul lato abassiale tra la lama e la guaina che corrisponde alla posizione della ligula e dei padiglioni auricolari, una coppia di regioni a forma di cuneo alla base della lama (Figura 1A,B)17,19 . Tra 20 e 25 DAG, il SAM passa in un meristema di infiorescenza e cessa di produrre nuove foglie20. I tassi di crescita dei primordi delle foglie di mais possono variare a seconda dell'ambiente e del genotipo della pianta. Per questo motivo, l'età delle piante e le dimensioni delle foglie emergenti non possono prevedere con precisione le dimensioni dei primordi fogliari; Tuttavia, l'utilizzo di questi parametri può aiutare a prevedere la gamma di stadi e dimensioni di Primordia per scopi sperimentali.
L'analisi della sezione trasversale è un metodo popolare per esaminare l'anatomia e lo sviluppo delle foglie nel mais e in altre erbe perché consente il campionamento di più plastocroni in una singola sezione attraverso il germoglio21,22,23. Questo metodo è anche conveniente per l'imaging cellulare di campioni freschi, poiché le foglie circostanti fungono da impalcatura che mantiene i primordi fogliari in posizione durante il sezionamento e il montaggio24. Tuttavia, uno svantaggio di questo metodo è che può essere difficile localizzare con precisione il plastocron bersaglio e la regione all'interno del primordio quando si seziona da un germoglio intatto. Inoltre, poiché la crescita delle foglie varia tra i plastocroni e lungo l'asse prossimale-distale2,5, un campionamento impreciso potrebbe comportare un'interpretazione errata dello stadio di sviluppo e della regione del primordio in una data sezione. Pertanto, lo sviluppo di un metodo per il campionamento preciso della sezione trasversale è fondamentale per garantire l'accuratezza e la riproducibilità delle analisi anatomiche e dello sviluppo dei primordi delle foglie di erba.
L'analisi a montaggio di foglie intere consente l'indagine completa e integrativa dei processi tissutali e cellulari che si verificano su scala dell'intero organo, come la crescita proliferativa25 e il pattern venoso26,27,28. Il metodo fornisce una panoramica paradermica della foglia, consentendo la scoperta di processi e modelli distinti che altrimenti sarebbero difficili da rilevare utilizzando l'analisi della sezione trasversale24,27. A differenza di Arabidopsis, dove esistono già metodi consolidati per l'imaging di supporti a foglia intera29,30, attualmente non esiste un metodo standard per l'imaging di supporti a foglia intera non arrotolati nelle erbe. Un precedente protocollo per srotolare primordi isolati di foglie di mais coinvolgeva materiali non comuni e non era adatto per l'imaging cellulare31. Le tecniche di imaging avanzate, come la tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MRI), possono acquisire informazioni anatomiche 3D senza isolare e srotolare i primordi 11,32,33, ma sono costose e richiedono attrezzature specializzate. Lo sviluppo di una tecnica per superare i vincoli imposti dalla morfologia laminata e conica dei primordi fogliari nel mais e in altre erbe farebbe progredire le indagini sui loro tratti anatomici e di sviluppo.
Qui presentiamo metodi per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di primordi di foglie di mais per la fluorescenza e l'imaging confocale. Abbiamo usato questi metodi per quantificare il numero di vene e mappare la distribuzione ormonale spazio-temporale nei primordi delle foglie di mais con proteine fluorescenti (FP)24. Il primo metodo consiste nel rimuovere la parte superiore delle foglie più vecchie dalle piantine di mais con uno spellafili (Figura 1E). Esponendo la punta del primordio (P5-P7), diventa possibile determinarne la lunghezza senza dover rimuovere completamente le foglie circostanti più vecchie, consentendo così un sezionamento facile e preciso. Il secondo metodo prevede lo srotolamento e il montaggio di primordi a foglia intera (P3-P7) con nastro nano biadesivo trasparente (Figura 1F). Questi metodi sono adatti per visualizzare vari FP24, ma necessitano di ottimizzazione per l'utilizzo di coloranti fluorescenti e reagenti di clearing. Inoltre, delineiamo alcune procedure per appiattire gli stack z, cucire le immagini e unire i canali in ImageJ/FIJI34, che si applicano alle immagini prodotte dai due metodi. Questi metodi sono utili per la fluorescenza di routine o l'imaging confocale delle foglie di mais, ma possono anche essere adattati per altre specie di erba modello, come riso, Setaria e Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> Figura 1: Organizzazione e morfologia dei primordi delle foglie di mais e panoramica dei metodi . (A) Rappresentazione schematica di una piantina di granturco. Il mais ha una fillotassia distica, con la nuova foglia che inizia nella posizione opposta della foglia precedente. Il numero di foglie indica l'ordine cronologico in cui le foglie sono emerse dalla germinazione (cioè prima foglia, L1; seconda foglia, L2; terza foglia, L3; ecc.). Ogni foglia ha una lama distale e una guaina basale delineata da un collare che corrisponde alla ligula e al padiglione auricolare. La foglia più alta con il colletto visibile denota la fase vegetativa. La piantina in questo esempio è allo stadio V2, con il collare L2 (punta di freccia) visibile. L'icona delle forbici indica la posizione al mesocotile (me) dove la piantina deve essere tagliata per essere raccolta. (B) Rappresentazione schematica del germoglio sezionato che mostra isolati da L1 a L4, con i primordi fogliari da L5 a L9 mostrati come immagine ingrandita in (C). Il numero di plastocroni indica la posizione del primordio rispetto al SAM, con il primordio fogliare più giovane (P1) più vicino al SAM e i primordi fogliari più vecchi (P2, P3, P4 e così via) successivamente più lontani2. (D) Rappresentazione schematica della morfologia dei primordi delle foglie di mais da P1 a P5. (E) Panoramica schematica del metodo per l'analisi della sezione trasversale dei primordi delle foglie di mais. (1) Tagliare le foglie più vecchie con uno spellafili. (2) Misurare il primordio e sezionare le riprese. (3) Montare la sezione su una diapositiva per l'imaging e l'elaborazione (4, 5). F) Panoramica schematica del metodo di analisi a montaggio intero dei primordi delle foglie di granturco. (1) Rimuovere le foglie circostanti per estrarre il primordium. (2) Tagliare e srotolare il primordium piatto sul nano nastro. (3) Montare il campione per l'imaging e l'elaborazione (4, 5). Abbreviazioni: L = foglia; bl = lama; sh = guaina; co = collare; me = mesocotile; V = vegetativo; P = plastocron; SAM = meristema apicale di tiro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

Nel mais (Zea mays) e in altre graminacee (Poaceae), i primordi fogliari sono profondamente inguainati e arrotolati all'interno della spirale fogliare, rendendo difficile studiare lo sviluppo precoce delle foglie. Qui descriviamo i metodi per preparare sezioni trasversali e supporti interi srotolati di primordi di foglie di mais per la fluorescenza e l'imaging confocale. Il primo metodo utilizza uno spellafili per rimuovere le porzioni superiori delle foglie più vecchie, esponendo la punta del primordio fogliare e consentendo la sua misurazione per un campionamento più accurato della sezione trasversale. Il secondo metodo utilizza nastro nano trasparente e biadesivo per srotolare e montare primordi a foglia intera per l'imaging. Mostriamo l'utilità dei due metodi nella visualizzazione e nell'analisi dei reporter di proteine fluorescenti nel mais. Questi metodi forniscono una soluzione alle sfide presentate dalla morfologia distintiva dei primordi delle foglie di mais e saranno utili per visualizzare e quantificare i tratti anatomici e di sviluppo delle foglie nel mais e in altre specie di erba.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autore in primo piano: Metodi migliorati per la preparazione di sezioni trasversali e montature intere srotolate di Primordia fogliare di mais per la fluorescenza e l'imaging confocale  

Metodi migliorati per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di Primordia di foglie di mais per fluorescenza e imaging confocale

Grasses like maize have leaf primordia grow within the shoot, making them difficult to study. We address this problem with improved protocols for preparing maize leaf transverse sections and whole mounts for fluorescence and confocal imaging. The first protocol uses a wire stripper to cut the older leaves, allowing the measurement of the primordium prior to sectioning.The second protocol uses clear, double-sided nano tape to unroll whole leaf primordium. These protocols improve the accuracy of transverse sectioning and enable unrolling of the leaf primordia, which have been very difficult to achieve due to their rolled, conical morphology. These methods will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grasses.Based on these methods, we plan to develop live cell imaging strategies to address questions in grass leaf development.

Analisi della sezione trasversale dei primordi delle foglie di mais Abbiamo usato la sezione 2 del protocollo per quantificare il numero di vene e caratterizzare i modelli di risposta ormonale nelle sezioni trasversali dei primordi delle foglie di mais con FP (Figura 4) 24. Per valutare il ruolo dell'ormone vegetale auxina nella crescita fogliare e nella formazione delle vene, abbiamo quantificato il numero di vene nei primordi fogliari di un mutante di mais carente di auxina, nappa evanescente254. Nei primi plastocroni, le vene in via di sviluppo mostrano una netta cellularizzazione nello strato cellulare mediano del primordium21,22 delle foglie di mais. Tuttavia, identificare e contare le vene utilizzando tecniche istologiche convenzionali22 può essere laborioso e richiedere molto tempo. Quindi, per quantificare le vene, abbiamo utilizzato il marcatore proteico di efflusso di auxina del mais p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP di seguito), che segna le vene in via di sviluppo e i filamenti procambiali (PCS; Figura 4A). Utilizzando la sezione 2 del protocollo, siamo stati in grado di standardizzare il campionamento della sezione trasversale misurando i primordi prima del sezionamento (Figura 4B, C). Abbiamo scoperto una tendenza in cui vt2 ha un primordio più ampio e più vene del normale (Figura 4D, E) 24, che è coerente con i dati delle foglie55 completamente espanse, indicando che il difetto in vt2 è iniziato presto nello sviluppo delle foglie. Utilizzando la sezione 2 del protocollo, siamo stati anche in grado di esaminare sistematicamente i modelli di espressione dei reporter FP di risposta ormonale nei primordi fogliari (vedi esempi delle immagini in Figura 4F-I). Attraverso uno schema di campionamento standardizzato della sezione trasversale, abbiamo mappato la distribuzione delle risposte di auxina, citochinina (CK) e acido gibberellico (GA) attraverso diversi plastocroni e regioni dei primordi fogliari e abbiamo scoperto nuovi modelli di risposta che ipotizziamo abbiano implicazioni per la crescita fogliare e la formazione delle vene24. Pertanto, questi risultati rappresentativi dimostrano l'utilità della sezione 2 del protocollo per l'analisi della sezione trasversale dei primordi delle foglie di mais.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> Figura 4: Risultati rappresentativi per l'analisi della sezione trasversale dei primordi delle foglie di mais. (A-E) Quantificazione del numero di vene e della larghezza del primordio nei primordi fogliari di nappe normali e evanescenti2 con il marcatore proteico di efflusso di auxina PIN1a-YFP. (A) Immagini rappresentative di fluorescenza di sezioni trasversali da P5 a P7 che esprimono PIN1a-YFP nelle vene in via di sviluppo e nei filamenti procambiali. Le sezioni trasversali sono state riprese con un microscopio a epifluorescenza utilizzando un filtro FITC (eccitazione 495-519 nm). Il numero di vene e la larghezza del primordio sono stati quantificati utilizzando rispettivamente gli strumenti multipunto e linea a mano libera in FIJI/ImageJ. (B) Una piantina di granturco con le spirali delle foglie superiori rimosse con uno spellafili per esporre la punta della quarta foglia (L4). La parentesi si estende sulla lunghezza del primordio proiettato, con la linea tratteggiata che indica la lunghezza media. (C) Diagramma schematico di varie forme primordiali da P5 a P7, che illustra come il numero di vene e la larghezza del primordium a metà lunghezza (linea tratteggiata orizzontale) possono variare a seconda dello stadio di sviluppo del primordium. (D,E) Misura della larghezza del primordio (D) e del numero di vene (E) nella sezione di media lunghezza della L4 di normale e vt2. La linea di tendenza rappresenta le medie mobili di 10 mm delle misurazioni ± l'errore standard della media (SEM). (F-I) Immagini confocali rappresentative di sezioni trasversali di primordi fogliari che esprimono combinazioni di PIN1a-YFP, reporter di risposta auxina, DR5-RFP, reporter di risposta alla citochinina, TCS-Tomato, marcatore sensibile all'acido gibberellico, GAR2-YFP e mDII-Venus, una versione mutata del reporter di ingresso di segnalazione auxina DII-Venus. I canali FP sono sovrapposti al canale a campo chiaro in ogni immagine. Barra di scala = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Questa figura è stata modificata e riprodotta con il permesso di Robil e McSteen24. Abbreviazioni: DAG = giorni dopo la germinazione; P = plastocron; vt2 = nappa evanescente2; PCS = filamento procambiale; YFP = proteina fluorescente gialla; FITC = isotiocianato di fluoresceina; RFP = proteina fluorescente rossa; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Pomodoro = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venere = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Analisi a montaggio intero dei primordi delle foglie di mais Abbiamo seguito la sezione 3 del protocollo per visualizzare e analizzare l'espressione di FP in mount a foglia intera di primordia di foglie di mais (Figura 5). Visualizzando i modelli di vene con PIN1a-YFP, abbiamo scoperto che la formazione delle vene si verifica nell'intero primordio durante i primi plastocroni, ma questo processo diventa limitato nelle regioni prossimali più avanti nello sviluppo (Figura 5A) 24. Complementari alle analisi della sezione trasversale, le analisi a montaggio a foglia intera hanno rivelato modelli specifici del tessuto e dello stadio della risposta ormonale durante la formazione della vena24. Un esempio è il modello di espressione del reporter di risposta CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), relativo all'espressione PIN1a-YFP (Figura 5B)24. Seguendo la sezione 3 del protocollo, siamo stati in grado di eseguire analisi sia qualitative che quantitative dell'espressione di FP nei primordi fogliari (Figura 5D-F; dati non pubblicati). Abbiamo esaminato i modelli di espressione di un reporter di risposta auxina, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), e di un marcatore GA-responsive, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), in montature a foglia intera di mutanti singoli e doppidi vt2 e pianta nana3 (d3), un mutante56 carente di GA (Figura 5D). Abbiamo anche confrontato i livelli relativi di proliferazione cellulare tra primordi fogliari normali e vt2 usando p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), che è un marker per la transizione G1/S nel ciclo cellulare 57 (Figura 5E,F). Mentre non c'era alcuna differenza significativa tra normale e vt2, l'espressione di ciclina-D2B-YFP era coerente con il profilo di proliferazione cellulare noto dei primi plastocroni31. Concludiamo che la sezione 3 del protocollo è un metodo efficace per analizzare interi monti di primordi di foglie di mais, che sono difficili da visualizzare a causa della loro morfologia arrotolata.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> Figura 5: Risultati rappresentativi per l'analisi a montaggio intero dei primordi delle foglie di mais. (A) Immagini rappresentative di fluorescenza dei primordi fogliari di 7 piantine di mais DAG che mostrano vene in via di sviluppo e filamenti procambiali, come marcato dal marcatore proteico di efflusso di auxina PIN1a-YFP. I primordi P3-P6 sono stati asportati dalla base, srotolati e appiattiti con il lato adassiale verso l'alto. Gli inserti mostrano primi piani di P3 e P4. In P5 e P6, linee tratteggiate delimitano l'estremità distale delle zone proliferative, dove la maggior parte dei filamenti procambiali si sta ancora sviluppando e si estende. (B,C) Immagini confocali rappresentative che mostrano l'espressione di PIN1a-YFP e del reporter di risposta alla citochinina, TCS-Tomato, nella regione marginale prossimale di un primordio P5. (D) Immagini rappresentative di fluorescenza dei primordi P4 che mostrano l'espressione del reporter di risposta auxina, DR5-RFP, e del marcatore sensibile all'acido gibberellico, GAR2-YFP in mutanti normali e singoli e doppi di nappe evanescenti2 e piante nane3. (E) Immagini confocali rappresentative di P3 e/o P4 che mostrano l'espressione di Cyclin-D2B-YFP, un reporter per la transizione G1/S nel ciclo cellulare. (F) Quantità relative di proliferazione cellulare nei primordi fogliari P3/P4 di normale e vt2, quantificate misurando la densità integrata del segnale Cyclin-D2B-YFP sull'area del primordio utilizzando ImageJ/FIJI. Le barre rappresentano le misure medie ± l'errore standard della media. Barra di scala = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). La Figura 4A-C è stata modificata e riprodotta con il permesso di Robil e McSteen24, mentre la Figura 4D-F è costituita da dati non pubblicati dagli autori. Abbreviazioni: DAG = giorni dopo la germinazione; P = plastocron; vt2 = nappa evanescente2; d3 = pianta nana3; YFP = proteina fluorescente gialla; RFP = proteina fluorescente rossa; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Pomodoro = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Ciclina-D2B-YFP = p Zm Ciclina-D2B::ZmCiclina-D2B:YFP; ns = nessuna differenza significativa; au = unità arbitraria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Scheda supplementare 1: Esempi di stadiazione dello sviluppo fogliare nelle piantine di mais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S1: Campioni di piante e materiali utilizzati nei protocolli. (A,B) Una piantina di mais 7-8 DAG con la spirale delle foglie superiori rimossa usando uno spellafili. (B) L'inserto mostra un primo piano delle riprese con il primordio P6 esposto. (C-G) Germogli di piantine di mais con le spirali superiori rimosse per l'analisi della sezione trasversale (C,D) e le foglie circostanti completamente rimosse per l'analisi a montaggio intero (E-G). (H) Un rotolo di nastro nano biadesivo trasparente in gel poliuretanico. (I,J) P6 foglia primordium (I) e regione prossimale della foglia P8 (J) srotolati e montati su vetrini con il nano nastro. (K) Un vetrino con un primordium di foglie srotolato montato sul palcoscenico di un microscopio a epifluorescenza. Abbreviazione: DAG = giorni dopo la germinazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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I primordi delle foglie di mais sono profondamente inguainati e arrotolati, rendendoli difficili da studiare. Qui presentiamo metodi per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di primordi di foglie di mais per la fluorescenza e l'imaging confocale.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

Le erbe come il mais hanno primordi fogliari che crescono all'interno del germoglio, rendendoli difficili da studiare. Affrontiamo questo problema con protocolli migliorati per la preparazione di sezioni trasversali di foglie di mais e supporti interi per la fluorescenza e l'imaging confocale. Il primo protocollo utilizza uno spellafili per tagliare le foglie più vecchie, consentendo la misurazione del primordio prima del sezionamento.Il secondo protocollo utilizza nastro nano trasparente e biadesivo per srotolare l'intera foglia primordium. Questi protocolli migliorano l'accuratezza del sezionamento trasversale e consentono lo srotolamento dei primordi fogliari, che sono stati molto difficili da ottenere a causa della loro morfologia conica arrotolata. Questi metodi saranno utili per visualizzare e quantificare i tratti anatomici e di sviluppo delle foglie nel mais e in altre graminacee.Sulla base di questi metodi, abbiamo in programma di sviluppare strategie di imaging cellulare vivo per affrontare le domande sullo sviluppo delle foglie di erba.

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Biology

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

1.8K Views.  Ateneo de Manila University. Le erbe come il mais hanno primordi fogliari che crescono all'interno del germoglio, rendendoli difficili da studiare. Affrontiamo questo problema con protocolli migliorati per la preparazione di sezioni trasversali di foglie di mais e supporti interi per la fluorescenza e l'imaging confocale. Il primo protocollo utilizza uno spellafili per tagliare le foglie più vecchie, consentendo la misurazione del primordio prima del sezionamento.Il secondo protocollo utilizza nastro nano traspar...

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In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study early leaf development. Here, we describe methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. The first method uses a wire stripper to remove the upper portions of older leaves, exposing the tip of the leaf primordium and allowing its measurement for more accurate transverse section sampling. The second method uses clear, double-sided nano tape to unroll and mount whole-leaf primordia for imaging. We show the utility of the two methods in visualizing and analyzing fluorescent protein reporters in maize. These methods provide a solution to the challenges presented by the distinctive morphology of maize leaf primordia and will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grass species.

Maize leaf primordia are deeply ensheathed and rolled, making them difficult to study. Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging.

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﻿Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia

Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia  

Begin by cutting the desired aged maize seedling at the mesocotyl tissue using a small knife or pair of scissors. Clean the seedling with a paintbrush. Then hold the wire stripper with its jaws facing the chute.Position the chute to the selected hole and squeeze the stripper handles together. Slide the stripper away from the chute to trim the upper portion of the leaves. Use a ruler to measure the length from the primordium's tip to the chute's base.To begin the leaf primordium imaging, hold the chute steady on a smooth surface under a stereo microscope at around 0.8x magnification. Using a razor blade or scalpel, make an initial cut slightly above the target region to discard the distal portion of the chute. Then obtain around 0.25 to 0.8 millimeter thin sections at the desired points along the length of the primordium.Once done, mount the leaf section on a clean glass slide. Apply a few drops of water directly to the section using a pipette. And place a cover slip on top.Apply a few more drops through the edges of the cover slip if needed. Place the slide on the epifluorescence microscope's stage and adjust the settings to visualize the fluorophore. Using this method, chance resection sampling was standardized by measuring the primordia prior to sectioning.A trend was discovered showing that the vanishing tassel two had a wider primordia and more veins than normal, indicating that the defect in the mutant began early in the leaf development. This method also enabled the systematic examination of the expression patterns of hormone response fluorescent protein reporters in the leaf primordia.

Imaging delle sezioni trasversali dei primordi delle foglie di mais

Imaging Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia

Begin the preparation of the glass slide by cutting a rectangular piece of clear, double-sided nano tape and sticking it to the center of a clean glass slide without removing the protective plastic film on the top side of the tape. Next, dissect the chute by removing the upper portion of the older leaves with a wire stripper. Then hold the chute by the mesocaudal and carefully remove the surrounding leaves with a dental probe to extract the primordia of interest.For mounting the primordium, remove the protective film from the tape. Lay the exposed primordium on the tape. Cut the primordium at the base using a razor blade, discarding the basal stem and the hypocaudal.For smoother unrolling, lubricate the inner, or, adaxial leaf surface by dipping the needle tip into 100%glycerol. Unroll the primordium using a dental probe with a bent needle. Position the needle tip parallel to the surface and unfurl the outer basal margin by gently pressing it against the tape.With the outer margin adhering to the tape, align the needle tip parallel to the long axis of the leaf. Gently slide the needle sideways to unroll and flatten the leaf onto the tape. Apply a drop of water to the unrolled primordium.Immediately place a cover slip on the water drop and the primordium. Gently press down the edges of the cover slip so that they adhere to the tape. Once done, place the slide on the epifluorescence microscope stage to visualize the fluorophore.This method was followed to visualize and analyze the fluorescent protein expression in maize leaf primordia. Complementary to the transverse section analysis. The whole leaf mount analysis revealed tissue and stage-specific patterns of formal response during vein formation.Whole mount analysis method enabled qualitative and quantitative analyses of fluorescent protein expression in the maize leaf primordia, indicating the effectiveness of this method in examining the maize leaf primordia which are difficult to image due to their rolled morphology.