Per iniziare, posizionare le sezioni di tessuto mucoso nasale di ratto colorate con ematossilina ed eosina su un tavolino da microscopio. Regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando l'immagine non è chiaramente visibile. Cattura l'immagine del tessuto a 40X.
Riscaldare il tampone fosfato citrato fino a quando non bolle. Quindi aggiungere i vetrini al contenitore dopo averlo tolto dal fuoco. Dopo aver riscaldato per otto minuti fino all'ebollizione, spegnere il fuoco per otto minuti e successivamente passare a un fuoco medio basso per sette minuti.
Dopo aver lasciato raffreddare il contenitore, trasferite naturalmente le fette sul PBS. Usa uno shaker decolorante per scuotere le fette per cinque minuti. Quindi disegna un cerchio attorno al tessuto essiccato con una penna immunoistochimica.
Aggiungere una soluzione di perossido di idrogeno al 3% alle fette prima dell'incubazione. Quindi trasferire le fette su PBS per il lavaggio come prima. Per bloccare, applicare il siero di capra al 5% all'interno del cerchio contrassegnato.
Dopo l'incubazione, rimuovere con cautela la soluzione bloccante e aggiungere uno o due millilitri di FOXP3 alle fette di tessuto. Quindi mettere le fette in una camera umida per l'incubazione notturna. Dopo aver lavato le fette in PBS, tamponare delicatamente le fette per asciugarle con carta da filtro.
Quindi aggiungere uno o due millilitri della soluzione di anticorpi secondari alle fette. Successivamente, incubare le fette in 100 microlitri di soluzione di lavoro per l'amplificazione del segnale di tiramide per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo l'incubazione, lavare le fette con PBS tre volte per cinque minuti ciascuna.
Ora applicare uno o due millilitri di soluzione colorante DAPI sulle fette prima dell'incubazione. Estinguere l'autofluorescenza incubando le fette nel quencher per cinque minuti prima di un lavaggio PBS di 10 minuti. Quindi sigillarli con il quencher anti fluorescenza.
Cattura le immagini microscopiche delle sezioni colorate con ingrandimenti 20X e 40X. La colorazione con ematossilina ed eosina dei ratti di controllo ha mostrato cellule epiteliali e ciglia ben disposte. La mucosa del setto nasale è stata danneggiata e distaccata nel gruppo della malattia con notevole infiltrazione di neutrofili.
La colorazione multiimmunofluorescente ha rivelato che le espressioni di ROR Gamma T e TCAM1 erano aumentate nel gruppo della malattia. Tuttavia, FOXP3 è stato sottoespresso.
