L'influenza Haemophilus è una delle principali cause di infiammazione in varie malattie polmonari croniche tra cui BPCO e polmonite. Questo protocollo descrive i metodi per valutare l'effetto dell'emofilo sull'infiammazione polmonare. Il vantaggio di questa tecnica è che consente una valutazione completa delle risposte immunitarie innate e adattative.
Incubare 450 microlitri di sangue periferico con 50 microlitri di uno ioduro di propidio attivato marcato H influenzae in un tubo da cinque millilitri per 20 minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Rimuovere il campione dal bagnomaria, aggiungere cinque microlitri di DHR e vortice per 10 secondi. Quindi rimetterlo a bagnomaria per altri 10 minuti.
Dopo aver rimosso il campione dal bagnomaria, lisare gli eritrociti con cinque millilitri di soluzione di cloruro di ammonio allo 0,8% e analizzare i campioni su un citometro a flusso come descritto nel testo. Dividere il campione di sangue periferico in aliquote per il controllo e la stimolazione dell'antigene. Aggiungere anticorpi costimolatori a entrambi i campioni.
Quindi aggiungere l'influenza H non tipizzabile al campione di antigene e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora. Quindi, aggiungere l'agente bloccante del Golgi brefeldin A ai campioni e incubarli per altre cinque ore. Dopo aver lizzato gli eritrociti come dimostrato in precedenza, fissare i leucociti usando 500 microlitri di para-formaldeide da uno al 2% per un'ora.
Contare le cellule utilizzando un emocitometro, quindi permeabilizzare 1 milione di cellule con 100 microlitri di saponina allo 0,1% per 15 minuti. Quindi, incubare le cellule con anticorpi fluorescenti appropriati marcati. Lavare le cellule, quindi analizzarle utilizzando un citometro a flusso.
Determinare la proporzione di cellule che rispondono all'antigene ottenendo le popolazioni di linfociti pertinenti. Eseguire la colorazione di fondo su cellule non stimolate per tutte le citochine da analizzare. Tagliare circa 20-40 grammi del campione di lobectomia in sezioni da tre a cinque millimetri cubi.
Posizionarli all'interno di una camera sterile da 50 microlitri e frammentare meccanicamente il tessuto utilizzando un apposito disaggregatore. Dopo la disaggregazione tissutale, lisare i globuli rossi come dimostrato e risospendere le cellule in RPMI sterile. Quindi filtrare le cellule attraverso una rete sterile di nylon di 100 micrometri e contare le cellule vitali utilizzando il metodo di esclusione del blu tripano.
Per il test dell'infezione, risospendere le cellule polmonari in RPMI a una concentrazione finale di 4 milioni di cellule per millilitro per provetta. Quindi infettare le cellule con un MOI di 100 batteri per cellula. Allentare il tappo di mezza rotazione per consentire il trasferimento del gas nei tubi.
Posizionare le celle nel rotatore del tubo e incubarle a 37 gradi Celsius mentre ruotano a 12 RPM. Un'ora dopo la stimolazione, aggiungere grefeldina A per prevenire l'esportazione extracellulare di citochine e incubare le sospensioni cellulari per ulteriori 16-22 ore con rotazione. Il giorno seguente, lavare la sospensione cellulare con 500 microlitri di PBS contenente l'1% di albumina sierica bovina e lo 0,01% di azoturo di sodio.
Quindi, colorare la sospensione cellulare per specifici marcatori di superficie cellulare dei linfociti umani per un'ora. Quindi lavare le cellule con PBS e fissarle e permeabilizzarle come dimostrato in precedenza. Quindi, incubare le cellule con anticorpi intracellulari per la colorazione delle citochine per un'ora.
Quindi lavare le cellule e risospenderle in 100 microlitri di PBS prima dell'acquisizione dei dati su un citometro a flusso. Misurare la proteolisi tramite l'azione delle metalloproteinasi, aggiungere substrato di gelatina marcato con fluoresceina direttamente sui vetrini della sezione del tessuto polmonare. Posizionare i vetrini orizzontalmente e incubarli in una camera umidificata protetta dalla luce a 37 gradi Celsius per un'ora.
Per preparare i controlli negativi, aggiungere un tampone di reazione x senza gelatina fluorescente alle sezioni per ulteriori analisi. Le cellule mononucleate del sangue periferico sono state recintate usando sparsi in avanti e lateralmente per definire la popolazione di fagociti. La popolazione di fagociti è stata ulteriormente definita dall'espressione di CD14 per marcare i monociti.
La misurazione dei ROS è stata eseguita tramite ossidazione di DHR 123 per produrre fluorescenza. La fluorescenza mediana del campione stimolato è stata confrontata con il controllo. La produzione di citochine intracellulari da parte dei linfociti è stata misurata utilizzando la citometria a flusso.
Le cellule sono state analizzate prima per la loro espressione del marcatore leucocitario CD45 e poi per CD tre e CD quattro, CD otto. Le cellule CD tre, CD quattro positive sono state valutate per la produzione di citochine intracellulari nei campioni di controllo e stimolati. L'attività della proteasi è stata misurata mediante NC due zimografia in sezioni di tessuto polmonare non fissate.
La colorazione fluorescente ha indicato la presenza di attività MMP, che è stata anche co-localizzata con l'espressione della cromatina. L'aggiunta di anticorpi ai campioni di tessuto polmonare richiede concentrazione e la colorazione delle cellule richiederà l'ottimizzazione negli esperimenti preliminari. Il surnatante dei campioni di tessuto polmonare può essere ulteriormente analizzato per altri mediatori infiammatori utilizzando tecniche come ELISA e Queste tecniche possono essere utilizzate per valutare l'effetto di potenziali terapie sull'infiammazione polmonare.
