Per iniziare, preparare il sistema FPLC per la purificazione. Sciacquare accuratamente il percorso del flusso del liquido con acqua ultrapura sterile utilizzando istruzioni manuali o un metodo personalizzato. Collegare una colonna di eparina preconfezionata da un millilitro.
Regolare l'allarme di pressione. E lavare con cinque volumi di colonna di acqua ultrapura a una portata di un millilitro al minuto. Quindi cambiare le soluzioni per le pompe del sistema per prepararle all'applicazione del campione.
Lavare la pompa del sistema B con il tampone B e riempire il resto del percorso del flusso del liquido con il tampone A.Inserire il tubo del campione della pompa del campione nella preparazione virale. In alternativa, utilizzare un super loop per il campione. Inserire il tubo di uscita in un nuovo contenitore.
Quando si esegue la purificazione per la prima volta, definire un metodo personalizzato per la purificazione automatica. Dopo aver abilitato le impostazioni generali di purificazione, il metodo adescherà il percorso del flusso dall'ingresso del campione S1 alla valvola di iniezione con la soluzione campione. Quindi equilibrare la colonna con un totale di cinque volumi di colonna utilizzando il 12,5% di tampone B a una velocità di un millilitro al minuto.
Applicare il campione alla colonna a 0,5 millilitri al minuto e raccogliere il flusso utilizzando la porta di uscita. Lavare la colonna con 20 volumi di colonna di tampone A a un millilitro al minuto. Quindi eluire il campione a un millilitro al minuto con questo schema.
Selezionare per raccogliere il campione eluito in frazioni di un millilitro utilizzando un raccoglitore di frazioni. Quindi riequilibrare la colonna a un millilitro al minuto con il 12,5% di tampone B per cinque volumi di colonna. Aprire il metodo creato e attendere la fase di eluizione.
Raccogli le frazioni usando un raccoglitore di frazioni. Inoltre, raccogli un'aliquota del flusso e conserva le frazioni a meno 20 gradi Celsius. Valutare il cromatogramma salvato automaticamente di tutte le fasi di purificazione.
Compreso il profilo di eluizione. Al termine, passare gli ingressi dalle soluzioni tampone all'acqua ultrapura e lavare la colonna a un millilitro al minuto per cinque volumi di colonna. Ripristinando la colonna, passare gli ingressi da acqua ultrapura a etanolo al 20% e lavare la colonna per cinque volumi di colonna.
Per concentrare i rAAV, caricare le frazioni FPLC desiderate in un'unità filtrante centrifuga da 15 millilitri con un taglio del peso molecolare di 100 kilodalton. Centrifugare a 2.000 G per due minuti a temperatura ambiente per raggiungere un volume concentrato di circa 500 microlitri. Continuare con la sostituzione del tampone aggiungendo un millilitro di PBS sterile all'unità filtrante centrifuga.
Lavare il filtro mediante pipettaggio. E centrifugare a intervalli di un minuto fino a raggiungere un volume di 500 microlitri. Concentrare ulteriormente gli rAAV trasferendo questo campione da 500 microlitri in un'unità di filtro centrifugo da 0,5 millilitri con un cutoff di 100 kilodalton.
E centrifugare a 6.000 G per intervalli di un minuto fino a quando il volume è inferiore a 100 microlitri. Recuperare l'rAAV concentrato invertendo il dispositivo di filtraggio in una nuova provetta da microcentrifuga e centrifugando per trasferire gli rAAV nella provetta. Aliquotare gli rAAV in provette per microcentrifuga a bassa ritenzione e conservarli a meno 80 gradi Celsius.
La purezza dei preparati rAAV è stata analizzata utilizzando la pagina SDS, rivelando bande proteiche distinte del capside. La visualizzazione delle particelle virali mediante TEM ha mostrato particelle vuote con un centro denso di elettroni e particelle piene. La valutazione delle proprietà di impurità fisiche degli rAAV utilizzando la piattaforma storditrice ha rivelato particelle di capside intatte di circa 30 nanometri, titolo complessivo del capside, proteine libere e aggregate e DNA a filamento singolo.
I test di infettività nelle cellule neuro 2a hanno mostrato alti livelli di infettività. Colture neuronali primarie infettate con i preparati virali dimostrati. proprietà di trasferimento genico conservate.
La trasduzione in vivo del cervelletto di topo con vettori rAAV ha determinato un'espressione prolungata di GFP. Indica il successo dell'espressione del transgene nel cervello dei mammiferi.
