Per iniziare, ottenere plasma ricco di piastrine centrifugando il sangue intero anticoagulato con citrato a 200 g per 20 minuti per 20 minuti. Aggiungere indometacina e PGE1 al plasma e centrifugare a 500 g per 10 minuti. Risospendere il pellet piastrinico risultante nel tampone HEPES di Tyrode modificato a 37 gradi Celsius per ottenere una densità di 2x10^8 piastrine per millilitro.
Far riposare le piastrine per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere DETC a una concentrazione finale di cinque micromolari e deferoxamina a una concentrazione finale di 25 micromolari nella sospensione piastrinica, seguita da CMH a una concentrazione finale di 200 micromolari. Posizionare i campioni in cuvette di aggregazione dotate di magneti di agitazione rivestiti in teflon e caricarli sull'aggregometro.
Dopo un minuto, aggiungere stimoli come trombina o collagene e incubare per 10 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione piastrinica dalla cuvetta di aggregazione a una provetta da microcentrifuga e centrifugare rapidamente a 6.000 g per 10 secondi. Caricare 50 microlitri di surnatante in micropipette capillari e sigillare con ceralacca EPR.
Trasferire i campioni allo scanner EPR e impostare i parametri sullo scanner. Stimare l'ossidazione della CMH a radicale CM come l'area sotto la curva dei picchi EPR registrati. Ottenere una curva di calibrazione utilizzando il radicale CM disponibile in commercio.
L'intensità del segnale EPR nei campioni era proporzionale all'intensità dei picchi EPR. La specificità di rilevamento è stata confermata con scavenger di ROS e inibitori selettivi degli enzimi che generano anione superossido. I dati per la stimolazione piastrinica con trombina o collagene in presenza dell'inibitore selettivo VAS2870 suggerito che le NADPH ossidasi sono la principale fonte di anioni superossido piastrinico in risposta a entrambi questi agonisti.
