Per iniziare, ottenere i segmenti di agarosio estrusi da siringhe a gradiente, inoculate con specie di metilomona wild type o mutante, LW13. Aggiungere 0,75 millilitri di cloruro di sodio allo 0,85% in acqua al campione di agarosio estruso e omogeneizzare mediante vortex. Inoltre, diluire il campione da 1 a 10 in una nuova provetta da microcentrifuga con 900 microlitri di soluzione salina.
Incubare i campioni con tre microlitri di una miscela uno a uno di SYTO 9 e coloranti di ioduro di propidio al buio a temperatura ambiente per 15 minuti. Per determinare le cellule per millilitro di agarosio, sonicare la sospensione di microsfere in un bagno d'acqua per cinque minuti. Quindi aggiungere 10 microlitri di sospensione al campione prima dell'analisi con citometria a flusso.
Analizza i campioni utilizzando un citometro a flusso. Confrontare i grafici operativi a dispersione laterale con quelli a dispersione diretta tra campioni di controllo privi di cellule e campioni di agarosio inoculati per disegnare gate di tensione dell'evento batterico che escludono le particelle di agarosio di fondo. Per contare le unità formanti colonie all'interno della siringa a gradiente, aggiungere 800 microlitri di terreno di sali minerali nitrati al segmento di agarosio estruso e agitare per 10 secondi per facilitare il pipettaggio.
Preparare una piastra sterile a 96 pozzetti con 180 microlitri di terreno di sali minerali nitrati in ogni pozzetto. Aggiungere 20 microlitri di campione di agarosio diluito a ciascun pozzetto della prima colonna e mescolare. Utilizzando una pipetta multicanale, diluire in serie 20 microlitri di campioni di dieci volte, partendo dalla prima fila di pozzetti.
Etichetta, griglia quadrata, targhetta contenente nitrati, sali minerali, coclea o media a scelta. Utilizzando una pipetta multicanale, individuare cinque microlitri da una colonna della piastra a 96 pozzetti sulla piastra della coclea. La citometria a flusso con campioni di agarosio estrusi ha confermato che il mutante di delezione OAT di LW13 mostrava una crescita cellulare ridotta rispetto al ceppo wild type.
La complementazione del mutante con il gene OAT ha ripristinato il numero di cellule e la formazione di bande a livelli simili a quelli del tipo selvatico, indicando il ruolo specifico del gene nella formazione delle bande.
