Il ruolo dei metalli di transizione nello sviluppo dei mammiferi è ampiamente sottovalutato. Prove emergenti mostrano che l'omeostasi metallica continua a cambiare in base allo stadio di sviluppo di cellule e tessuti. Inoltre, anche le destinazioni cellulari specifiche dei metalli sono in fase di sviluppo e, naturalmente, è difficile identificarne la posizione.
Ad oggi, sono state sviluppate diverse tecniche analitiche per quantificare i metalli, ma la maggior parte sono costose o inaccessibili. La ricerca intensiva è focalizzata per migliorare le determinazioni dei metalli in modo più accessibile ed efficiente. La spettroscopia ad assorbimento atomico del forno a grafite, GF-AAS, presenta due vantaggi principali.
Fornisce bassi limiti di rilevamento per lo zinco, consentendo un'accurata analisi dello zinco traccia. È anche una tecnica che non richiede elevati volumi di campione, i microlitri di soluzione tendono ad essere sufficienti per eseguire l'analisi. La combinazione di questi due vantaggi rende GF-AAS ideale per analizzare oligoelementi in campioni a basso volume.
Diverse condizioni patologiche umane sono legate a squilibri metallici. Alcuni esempi sono l'anemia, l'acrodermatite enteropathica e le malattie di Wilson e Menkes. Pertanto, è importante sviluppare metodi efficienti e affidabili per misurare i livelli di metalli di transizione in campioni biologici con elevata sensibilità e precisione.
GF-AAS è un ottimo esempio su una tecnologia che facilita la determinazione di un dato metallo in normali condizioni fisiologiche e in casi patogeni. Il metodo è molto versatile. Può essere applicato a molti sistemi e molti elementi possono essere analisi utilizzando GF-AAS.
Le sfide sono stabilire il limite di metodo di rilevamento nella realtà, assicurandosi che i campioni rientrano in questo limite. Dato che il volume dei campioni è basso, non c'è molto spazio per i test, quindi l'esame attento dei dati deve avvenire fin dall'inizio. Dopo la prima analisi dei campioni, dobbiamo stabilire qual è il fattore di diluizione necessario per portare i campioni ai limiti richiesti per la quantificazione.
Assicurati di essere in grado di frazionare correttamente i nuclei prima di andare all'AAS. Le macchie occidentali sono sempre una buona convalida prima dell'analisi spettroscopica. Mentre GF-AAS richiede volumi bassi, i pool intracellulari sono già in volumi bassi.
Questo dà poco spazio per i test. Le prime misurazioni devono essere accuratamente fatte ed esaminate, in modo che il trattamento del campione possa essere ridotto al minimo a un solo fattore di diluizione. Per iniziare, coltura le cellule di interesse in piastre di 55 centimetri quadrati.
Utilizzare una trappola per vuoto per aspirare i mezzi di coltura. Assicurarsi di rimuovere tutte le tracce di supporti. Utilizzare PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio per risciacquare le cellule dai punti di tempo desiderati, o dalle condizioni di coltura, tre volte.
Quindi aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato alla piastra e raschiare le cellule dalla piastra. Trasferire le sospensioni cellulari in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e tenerlo sul ghiaccio. Centrifugare per 10 secondi a 10.000 volte G e rimuovere il supernatante per aspirazione.
Se si desidera un'analisi metallica delle frazioni citoplasmatiche e nucleari, rimescolare il pellet cellulare in 400 microlitri di PBS ghiacciato contenente lo 0,1%NP-40, un detergente non ionico. Trasferire 100 microlitri in un nuovo tubo di microcentrifugo come campione di cellule intere e conservarlo a meno 20 gradi celsius. Per isolare i nuclei, utilizzare una punta in micropipetto P1000 per pipettare la sospensione cellulare da 400 microliter su e giù da cinque a 10 volte sul ghiaccio.
Quindi, estrarre cinque microlitri della sospensione cellulare e trasferirli in uno scivolo di vetro al microscopio. Posizionare i cinque microlitri al microscopio leggero utilizzando un obiettivo 40 volte superiore per verificare l'integrità dei nuclei. Centrifugare la restante sospensione a lysato a celle a 395 microliter per 10 secondi a 10.000 volte G.Trasferire il supernatante contenente la frazione citosolica in un nuovo tubo di microcentrifugo.
Successivamente, aggiungere 500 microlitri del PBS contenenti 0,1%NP-40 per risciacquare il pellet con la frazione nucleare e centrifugare per 10 secondi a 10.000 volte G.Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet contenente i nuclei in 100 microlitri della stessa soluzione. Per liscire le cellule, utilizzare un Bioruptor per sonicare l'intera cellula e i nuclei contenenti soluzione tre volte, ciascuno per cinque minuti. Procedere ad eseguire il controllo di qualità della purezza delle frazioni da parte della macchia occidentale, utilizzando anticorpi specifici per le frazioni nucleari o citosoliche.
In primo luogo, aggiungere un volume uguale di acido nitrico concentrato di grado di metallo traccia a tutte le frazioni cellulari, citoplasmatiche e nucleari contenenti 100, 500 e 100 microlitri di sospensione cellulare in tubi microcentrifuge da 1,5 millilitri e metterli in un blocco termico a 80 gradi celsius per mineralizzare la coltura cellulare per un'ora. Successivamente, esettare i tubi dal blocco termico e metterli in un rack per continuare la digestione acida durante la notte a 20 gradi Celsius. Interrompere la reazione aggiungendo il 30% del volume del campione di perossido di idrogeno.
Portare il volume del campione a 500 microlitri con acqua purificata da 18 mega Ohm. Successivamente, in un tubo Falcon da 15 millilitri diluire l'ossido nitrico standard di grado analitico in acqua purificata a 18 mega Ohm per preparare la soluzione di acido nitrico del due volumi percento come soluzione vuota durante la calibrazione. Quindi, utilizzare la soluzione di acido nitrico del due volumi percento per diluire una soluzione di stock di zinco disponibile in commercio da 1.000 ppm con una concentrazione di 1.000 parti per miliardo.
Preparare soluzioni standard di lavoro dalla soluzione standard di zinco da 1.000 parti per milione, la soluzione da 1.000 parti per miliardo, quindi diluirla a 5, 8, 10, 15, 20 e 25 ppb direttamente con una soluzione di acido nitrico del 2%. Posizionare un millilitro del modificatore della matrice di nitrato di magnesio dello 0,1% in tazze campione di polipropilene, quindi caricare le tazze nel carosello dell'autocampionatore. Programmare lo spettrometro ad assorbimento atomico per aggiungere automaticamente cinque microlitri del modificatore della matrice agli standard di zinco e al vuoto.
Impostare la stessa condizione ottimizzata sullo spettrometro ad assorbimento atomico per le soluzioni standard e i campioni, con portata di introduzione a 250 millilitri al minuto, temperatura di iniezione a 20 gradi celsius e temperatura del forno di grafite che raggiunge 1.800 gradi celsius in processi in quattro fase. Tutte le norme e i campioni di un singolo esperimento devono essere misurati contemporaneamente per evitare errori dovuti a differenze di taratura o evaporazione. Ottimizzare la lampada C-HCL a una corrente di 20 ampere, lunghezza d'onda di 213,9 nanometri e fessura di 0,7 nanometri.
Pipettare i campioni in tazze campione di polipropilene e posizionarli nel carosello dell'autocampionatore. Il limite inferiore di rilevazione dello zinco è di 0,01 parti per miliardo. Aumentando la concentrazione degli standard, il limite massimo di rivelazione dello zinco è determinato in 20 parti per miliardo.
Dopo aver ottenuto una curva standard di zinco, misurare i campioni mineralizzati per determinare il contenuto di metallo. Se i dati ottenuti sono oltre il limite di rivelazione, diluire i campioni con acqua purificata da 18 mega Ohm trattata con acido nitrico di grado analitico dello 0,1%. In questo rapido isolamento del protocollo dei nuclei, una macchia occidentale rappresentativa dalla differenziazione dei mioblasti primari mostra la purezza delle frazioni subcellulari.
L'enzima rimodellatore di cromatina Brg1 è stato usato per identificare la frazione nucleare, e la tubulina è stata utilizzata per identificare la frazione citosolica. Questa figura mostra le micrografie luminose rappresentative per monostrati proliferano e differenziati o confluenti di ciascun tipo di cella, non e il corrispondente contenuto di zinco negli estratti di cellule intere, nelle frazioni citosoliche e nucleari. Tutte le linee cellulari analizzate in questo studio hanno mostrato concentrazioni di zinco nell'intervallo nanomolare.
I miotubi primari differenziati mostravano livelli più elevati di zinco rispetto alle cellule proliferanti. Una distribuzione subcellulare simile dello zinco è stata rilevata nella linea cellulare derivata dal neuroblastoma N2A. D'altra parte, la linea cellulare 3T3-L1 stabilita mostrava livelli più elevati di zinco quando i pre-adipociti proliferavano rispetto a quando erano indotti o differenziati.
Le cellule MCF10A mostravano livelli uguali di zinco tra frazioni citosoliche e nucleari nelle cellule proliferanti. Una volta che le cellule MCF10A raggiungono la confluenza, è stata rilevata una diminuzione del 40% dei livelli di zinco a cellule intere e il metallo è stato trovato più concentrato nella frazione citosolica. La spettrometria ad assorbimento atomico del forno a grafite è una tecnica altamente sensibile per misurare la transizione e i metalli pesanti in campioni biologici e ambientali.
Occorre prestare particolare attenzione e pulizia nella preparazione delle frazioni subcellulari, poiché una contaminazione minima probabilmente interferirà con l'analisi, a causa della sensibilità dell'apparecchiatura. Dati i bassi volumi e i bassi livelli di tracce di metalli in ogni esperimento, è difficile pensare a una tecnica migliore e più accurata per misurare lo zinco rispetto al GF-AAS. Non esistono tecniche attuali in grado di fornire i limiti di rilevamento e il basso volume richiesto al costo relativamente basso del GF-AAS.
La spettrometria ad assorbimento atomico del forno a grafite è accurata, sensibile, economica e accessibile. Questa tecnica analitica continuerà a migliorare man mano che le tecnologie di rilevamento elementale continueranno a progredire. La futura applicazione per l'individuazione dello zinco e di altri metalli da parte della GF-AAS includerà organi, tessuti ottenuti da modelli animali e biopsie da pazienti con malattie associate a squilibri metallici sistemici.
L'acido nitrico è un acido estremamente corrosivo in grado di causare gravi ustioni chimiche molto rapidamente. Questa sostanza chimica può anche reagire violentemente con alcuni composti come le polveri metalliche. A causa del pericolo rappresentato dall'acido nitrico, è importante adottare severe misure di sicurezza ogni volta che si maneggia acido nitrico.
Quando si maneggia acido nitrico si consiglia vivamente di indossare occhiali chimici di sicurezza, schermo facciale per la protezione dagli spruzzi, guanti e respirazione a vapore approvata se la ventilazione non è adeguata.
