Questo saggio di sedimentazione in vitro basato sulla concanavalina A è progettato per misurare l'affinità di legame delle fosfatasi glucane contro diversi substrati STA. Le informazioni che otteniamo da questo metodo sono fondamentali per la nostra comprensione della famiglia di enzimi glucanofosfatasi. Le interazioni delle proteine dei carboidrati sono relativamente deboli, quindi i metodi attuali non possono rilevare le interazioni tra glucanofosfatasi e glucano.
Il nostro saggio di cosedimentazione basato sulla lectina è in grado di rilevare l'affinità di legame nell'intervallo millimolare. La caratterizzazione dei mutanti SEX4 e di altri membri della famiglia di enzimi glucanofosfatasi dimostra la capacità di questo test di quantificare le interazioni tra carboidrati proteici. Una delle parti più impegnative del test è ottimizzare l'intervallo di concentrazione del substrato.
Ti consigliamo di iniziare con una gamma più ampia per avere un'idea e poi restringere il campo per una gamma specifica. Per iniziare, pipettare 250 microlitri di sospensione di perline di conA-sepharose in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare il contenuto a 10.000 G per 30 secondi a quattro gradi Celsius.
Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 750 microlitri del tampone legante a ciascun tubo contenente 250 microlitri di perle di conA-salsorosio. Centrifugare i tubi a 10.000 G per un minuto a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante. Quindi, preparare due diluizioni della soluzione di amilopectina solubilizzata per produrre una serie di soluzioni di amilopectina diluita da due millilitri.
Per preparare le perle di amilopectina ConA-sinforosio, aggiungere 250 microlitri di ciascuna soluzione di amilopectina diluita ai tubi contenenti 250 microlitri di perle ConA-salsorosio preequilibrate e tampone legante. Mescolare bene il contenuto ed etichettare i tubi con la corrispondente concentrazione di amilopectina. Incubare il contenuto del tubo su una ruota rotante a quattro gradi Celsius per 30 minuti e centrifugare i tubi a 10.000 G per un minuto.
Mescolare 250 microlitri di perle di amilopectina ConA-sepharose con 100 microlitri del tampone legante contenente 10 microgrammi di amido in eccesso quattro, o proteina SEX4, 10 millimolari di ditiotreitolo e 10 micromolari di cocktail inibitore della proteasi. Incubare il contenuto a quattro gradi Celsius per 45 minuti con una leggera rotazione. Quindi centrifugare i tubi a 10.000 G per un minuto e pipettare accuratamente 50 microlitri di surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Aggiungere 20 microlitri di colorante per pagine 4X SDS e 10 microlitri di acqua distillata a ciascun tubo contenente 50 microlitri delle frazioni di surnatante raccolte ed etichettarle come S.Allo stesso modo, aggiungere 20 microlitri di colorante per pagine 4X SDS e 80 microlitri di acqua distillata nei tubi contenenti perle di amilopectina SEX4 di ConA-sepharose lavate. Dopo aver aggiunto colorante e acqua, riscaldare tutti i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Una volta che le sfere di amilopectina SEX4 ConA-sepharose sono centrifugate a 10.000 G per un minuto, salvare il surnatante ed etichettarlo come P.Caricare 40 microlitri dei campioni proteici non legati etichettati come S in pozzetti di gel di poliacrilammide prefabbricati dal 4 al 12% dalla concentrazione di substrato più bassa alla più alta, riservando la prima corsia per un marcatore di peso molecolare proteico.
Utilizzare un secondo gel per caricare i campioni di proteine legate al glucano etichettati P.Aggiungere il tampone SDS appena preparato in entrambe le camere dell'apparecchio e far scorrere il gel a 150 volt per 35 minuti o fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel. Quindi prendere la cassetta di gel dall'apparecchio e rimuovere i distanziatori e le lastre di vetro per separare il gel per l'analisi western blot. Fare un litro di tampone di trasferimento contenente 5,8 grammi di tris base, 2,9 grammi di glicina, 0,37 grammi di SDS e 200 millilitri di metanolo.
Per trasferire le proteine separate dal gel di poliacrilammide a una membrana di nitrocellulosa, assemblare le spugne, le carte da filtro, il gel e la membrana di nitrocellulosa secondo il protocollo di trasferimento occidentale e funzionare a 70 volt per un'ora. Dopo aver eseguito il gel, incubare la membrana di nitrocellulosa in una soluzione proteica dall'1 al 5% di albumina sierica bovina o proteine del latte in 50 millilitri di tampone TBST per un'ora per prevenire il legame proteico non specifico. Lavare la membrana tre volte utilizzando tampone TBST per rimuovere qualsiasi soluzione di blocco non legata.
Quindi, incubare la membrana per un'ora con l'anticorpo diluito legato alla perossidasi di rafano specifico per la proteina marcata con istidina. Quindi lavare la membrana tre volte nel tampone TBST per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Per l'imaging digitale, fare una soluzione di parti uguali di soluzioni di substrato chemiluminescente, 750 microlitri ciascuna in un tubo da 1,5 millilitri, e incubare la membrana per almeno cinque minuti nella soluzione.
Posizionare la proteina di membrana rivolta verso il basso sullo scanner blot ed eseguire il software di acquisizione per quantificare la proteina sia nella frazione pellet che in quella surnatante Per acquisire i dati, avviare le misurazioni quantitative del segnale utilizzando il software di acquisizione con lo scanner blot. Normalizzare tutte le misurazioni quantitative nelle frazioni di surnatante e pellet al totale delle proteine caricate.
Nell'esperimento di legame saturante, tracciare la percentuale di proteine legate rispetto alla concentrazione di amilopectina e adattare i dati utilizzando il software di analisi dei dati per calcolare la costante di dissociazione, Kd.La capacità di legame di SEX4 alle perle di amilopectina ConA-sepharose è stata analizzata utilizzando la pagina SDS. È stata osservata la presenza della proteina SEX4 nella frazione pellet e dell'albumina sierica bovina nella frazione surnatante . W278A, un noto mutante SEX4 con capacità di legame glucano significativamente ridotta, è apparso nella frazione surnatante indicando l'utilità e la specificità di questo test.
L'analisi Western blotting ha rivelato un aumento significativo nel rilevamento di SEX4 e il metodo è specifico per rilevare fosfati di glucano con un tag di istidina terminale terminale. Il saggio di cosedimentazione è stato testato a tre diverse concentrazioni di SEX4. Mentre due microgrammi di SEX4 sono sufficienti per visualizzare attraverso il rilevamento a chemiluminescenza, l'utilizzo di cinque o 10 microgrammi di SEX4 consente un rilevamento più accurato.
Inoltre, è stato notato un aumento del legame SEX4 con un aumento della concentrazione di amilopectina. È stata determinata l'affinità di legame dell'amilopectina e della proteina wild type SEX4 a diverse concentrazioni e i dati relativi alla percentuale di proteine legate al modello specifico di legame di un sito hanno dato un Kd di circa 1,03 milligrammi per millilitro. È stata valutata l'applicabilità di questo metodo per misurare il legame di laforina, LSF2, mais SEX4 e patata SEX4 contro l'amilopectina di patata.
I risultati hanno dimostrato che le proteine testate provenienti da colture agronomicamente importanti sono anche legate in modo differenziale all'amilopectina. È fondamentale ricordare la normalizzazione di tutte le misurazioni quantitative nelle frazioni pellet e surnatante al totale delle proteine caricate. Per garantire che tutta l'amilopectina sia legata alle perle, salvare le frazioni surnatanti per eseguire il test del glucosio profondo in un secondo momento.
La fosfatasi glucana è impiegata meccanismi distinti per legare, localizzare e defosforilare i carboidrati. Questo metodo consente l'esplorazione del legame della glucanofosfatasi a diversi domini strutturali all'interno di grandi complessi polimerici per la defosforilazione specifica della posizione.
