Ringraziamo il Dr. Harvey Hensley per il suo supporto tecnico. Questo lavoro ha beneficiato l&#39;uso dei seguenti Fox Chase Cancer Center (FCCC) impianti: Laboratorio di Fondo e degli animali di piccola strumento Imaging animali. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal SPORE Ovarian Cancer FCCC / UPenn (P50 CA083638), il FCCC nucleo di sovvenzione (P30 CA006927) e il Fondo di cancro ovarico di ricerca.

I. Preparazione di cellule di tumore ovarico <ol><li> Crescere ovarico linee di cellule tumorali che esprimono luciferasi in coltura. Fonti di luciferasi può essere Firefly, Renilla, o altre specie. Cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti può anche essere usato. Per questa dimostrazione si utilizza un cancro ovarico linea cellulare, OVCAR5, esprimendo lucciola luciferasi. </li><li> Cellule vendemmia utilizzando di routine la tecnica di coltura cellulare. </li><li> Tenere la sospensione cellulare (10.000 cellule / mL) in tampone fosfato (PBS) in ghiaccio fino al momento dell&#39;iniezione. </li></ol> II. Iniezione Intrabursal Questa procedura richiede l&#39;assistenza di una seconda persona. Tutte le procedure chirurgiche sono condotti in condizioni asettiche. Questo include indossare abbigliamento chirurgico e l&#39;utilizzo di strumenti chirurgici sterili, siringhe e aghi. <ol><li> Preparare la soluzione anestetica mescolando 3 ml di ketamina cloridrato (100 mg / ml), 1,6 mL di xilazina cloridrato (100 mg / ml), 1,5 mL di acepromazina (10 mg / mL), e 20 ml di sodio cloruro 0,9%. </li><li> Controllare il numero di identificazione dell&#39;animale e la salute osservabili. Anestetizzare l&#39;animale preparato con ketamina-xylazina-acepromazina anestesia via intraperitoneale (ip) di iniezione con una dose da 8 e 9 ml / kg di peso corporeo (BW). </li><li> Confermano che l&#39;animale si trova sotto una pianura accettabile di anestesia eseguendo un pizzico dito del piede con una pinza o dita per le zampe posteriori dell&#39;animale. Se c&#39;è pedale riflesso, attendere una più profonda pianura di anestesia finché l&#39;animale non risponde a questa procedura. </li><li> Posare il lato dorsale animale su un tampone di garza sterile con la testa rivolta verso la coda e rivolto verso di voi. Il punto di incisione si trova a sinistra oa destra della linea mediana e sopra le ovaie. Shave o bagnare il pelo con il 70% di alcool nel punto dell&#39;incisione. </li><li> Sollevare la pelle a contatto con pinze e fare una piccola incisione con la forbice in posizione dorsomediale e direttamente sopra il cuscinetto di grasso ovarico. Il cuscinetto adiposo ovarico dovrebbe essere visibile sotto la superficie della parete peritoneale. Cuscinetto adiposo è facilmente riconoscibile dal colore bianco in contrasto con il tessuto rosa scuro che lo circonda. </li><li> Sollevare delicatamente il rivestimento peritoneale muro e fare una piccola incisione come descritto in precedenza (5). </li><li> Posizionare un tampone imbevuto di garza sterile salina sulla linea mediana adiacente alla incisione. Individuare il cuscinetto adiposo ovarico e tirarlo fuori e appoggiarla sulla garza. Stabilizzare l&#39;ovaia dalla chiusura del cuscinetto adiposo con una clip bulldog. Sotto un microscopio a dissezione, posizionare l&#39;ovaio da consentire l&#39;inserimento dell&#39;ago (30 gauge, G) in curva tubulo ovidotto che porta alla borsa. Quando l&#39;ago viene inserito nella posizione corretta, dovrebbe essere visibile sotto la borsa. </li><li> Premere delicatamente il pistone della siringa per iniettare 5 ml di sospensione cellulare tra la borsa e l&#39;ovaio, mentre la siringa è posizionato al sito di iniezione. Questa fase richiede due persone. Una persona spinge il pistone, mentre l&#39;altra persona mantiene il posizionamento dell&#39;ago. Rimuovere velocemente l&#39;ago per sigillare il sito della puntura, ma delicatezza sufficiente a non strappare la borsa e tubulo. La borsa dovrebbe apparire leggermente disteso con iniezione appropriate. </li><li> Rilasciare il cuscinetto adiposo dalla clip bulldog e delicatamente sostituire il tratto riproduttivo e ritorno cuscinetto adiposo nella cavità peritoneale. Chiudere delicatamente la parete del corpo tirando il rivestimento superiore peritoneale il rivestimento inferiore. Chiudere la pelle con punti metallici o clip ferita chirurgica. </li><li> Posizionare l&#39;animale recupero indietro nella sua gabbia e fornire una fonte sicura di calore per evitare ipotermia e accelerare la ripresa. Monitorare la frequenza respiratoria e la facilità, il ritorno del tono muscolare e la capacità di muoversi volontariamente. Questi sono tutti buoni indicatori della progressione verso la guarigione. Punti metallici o clip ferita può essere rimosso o superiore a 7 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> III. Orale Amministrazione Gavage <ol><li> Utilizzare un ~ 18 20 ago sonda G o sondino per l&#39;alimentazione con una punta arrotondata. L&#39;ago sonda gastrica deve essere più lungo rispetto alla distanza dalla punta della testa dell&#39;animale alla sua costola. </li><li> Controllare il numero di identificazione degli animali &#39;e la salute osservabili. Delicatamente collottola l&#39;animale afferrando la pelle sopra le spalle con il pollice e le dita. Il sistema di ritenuta deve essere solo abbastanza solida per gli arti anteriori per essere esteso a ogni lato e fuori del modo. L&#39;animale non deve essere in grado di afferrare l&#39;ago. </li><li> Delicatamente tirare indietro la testa dell&#39;animale con il dito indice, formando una linea diritta attraverso il collo ed esofago. Supporto posteriore dell&#39;animale con l&#39;interno del vostro pollice. </li><li> Delicatamente e senza forza, inserire l&#39;ago gavage su entrambi i lati della bocca e sulla lingua. In un movimento fluido, l&#39;ago deve passare contro il tetto della bocca e giù per l&#39;esofago. Gravità dovrebbe guidare l&#39;ago verso il basso senza resistenza riunione. Se c&#39;è una resisce, togliere l&#39;ago e ricominciare. Gag dell&#39;animale e riflesso ingoiare può essere attivato durante l&#39;inserimento. Tuttavia, ci dovrebbe essere nessuna resistenza o gasping dall&#39;animale. E &#39;importante assicurarsi che l&#39;animale sta respirando quando l&#39;ago è in posizione controllando il movimento delle narici e al torace. </li><li> Spingere lentamente lo stantuffo della siringa per erogare il volume della dose. </li><li> Rimuovere delicatamente l&#39;ago sonda gastrica con lo stesso angolo e via come il modo in cui è stato inserito verso il basso l&#39;esofago. </li><li> Rispedire l&#39;animale verso la sua gabbia e la respirazione monitorare e comportamenti per 5 ~ 10 minuti. </li></ol> IV. Imaging in vivo Usiamo il Caliper Life Sciences di monitorare il comportamento delle cellule iniettate nella cavità intrabursal. Gli esperimenti che utilizzano questo sistema in genere hanno un orizzonte temporale di 4 a 16 settimane dal momento dell&#39;impianto del tumore. <ol><li> Preparare la soluzione di D-luciferina (substrato di lucciola luciferasi), sciogliendo 5 ~ 20 mg in 1 ml di PBS e il filtraggio attraverso membrane 0,22 micron per la sterilizzazione. </li><li> Caricare la camera di induzione attivando sia l&#39;ossigeno e il gas isoflurano. Accendere il flusso di gas alla camera di induzione solo. La portata isoflurano è mantenuta a un livello basso fino a quando gli animali sono pronti per essere ripreso. </li><li> Controllare il numero di identificazione degli animali &#39;e la salute osservabili. Posto l&#39;animale in camera di induzione carica di gas isoflurano. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dalla camera quando l&#39;animale sembra essere anestetizzati. Fornire 200 ml di soluzione di luciferina preparata mediante iniezione ip utilizzando 30 ago G. E &#39;importante registrare il tempo di iniezione in modo da mantenere costante il tempo tra l&#39;iniezione luciferina e prestazioni di imaging tutto lo studio. </li><li> Posizionare la luciferina-iniettati di nuovo animale nella camera di induzione. </li><li> Impostare il sistema di imaging per le impostazioni appropriate. Assicurati di inizializzare il sistema prima di acquistare la prima immagine animale. </li><li> Spegnere il flusso di gas alla camera di induzione e accendere il flusso di gas alla camera di imaging. </li><li> Posizionare la dorsale anestetizzato animale o lato ventrale in su. Assicurarsi di posizionare il naso degli animali &#39;in un cono naso per mantenere la corretta induzione dell&#39;anestesia. Assicurarsi che l&#39;animale si trova il &quot;punto della griglia di interesse&quot;, come indicato da illuminazione verde. </li><li> Chiudere la porta della camera e acquisire l&#39;immagine al momento opportuno. Il tempo può essere determinato dalla cinetica. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dalla camera di imaging e metterlo di nuovo nella sua gabbia. Monitorare il recupero degli animali &#39;come descritto in &quot;iniezione Intrabursal&quot;. </li></ol> V. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Imaging in vivo di cellule del tumore ovarico in un modello murino ortotopico. OVCAR5 cellule che esprimono luciferasi sono state iniettate in intrabursally ovaia destra e ripreso nel corso del tempo. Le immagini sono state prese 13 (a sinistra), 17 (centro) e 22 (a destra) giorni dopo l&#39;iniezione con il sistema Spectrum IVIS imaging. Lato dorsale è mostrato nel pannello superiore e laterale ventrale è in basso del pannello. Si noti che la diffusione peritoneale di cellule tumorali 22 giorni dopo l&#39;iniezione. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali istituzionali Fox Chase Cancer Center e del comitato Usa.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il cancro ovarico è la principale causa di morte tra tutte le neoplasie ginecologiche 1. L&#39;alta mortalità di questa malattia è in gran parte a causa della sua diagnosi tardiva e la mancanza di affidabili metodi diagnostici 2. Inoltre, la chemioterapia convenzionale incontra spesso chemioresistenza e recidiva di tumore 3. Pertanto, il romanzo di terapie è necessario per raggiungere in modo efficace questa malattia. Nello sviluppo della nuova terapia per il cancro ovarico umano, è fondamentale per sviluppare un modello rappresentativo di animali. Un modello animale ortotopico ha dei vantaggi rispetto ai modelli convenzionali xenotrapianto (ad esempio per via sottocutanea o iniezioni intraperitoneali di cellule tumorali) in quanto 1) riproduce il sito primario di formazione del tumore, 2) rappresenta il sito comune di metastasi, e 3) che fornisce le cellule tumorali a interagire con microambiente appropriato 4, 5, 6, 7, 8. Roditori hanno una membrana unica della borsa che circonda l&#39;ovaio e si continua con l&#39;ovidotto. Questa anatomia unica di roditori permette l&#39;iniezione di cellule tumorali ovariche ortotopicamente. Intrabursally iniettato cellule di tumore ovarico si comportano simile alla malattia umana, in tal modo crescente all&#39;interno della membrana intrabursal e la diffusione in cavità peritoneale con il progredire del tumore. Iniezione di luciferases cellule che esprimono stabilmente o proteine ​​fluorescenti consente anche il monitoraggio del comportamento delle cellule tumorali in tempo reale. Bioluminescenti e / o tecnologia di imaging a fluorescenza consente di volte le cellule tumorali immagine per un lungo periodo di tempo e studio della crescita tumorale, la distribuzione e la regressione in modo non invasivo 9, 10, 11. Nel definire il modello ortotopico, è fondamentale per rimuovere rapidamente l&#39;ago dalla borsa dopo l&#39;iniezione. La rimozione dei sigilli brusca ago della puntura e previene la perdita di cellule iniettate. Tuttavia, allo stesso tempo, il movimento deve essere dolce a non strappare la borsa. Se la perdita si verifica durante l&#39;iniezione, può indurre le cellule a seme nel ventre e potenzialmente confondere lo studio, cioè, prematura diffusione al di fuori dell&#39;ovaio. In questo caso, l&#39;animale specifico dovrebbe essere registrato e seguiti per lo sviluppo di siti tumorali più nel peritoneo prima del trattamento o, in alternativa eliminati dalle analisi successive. Prima di eseguire sonda gastrica, è fondamentale per verificare la lunghezza del tubo sonda gastrica misurando dalla punta della testa dell&#39;animale e l&#39;ultima costa. E &#39;utile per segnare il tubo al naso dell&#39;animale e non passare il tubo passato questo marchio. Inserimento del tubo passato questo marchio può provocare una perforazione nello stomaco. Determinare la lunghezza del tubo è particolarmente importante con animali più giovani o animali di peso inferiore a 20 gr Al momento l&#39;inserimento dell&#39;ago gavage giù nell&#39;esofago, ci dovrebbe essere nessuna resistenza o lotta dall&#39;animale. E &#39;importante non somministrare la soluzione o sospensione troppo veloce come questo può portare a reflusso e successivamente consegnare il volume inesatte dose, così come l&#39;aggiunta di stress per l&#39;animale. Per ottenere risultati confrontabili immagini di tanto in tanto, è auspicabile per mantenere il tempo coerente tra iniezione di substrato luciferasi e di imaging. Il lasso di tempo può essere determinato prendendo serie di immagini dopo l&#39;iniezione del substrato e osservare la cinetica dei segnali. Sviluppo di un modello di topo ortotopico di cancro ovarico, somministrazione orale di farmaci, e in vivo imaging sono le tecniche necessarie per una migliore comprensione dello sviluppo e la diffusione del cancro ovarico e valutare nuovi regimi terapeutici che possono in ultima analisi, migliorare il risultato del paziente affetto da questa malattia mortale.

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lloyd, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acepromazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>122796</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer

Cancro umano e la risposta alla terapia è meglio rappresentati in modelli animali ortotopico. Questo articolo descrive lo sviluppo di un modello di topo ortotopico di cancro ovarico, trattamento del cancro attraverso somministrazione orale di farmaci e il monitoraggio del comportamento delle cellule tumorali in risposta al trattamento farmacologico in tempo reale utilizzando nel sistema di imaging in vivo. In questo modello ortotopico, le cellule del tumore ovarico che esprimono luciferasi vengono applicati localmente iniettando direttamente nella borsa del mouse in cui è racchiuso ogni ovaio. Su iniezione di D-luciferina, un substrato di lucciola luciferasi, luciferasi cellule che esprimono generare segnali bioluminescenza. Questo segnale viene rilevato dal sistema in vivo imaging e consente una non invasivo mezzi di controllo della crescita tumorale, la distribuzione e la regressione nei singoli animali. Somministrazione del farmaco tramite sonda gastrica consente un volume di dosaggio massimo di 10 ml / kg di peso corporeo da consegnare direttamente allo stomaco e ricorda da vicino la consegna di farmaci nei trattamenti clinici. Pertanto, le tecniche descritte qui, lo sviluppo di un modello di topo ortotopico di cancro ovarico, somministrazione orale di farmaci, e imaging in vivo, sono utili per una migliore comprensione del cancro ovarico umano e trattamento e migliorare il targeting questa malattia.

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Ortotopico modelli animali di cancro ovarico meglio replicare la malattia umana e, pertanto, migliorare la nostra comprensione della progressione del cancro e la risposta del tumore alla terapia. Un modello di topo riceve una iniezione intrabursal della luciferasi che esprimono le cellule tumorali ovariche. Il trattamento è somministrato tramite sonda gastrica. La crescita tumorale è controllato da<em&gt; In vivo</em&gt; Immagine di sistema.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

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Video: In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Topo Modello ortotopico di cancro colorettale

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Ricerca

Biologia

Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and future drug-eluting stents.
A variety of antibodies and transgenic and knockout strains are available in rats. Consequently, a model for in-stent restenosis in the rat would be convenient for pathobiological and pathophysiological studies. 
In this video, we present the full procedure and pit-falls of a rat stent model suitable for high throughput stent research. We will show the surgical procedure of stent deployment, and the assessment of in-stent restenosis using the most elegant technique of OCT (Optical Coherence Tomography). This technique provides high accuracy in assessing plaque CSAs (cross section areas) and correlates well with histological sections, which require special and time consuming embedding and sectioning techniques. OCT imaging further allows longitudinal monitoring of the development of in-stent restenosis within the same animal compared to one-time snapshots using histology.

This video demonstrates how to use a preclinical inexpensive and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of in-stent restenosis development. Longitudinal in vivo monitoring using OCT (Optical Coherence Tomography) and analysis of OCT images are also demonstrated.

Imaging ristenosi in-stent: un poco costoso, modello affidabile, rapido e preclinici

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

La convalida di un modello di topo per Disrupt LINC Complessi in modo specifico-Cell

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major clinical challenge because no efficient method exist for their elimination once their dissemination is underway. A better understanding of the mechanisms regulating cancer cell invasion may lead to the development of novel potent therapies. Due to their physiological resemblance to tumors, spheroids embedded in collagen I have been extensively utilized by researchers to study the mechanisms governing cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). However, this assay is limited by (1) a lack of control over the embedding of spheroids into the ECM; (2) high cost of collagen I and glass bottom dishes, (3) unreliable immunofluorescent labeling, due to the inefficient penetration of antibodies and fluorescent dyes and (4) time-consuming image processing and quantification of the data. To address these challenges, we optimized the three-dimensional (3D) spheroid protocol to image fluorescently labeled cancer cells embedded in collagen I, either using time-lapse videos or longitudinal imaging, and analyze cancer cell invasion. First, we describe the fabrication of a spheroid imaging device (SID) to embed spheroids reliably and in a minimal collagen I volume, reducing the assay cost. Next, we delineate the steps for robust fluorescence labeling of live and fixed spheroids. Finally, we offer an easy-to-use Fiji macro for image processing and data quantification. Altogether, this simple methodology provides a reliable and affordable platform to monitor cancer cell invasion in collagen I. Furthermore, this protocol can be easily modified to fit the users&#8217; needs.

Presented here is a protocol for the fabrication of a spheroid imaging device. This device enables dynamic or longitudinal fluorescence imaging of cancer cell spheroids. The protocol also offers a simple image processing procedure for the analysis of cancer cell invasion.

Imaging a fluorescenza risolta nel tempo e analisi dell'invasione delle cellule tumorali nel modello sferoide 3D

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In vivo Imaging a due fotoni di megacariociti e proplatati nel midollo osseo del cranio del topo

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

Imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Imaging del perossido mitocondriale in cellule di lievito viventi utilizzando mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca mitocondriale - Biosensore mtHyper7 per l'analisi subcellulare 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Imaging di mtHyPer7, un biosensore raziometrico per il perossido mitocondriale, in cellule di lievito viventi

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...