Ringraziamo Michael J. Bruno, Radda Rusinova e Jon T. Sacco per molte discussioni stimolanti. Sostegno finanziario da NIH, R01GM021342 e ARRA supplemento R01GM021342-35S1, e Josiah Macy Jr. Foundation per OSA, il Tri-I CMB programma per HII e The L. Iris e Leverett S. Woodworth Medical Scientist Fellowship e NIH MSTP concedere GM07739 per RK.

1. Genera ANTS pieno di liposomi <ol><li> Il giorno 1, rimuovere il solvente da lipidi organici. </li><li> Togliere dal freezer lipidi e lasciarlo a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 0,6 mL di 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glicero-3-phosphocholine) lipidi in soluzione cloroformio in un pallone basso a 25 mL. </li><li> Continuamente ruotare il pallone mentre si asciugava sotto azoto, fino a quando tutti i cloroformio è evaporato e un sottile velo bianco di mani lipidi tutta la metà inferiore del pallone. </li><li> A secco in un essiccatore sotto vuoto durante la notte. </li></ol><ol><li> Il giorno 2, la preparazione del campione con il fluoroforo che verrà incorporato nel vescicole. </li><li> Reidratare in 100 mM NaNO 3, 25 ANTS mM (Na sale), 10 mM HEPES. Usa HNO 3 o NaOH per aggiustare il pH a 7,0. Ogni molecola ANTS ha 2 + Na, per un totale di 150 mm [Na +]. Aggiungere 1,671 ml di elettrolita per ottenere una sospensione di 10 lipidi mM. </li><li> Parafilm e vortice sospensione accuratamente. </li><li> Proteggere il campione dalla luce con un foglio e lasciare che l&#39;età a temperatura ambiente per una notte. </li></ol><ol><li> Il giorno 3, fanno grandi vescicole unilamellari e rimuovere tutti i fluoroforo dall&#39;esterno vescicole. </li><li> Ultrasuoni per 1 minuto in una bassa potenza ultrasuoni. </li><li> Gelo-disgelo campione 5-6 volte, ogni volta con 5 minuti in ghiaccio secco e 5 minuti in acqua calda (~ 50 ° C). </li><li> Estrudere la sospensione lipidica Avanti con un mini-estrusore. Impostare il mini-estrusore con un filtro in policarbonato 0,1 micron e filtro supporta (vedi manuale estrusore per maggiori dettagli). Estrudere la sospensione avanti e indietro 21 volte in modo tale che la sospensione finisce sulla siringa opposto. Quando più batch sono estrusi, ricordatevi sempre di caricare campioni con la stessa siringa. Durante l&#39;estrusione la sospensione lipidica nuvoloso iniziale dovrebbe diventare quasi trasparente (sarà ancora giallo a causa del fluoroforo ANTS). Se l&#39;estrusione diventa improvvisamente più semplice e meno pressione è necessaria per muoversi attraverso il filtro, il filtro può avere rotto e dovrà essere sostituita. </li><li> Rimuovere ANTS esterno eseguendo la sospensione estruso per un PD-10 colonna dissalazione utilizzando un protocollo gravità. Equilibrare colonna con 20-30 mL di Na-tampone (140 mM NaNO 3, 10 HEPES mM, pH 7.0, ricordatevi di usare HNO 3 o NaOH per aggiustare il pH). Aggiungere 1,5 mL della sospensione lipidica estruso alla colonna e lasciar filtrare in Portare il volume totale del campione a 2,5 ml con l&#39;aggiunta di 1 ml di Na-buffer. Dopo che il buffer è completamente incorporato nella colonna e nulla è fuoriuscita, eluire i liposomi con 3 ml di Na-buffer e raccogliere il campione risultante. L&#39;ANTS risultante riempito LUV soluzione di riserva dovrebbe contenere circa 4-5 mm lipidi e appaiono traslucide bianco latte. Proteggere il campione dalla luce con un foglio. </li><li> Se la soluzione di riserva non viene utilizzata immediatamente, conservare a 13 ° C per un massimo di 7 giorni. Attenzione: non congelare o raffreddare la soluzione lipidica di sotto del suo liquido di cristallo fase temperatura di transizione (~ 12 ° C), in modo da distruggere l&#39;integrità delle vescicole &#39;e il fluoroforo si fuoriuscire. </li></ol> 2. Mix Solution fluorescenza <ol><li> 24 ore prima dell&#39;uso, diluire liposomi e incubare con gramicidina (a 13 ° C). Equilibratura gramicidina monostrati tra interno ed esterno le vescicole lipidiche &#39;è un processo lento, che richiede una lunga incubazione. </li><li> Accuratamente il vortice ANTS pieno LUV soluzione madre come luvs hanno una densità&gt; 1 g / mL e quindi sedimenti nelle soluzioni. </li><li> Miscelare il ANTS pieno LUV 1:20 stock in Na-buffer. Mescolare tutti liposomi per l&#39;utilizzo in un giorno di esperimenti insieme in un pallone unico per migliorare l&#39;uniformità del campione. </li><li> Separare 3 / 4 dei liposomi e aggiungere 260 Nm gramicidina pre-diluito in DMSO (500 mg / mL). </li><li> Per il restante 1 / 4 aggiungere lo stesso volume di DMSO (senza gramicidina) per mantenere costante la concentrazione di solvente in tutti i campioni. </li></ol> 3. Impostazione dello strumento di fluorescenza <ol><li> Usiamo un Applied Photophysics SX.20 stopped-flow spettrofluorimetro con controllo di temperatura per misurare il tasso di estinzione di fluorescenza. </li><li> Girare gli strumenti per un&#39;ora di anticipo per consentire il riscaldamento. I componenti sono: computer, unità di controllo elettronico, bagnomaria (sia raffreddamento e riscaldamento), di alimentazione della lampada e del serbatoio di azoto. </li><li> Impostare le condizioni di registrazione utilizzando il software Data Pro-SX. </li><li> Impostare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione monocromatore a 352 nm e aperture larghezza della fenditura per l&#39;eccitazione di 1 / 1. </li><li> Utilizzare un λ = 455 nm filtro passa-alto per registrare l&#39;emissione. </li><li> Utilizzare il &quot;Hold Pressure&quot; impostazione, che consente lo strumento per mantenere la pressione di azoto durante la registrazione e quindi evita le oscillazioni di pressione (e artefatti di registrazione) durante i primi pochi millisecondi. </li><li> Impostare &quot;Time &quot;a 1 s e&quot; punti &quot;a 5000. </li><li> Utilizzare la finestra di ripetizione e regolare il numero di ripetizioni, di solito usiamo 9 e 13 si ripete per buffer e gestisce quencher, rispettivamente. </li><li> Bagnomaria temperatura dovrebbe essere impostata a 25 ° C, la temperatura deve essere monitorata nel software SX. </li><li> Impostare il volume dell&#39;unità a 120 microlitri, il che significa che ogni volta che lo strumento esegue un campione, si mescola 60 microlitri di ciascuna delle due siringhe. Con questa impostazione strumentale, un volume di 120 microlitri dà un tempo morto di ≈ 1,2 ms. </li><li> Regolare l&#39;alta tensione (guadagno) sul rivelatore a fluorescenza per l&#39;uscita del ANTS-liposomi ad essere circa 8. Per una miscela standard sperimentale il guadagno dovrebbe essere 400-420 V. Alcuni farmaci sono fluorescenti, tale da poter saturare il segnale di fluorescenza. In questi casi, guadagno / tensione deve essere ridotta. </li><li> Caricare sempre il campione fluorescente nella siringa sinistra e buffer / quencher nella siringa destra. Assicurati di fondo vortice tutti i campioni contenenti liposomi prima di caricarli, ed essere consapevoli che il luvs con il tempo si depositerà nella siringa. </li></ol> 4. Fare un esperimento <ol><li> Preparare un campione di ANTS-caricato luvs sia con solventi o composti, e caricare nel spettrofluorimetro insieme sia con Na-tampone o Tl-quencher (50 mM TlNO 3, 94 mm NaNO 3, 10 HEPES mM a pH 7,0). </li><li> Utilizzare 1,5 ml diluito ANTS-LUV soluzione, con o senza gramicidina, preparate il giorno precedente. </li><li> Aggiungere il composto alla concentrazione desiderata o il solvente per i controlli. Mantenere la concentrazione di solvente al minimo e costante in tutti i campioni. La concentrazione dovrà essere regolato con una nuova (sconosciuto) composto per ottenere il desiderato dose-risposta gamma. Incubare per 10 minuti a 25 ° C al buio. </li><li> Il vortice LUV campione e caricare nella siringa sinistra. Caricare il Na-buffer o Tl-quencher nella siringa destra. </li><li> Rimuovere completamente le bolle d&#39;aria da entrambi i campioni, spingendo le siringhe avanti e indietro. </li><li> Assicurarsi che entrambe le siringhe vengono caricate ugualmente prima di chiudere le valvole. Carico diseguale si tradurrà in pre-miscelazione di soluzioni prima che raggiungano la camera di registrazione. </li><li> Per il campione prima, registrare la fluorescenza con Na-tampone, ripetere 4 volte, regolare l&#39;alta tensione (guadagno), se necessario, e ripetere 5 volte. </li><li> Per i restanti campioni, record di 9 ripete con Na-buffer. </li><li> Sostituire il Na-buffer con il TL-quencher e record di 13 ripetizioni. </li><li> Risciacquare con acqua e continuare con il campione successivo. Come controlli usiamo campioni: non gramicidina e con solvente, senza gramicidina e con la massima concentrazione del composto, sia con gramicidina e solvente. </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Trasferire i risultati al computer di analisi. Leggi tutti i dati in MATLAB per l&#39;analisi. Per ogni campione, leggere in tutti i buffer e ripete quencher, escludendo i primi quattro in ogni caso, come quelli contenenti artefatti di miscelazione. Assumendo un volume dell&#39;unità di 120 microlitri ci vuole un po &#39;meno di quattro colpi per cancellare completamente la miscela precedente dal stopped-flow tubo. </li><li> Le ripetizioni di buffer per tutti i campioni dovrebbero essere molto simili. Se c&#39;è un cambiamento significativo nel segnale di fluorescenza, che dipende dalla concentrazione del composto, poi lo stesso composto può essere fluorescente e può essere necessario per sottrarre questo primo segnale di fluorescenza in più prima di normalizzare i campioni. </li><li> Manualmente passare attraverso le tracce e rimuovere &quot;cattivo&quot; ripete: ripete contenenti chiodi o deviazioni dalla multi-exponentiality a causa di artefatti di miscelazione e / o bolle. </li><li> Normalizzare la ripete quencher al valore medio di partenza delle ripetizioni di buffer per ogni campione. Combina le medie di tutti i campioni in un grafico per la visualizzazione. </li><li> Le tracce registrate senza gramicidina dovrebbero essere tutti simili e mostrano quasi nessun tempra fluorescenza, ci può essere una riduzione lenta del segnale di fluorescenza a causa della lenta perdita di Tl + attraverso il doppio strato vescicole 8. Se il campione senza gramicidina e nessun modificatore mostra tempra notevole, poi le vescicole si sono deteriorati e non deve essere più riutilizzato. Se i campioni senza gramicidina ma con il modificatore spettacolo tempra significativo, allora il modificatore perturba il doppio strato vescicole a tal punto che permette al fluoroforo o quencher per attraversare il doppio strato. </li><li> Se il composto altera le proprietà doppio strato lipidico, come rilevato da canali gramicidina, la durata fluorescenza sarà visibilmente alterato. </li><li> Per ogni campione, un esponenziale allungato <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="Equazione 1" /> ad esempio, 4) è in grado di primi 200-100 ms della curva normalizzata quenching di fluorescenza delle ripetizioni individuali e il tasso di <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="Figura 2" /> 4calcolato a 2 ms. Medie e deviazioni standard sono calcolati per un dato campione di tutte le ripetizioni individuali. </li><li> Infine, determinare la variazione relativa del tasso di quench normalizzando al campione di controllo più vicino nel tempo che ha gramicidina e nessun modificatore. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Gli elementi essenziali della fluorescenza tempra a base di test per rilevare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico alto a sinistra:. Uno zoom-in su una vescicola lipidica singolo con ANTS più NaNO 3 all&#39;interno e NaNO 3 più 3 TlNO sulla parte esterna. In alto a destra: il segnale di fluorescenza registrate usando (forma dall&#39;alto in basso) ANTS pieno di vescicole senza quencher, con quencher, con quencher e pre-drogati con gramicidina 87, 260 e 780 nm. In basso: rappresentazione schematica del stopped-flow camera di miscelazione. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Una schermata dalla Pro-Data software SX che illustrano i vari pannelli riferimento nella descrizione del setup sperimentale. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3:. Determinazioni ripetere multiple del segnale di fluorescenza da ANTS-caricato luvs con Na-buffer I primi quattro ripetizioni sono sempre esclusi, in quanto contengono artefatti di miscelazione. Il tubo che collega il siringhe campione alla cella di miscelazione hanno un volume definito, quindi le ripetizioni primi ci darà una lettura di ciò che prima era nel tubo: acqua per ripetere 1 e 2, una combinazione di acqua e di esempio per ripetere 3, la maggior parte del campione per ripetere 4, e solo campione per le ripetizioni rimanenti. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4:. Determinazioni ripetere multiple del segnale di fluorescenza da ANTS-caricato luvs con Na-buffer e con Tl-quencher Le prime quattro si ripete sono stati rimossi da entrambe le condizioni. Inoltre, per il TL-quencher misurazioni, ripetere 8 deve essere rimosso a causa di artefatti, bolle d&#39;aria più probabile. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="Figura 5" /> . Figura 5: Effetto di capsaicina (Cap) sul corso del tempo tempra ANTS fluorescenza (A) normalizzato segnale di fluorescenza più di 1 s, punti grigi indicano i risultati di tutte le ripetizioni (n&gt; 5 per condizione); linee rosse indicano la media di tutti ripete. (B) I primi 100 ms, punti grigi indicano i risultati di una singola ripetizione per ogni condizione; linee rosse sono allungati adatta esponenziale (2 - 100 ms) a quelle ripetizioni. La linea tratteggiata blu indica il segno 2 ms, il momento in cui viene determinato il tasso di tempra. In entrambi A e B la traccia in alto mostra i risultati in assenza di Tl +, per i prossimi due tracce mostrano i risultati in assenza del GA, con Tl + ± Cap; le quattro tracce mostrano risultati inferiori a 260 nm GA e Tl +, dove i numeri indicano [Cap] in micron. I tassi di tempra per mM Cap 0, 10, 30 e 90, come determinata dalla frequenza di un esponenziale allungata, sono 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 e 247 ± 27 (media ± sd, n&gt; 8) , rispettivamente.

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Una domanda di brevetto provvisorio che copre i metodi descritti nel manoscritto è stato depositato. Il co-inventori sono HII e OSA.

Abbiamo dimostrato un veloce fluorescenza a base di test per determinare il potenziale di doppio strato modificando di farmaci ed altre amphiphiles di piccole dimensioni. Composti che modificano le proprietà doppio strato possono alterare la funzione delle proteine ​​di membrana in un indiretto, maniera aspecifica, contribuendo probabilmente a &quot;off-target&quot; effetti della droga. Il test sfrutta la potenza dei canali gramicidina come sonde per i cambiamenti nelle proprietà doppio strato 12 che ve...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

Molti farmaci e altre molecole di piccole dimensioni utilizzato per modulare la funzione biologica sono amphiphiles che adsorbono a doppio strato / soluzione di interfaccia e di conseguenza alterano le proprietà doppio strato lipidico. Questo è importante perché le proteine ​​di membrana sono energicamente il loro doppio strato accoppiato ad ospitare da interazioni idrofobiche. Cambiamenti nelle proprietà doppio strato così alterare la funzione delle proteine ​​di membrana, che fornisce un modo indiretto per amphiphiles di modulare la funzione delle proteine ​​e un possibile meccanismo di &quot;off-target&quot; effetti della droga. Abbiamo già sviluppato un test elettrofisiologico per rilevare i cambiamenti nelle proprietà doppio strato lipidico utilizzando canali gramicidina lineare come sonde 3,12. Canali gramicidina sono mini-proteine ​​formata dalla dimerizzazione transbilayer di due subunità non conduttore. Essi sono sensibili ai cambiamenti nel loro ambiente membrana, che li rende potenti sonde per monitorare l&#39;evoluzione delle proprietà doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning. Ora dimostrare un saggio a fluorescenza per la rilevazione di cambiamenti nelle proprietà doppio strato utilizzando gli stessi canali come sonde. Il test si basa sulla misurazione del tempo-corso di tempra fluorescenza da fluoroforo-caricato unilamellari vescicole grandi a causa dell&#39;entrata di un quencher attraverso i canali gramicidina. Usiamo l&#39;indicatore di fluorescenza / quencher paio 8-amminonaftalen-1 ,3,6-trisulfonate (ANTS) / Tl + che è stato utilizzato con successo in altri saggi di tempra fluorescenza 5,13. Tl + permea il doppio strato lipidico lentamente 8 ma passa rapidamente attraverso lo svolgimento di canali gramicidina 1,14. Il metodo è scalabile e adatto sia per studi meccanicistici e high-throughput screening di piccole molecole per doppio strato, perturbante, e le potenzialità &quot;off-target&quot;, effetti. Troviamo che i risultati con questo metodo sono in buon accordo con precedenti risultati elettrofisiologici 12.

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Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Introduciamo un digiuno a base di test a fluorescenza che controlla il tasso di estinzione di fluorescenza come una misura di attività del canale gramicidina. I canali gramicidina sono utilizzati come trasduttori di forza molecolare per monitorare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning.

Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

gramicidin-based-fluorescence-assay-for-determining-small-molecules

Research

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Biology

12.7K Views.  Weill Cornell Medical College. Introduciamo un digiuno a base di test a fluorescenza che controlla il tasso di estinzione di fluorescenza come una misura di attività del canale gramicidina. I canali gramicidina sono utilizzati come trasduttori di forza molecolare per monitorare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning.

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Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

L&#39;applicazione di una degenerazione C. elegans Dopamina Saggio Neuron per la convalida dei potenziali morbo di Parkinson geni

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Ricerca

Biologia

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Metodi di singola molecola per monitorare l&#39;evoluzione a doppio strato: Proprietà meccaniche

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Generazione Substrato per endonucleasi di CRISPR / Cas Sistemi

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Membrane lipidiche a doppio strato tethered per monitorare il trasferimento di calore tra nanoparticelle d'oro e membrane lipidiche

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

Clearing ottico dei tessuti vegetali per l'imaging a fluorescenza

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...