Il protocollo descrive come eseguire iniezioni virali e impiantare una finestra cranica per l'imaging delle cellule cerebrali in topi svegli e trattenuti dalla testa. Il vantaggio di questo metodo è che la struttura e l'attività di neuroni e astrociti possono essere visualizzate ripetutamente su più sessioni. Questo approccio può essere utilizzato per determinare come le cellule neurali sono alterate in modelli di disturbi dello sviluppo neurologico o neurodegenerativo, o se la plasticità dipendente dall'esperienza è compromessa.
Inizia fissando un mouse anestetizzato a un telaio stereotassico usando il morsetto del muso e le barre auricolari. Utilizzando strumenti chirurgici sterili, tagliare e rimuovere la pelle dalle suture frontali anteriori al bregma a posteriormente a lambda. Utilizzando una lama chirurgica sterile in acciaio al carbonio 11, raschiare delicatamente tutto il tessuto connettivo dal cranio.
Con l'aiuto di un trapano dentale, forare gradualmente l'osso del cranio lungo il contorno dell'apertura in cerchi concentrici per facilitare anche l'assottigliamento dell'osso. Dopo ogni passaggio concentrico, aggiungere una goccia o due di soluzione salina all'area perforata e lasciare riposare la soluzione salina per almeno 10 secondi prima di riprendere la perforazione. Spingere delicatamente sulla zona centrale dell'osso del cranio con una pinza fine per verificare che il cranio sia adeguatamente assottigliato e si muova.
Assicurarsi che la vascolarizzazione sottostante in cui si è verificata la perforazione sia intatta e che l'osso non sia incrinato. Inserire con attenzione una lama appuntita in miniatura di 15 gradi nell'osso assottigliato e tagliare e utilizzare la schiuma gel imbevuta di soluzione salina per fermare eventuali sanguinamenti che possono verificarsi. Usando una pinza, sollevare e rimuovere con cura l'osso, facendo attenzione a non danneggiare la dura madre.
Per l'iniezione, riempire una pipetta di vetro smussata sterile con una punta di 20 micrometri con la miscela di virus. Quindi abbassare la pipetta per toccare la superficie del cervello e continuare ad abbassare per ulteriori 200-300 micrometri per le iniezioni di strato 2/3. Utilizzando un sistema di erogazione di microiniezione intracellulare, iniettare a pressione il sistema da 12 a 15 volte in due minuti.
Per l'impianto della finestra cranica, posizionare il vetro di copertura sopra l'apertura nel cranio. Utilizzare una pinza per assicurarsi che il vetro sia a filo sopra l'apertura. Per sigillare i bordi della finestra di vetro al cranio, applicare gel adesivo cianoacrilato attorno al perimetro della superficie del vetro.
Sopra il gel adesivo, applicare uno strato di colla. Quindi aggiungere uno strato di liquido di cemento dentale. Quando il cemento dentale si indurisce, applicare un sottile strato di colla attorno all'apertura centrale della piastra di testa del tipo elicottero e posizionare la piastra della testa di tipo elicottero delle dimensioni appropriate sopra il vetro di copertura.
Lasciare asciugare la colla. Aggiungere polvere di cemento dentale in un tubo di microfuga da 1,5 millilitri fino al segno di 0,1 millilitri. Mescolare da sette a otto gocce di adesivo istantaneo a polimerizzazione rapida nella polvere e disegnare la miscela risultante in una siringa da un millilitro con un ago calibro 19 che è stato tagliato per creare un'apertura più grande.
Iniettare la miscela di polvere attraverso i fori laterali della barra dell'elicottero fino a quando non filtra da entrambi i lati. Applicare la miscela adesiva di cemento dentale sul resto del cranio esposto per fissare la piastra della testa al cranio. Avvolgere il mouse in un panno e fissarlo tramite la piastra della testa al braccio di fissaggio della testa della gabbia domestica trasportata dall'aria, quindi lasciare la gabbia domestica esposta alla luce.
Dopo un tempo di assuefazione di 15 minuti, rimuovere il mouse dalla gabbia di casa. Utilizzando la modalità a campo largo del microscopio, selezionare da due a tre posizioni di vascolarizzazione facilmente identificabile. Salva le immagini dei vasi sanguigni e registra le coordinate x e y che appaiono sul controller del motore.
Immagine delle strutture sinaptiche dei neuroni e dell'attività di GCaMP6f negli astrociti. Nell'analisi rappresentativa, la qualità della finestra cranica è stata valutata con imaging ripetuto di dendriti e astrociti che esprimono GCaMP6f per giorni. In una buona finestra, le strutture neuronali apparivano nitide con spine dendritiche chiaramente visibili.
Due nuove spine sono apparse il secondo giorno di imaging. Solo una colonna vertebrale persisteva ed era visibile il quinto giorno. L'attività del calcio è stata studiata negli astrociti che esprimono GCaMP6f in diversi punti temporali.
Un evento globale che comprende l'intera cellula è stato testimoniato durante un attacco di locomozione. I due passaggi critici di questo protocollo sono che l'osso deve essere adeguatamente assottigliato prima della rimozione dell'osso e il corretto posizionamento del vetro di copertura sopra l'apertura. L'imaging può essere combinato con l'analisi comportamentale, sia durante l'imaging, sia post-comportamento, come l'apprendimento di una nuova abilità motoria, per determinare come la struttura e la funzione neuronale e astrocitaria è modulata dall'apprendimento.
