Il nostro protocollo consente l'imaging simultaneo delle dinamiche della microglia e dell'attività neuronale nei topi svegli. Può essere ampiamente applicato per studiare il comportamento di sorveglianza della microglia o l'interazione con i neuroni. Il vantaggio di questo metodo è che gli artefatti di movimento non contaminano facilmente i dati di imaging a causa della robusta fissazione della testa.
Inoltre, il ripristino dopo l'imaging a frame rate elevato ci consente di eliminare gli artefatti di movimento dai dati. In questo metodo, l'iniezione di AAV e la chirurgia dell'impianto della finestra cranica sono tecnicamente impegnative. Il fallimento è comune all'inizio, quindi per favore non sentirti frustrato e pratica di più.
Per preparare l'apparecchio di iniezione, posizionare una pipetta di vetro collegata a una siringa Hamilton calibro 26 attraverso un tubo su un portapipette di uno strumento stereotassico. Quindi, inclinare il portapipette di 60 gradi anteriormente rispetto all'asse verticale. Riempire la pipetta di vetro, la siringa e il tubo di collegamento con paraffina liquida e posizionare la siringa su un microiniettore.
Somministrare l'analgesia al topo anestetizzato e attaccare le barre auricolari ausiliarie. Quindi, fissa l'animale sullo strumento stereotassico con il lato dorsale verso l'alto. Dopo aver rimosso i peli dal sito chirurgico e disinfettato l'area chirurgica, praticare un'incisione lunga due centimetri sul cuoio capelluto lungo la linea mediana, garantendo una buona esposizione del cranio sopra la corteccia visiva primaria destra.
Utilizzare una pinza per rimuovere il periostio sul cranio esposto. Forare il cranio sulle coordinate stereotassiche tre millimetri lateralmente alla linea mediana e 5 millilitri anteriormente alla linea lambda per creare un piccolo foro con un diametro di circa 0,5 millimetri. Quindi, posizionare un pezzo di pellicola trasparente di circa due centimetri per due centimetri sul cranio esposto del topo.
Espellere un microlitro di goccia di soluzione AAV sul film usando un pipetter. Far avanzare la siringa. E posizionare una punta di pipetta di vetro nella goccia di soluzione AAV sul film e tirare delicatamente la siringa per aspirare la soluzione AAV.
Quindi, inserire la pipetta di vetro a una profondità di 500 micrometri dalla superficie del cervello attraverso il foro creato nel cranio. Quindi, iniettare 0,5 microlitri di soluzione AAV utilizzando il microiniettore a una portata volumetrica di iniezione di due microlitri all'ora. Ritirare l'ago e sciacquare la superficie del cervello con soluzione salina.
Creare una scanalatura circolare lungo il segno sul cranio perforando. Pulire i detriti per garantire la visibilità del cranio e applicare soluzione salina per evitare il riscaldamento durante la perforazione. Premere delicatamente il cranio centrale con una pinza.
La profondità di foratura è sufficiente se si muove verticalmente con poca resistenza. Quando il solco raggiunge una profondità sufficiente, inserire la punta della pinza nella parte inferiore del frammento centrale del cranio. Sollevarlo delicatamente e rimuoverlo per esporre la superficie del cervello.
Utilizzando un ago calibro 27, pungere e strappare la dura sul bordo della superficie cerebrale esposta. Inserire la punta della pinza attraverso il foro praticato sul bordo della dura e staccarlo per esporre la superficie del cervello. Dopo aver disperso le fibre emostatiche una ad una in soluzione salina, posizionare le fibre emostatiche lungo i margini del foro in cui è presente la dura transettata.
Posizionare la finestra cranica sulla superficie cerebrale esposta e quindi farla aderire al cranio con colla istantanea mentre si preme delicatamente la finestra. Successivamente, applicare la colla istantanea su tutto il cranio esposto. Quindi, attaccare con attenzione una piastra di testa sul cranio per individuare la finestra cranica al centro del foro quadrato della piastra della testa.
Una volta che la colla si è sufficientemente indurita, applicare il cemento dentale sul cranio esposto per rinforzare l'attacco tra la testa e la lama della testa. Per installare il dispositivo di ombreggiatura personalizzato e un monitor LCD per la stimolazione visiva, posizionare prima l'obiettivo per mettere a fuoco la superficie del cervello e quindi impostare questa posizione della lente come posizione Z originale. Mantieni costanti le coordinate XY ed eleva l'obiettivo.
Rimuovere il mouse e lo strumento stereotassico dall'obiettivo. Fissare un dispositivo di ombreggiatura sulla parte superiore della piastra di testa utilizzando silicone, assicurandosi che lo spazio tra la piastra di testa e il dispositivo di ombreggiatura sia ben sigillato. Riempire il dispositivo di ombreggiatura con acqua distillata.
Quindi, fissare il mouse con la cornice stereotassica sotto l'obiettivo. Ripristinare con attenzione il piano focale sulla superficie del cervello, controllando la profondità della lente dell'obiettivo. Coprire l'obiettivo con un foglio di alluminio nero per evitare la contaminazione della luce dal monitor LCD.
Impostare un monitor LCD da 10 pollici a 12,5 centimetri davanti agli occhi del mouse per presentare stimoli visivi. Configurare i filtri di raccolta di invio fluorescente per EGFP e R-CaMP e la lunghezza d'onda di eccitazione a 1.000 nanometri. Acquisisci immagini con una risoluzione spaziale di 0,25 micron per pixel.
Trova la regione di imaging in cui i neuroni R-CaMP-positivi e le microglia EGFP-positive possono essere ripresi simultaneamente. Nel livello 2, 3. Acquisisci immagini alla frequenza fotogrammi di 30 hertz.
Contemporaneamente all'acquisizione dell'immagine, presenta stimoli visivi reticolati alla deriva al mouse in 12 direzioni a sei orientamenti, da zero a 150 gradi in passi di 30 gradi. Dopo l'acquisizione dell'immagine, rimuovere il mouse dalla fase del microscopio. Staccare il dispositivo di ombreggiatura e lo strumento stereotassico dal mouse e riportare il mouse nella sua gabbia di casa.
Utilizzando questo protocollo, l'iniezione di AAV e l'impianto della finestra cranica sono stati eseguiti nella corteccia visiva primaria di un topo transgenico di otto settimane, seguiti da due immagini fotoniche dell'attività neurale basata su R-CaMP e della dinamica microgliale nello strato 2, 3. Gli stimoli visivi del reticolo sono stati presentati al topo e le risposte visive nella colonna vertebrale adendritica sono state analizzate utilizzando tracce di calcio. I processi microgliali hanno mostrato dinamiche veloci e hanno cambiato la loro morfologia entro 10 secondi.
Utilizzando l'imaging a due fotoni nello strato 2, 3 della corteccia visiva primaria in un topo transgenico di 12 settimane, R-CaMP è stato osservato nei neuroni, visto qui in magenta. Un EGFP è stato osservato in microglia, visto in verde. Sono stati osservati anche segnali individuali per EGFP e R-CaMP.
Il successo dell'iniezione di AAV è fondamentale per questo metodo. Le ragioni principali per la mancata iniezione di AAV sono le pipette di vetro dell'orologio e il danno tissutale. Il comportamento di sorveglianza sulla microglia e l'interazione della microglia dello SNAP sono stati identificati per essere prevalenti in vari meccanismi patogeni, come il morbo di Alzheimer.
Il nostro metodo è vantaggioso per la ricerca focalizzata su questo campo.
