Gli autori desiderano ringraziare il Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e la Canadian Cancer Society per il finanziamento ricerca sul ciclo cellulare nel loro laboratorio. MJC è un destinatario di un MD / PhD borsa di studio della CIHR. MJC e MA sono membri del programma di formazione CaRTT.

1. Etichettatura e di fissaggio delle cellule <ol><li> Aggiungere 1 ml di reagente Etichettatura proliferazione cellulare (BrdU) per ml di mezzo di coltura cellulare (1-1000 diluizione) 1 ora prima della raccolta. Il periodo di etichettatura potrebbe essere necessario allungare di cellule in crescita più lenta. </li><li> Alle cellule raccolto, terreno di coltura aspirare e lavare accuratamente con tampone fosfato (PBS). Ripetere l&#39;operazione per rimuovere completamente le tracce di terreno. </li><li> Lavare rapidamente le culture per la terza volta con PBS contenente 3mM EDTA ed aspirare accuratamente. </li><li> Aggiungere un piccolo volume di PBS contenente 3mM EDTA per ogni piatto, 0,5 ml per un piatto di 6 centimetri è l&#39;ideale. Incubare a 22 ° C per circa 5 minuti per staccare le cellule. Trasferire in un tubo da 15 ml. </li><li> Cellule centrifugare a 500 xg per 5 minuti per far sedimentare, rimuovere il surnatante, e risospendere completamente in 100 ml di PBS. </li><li> Fissare le cellule con l&#39;aggiunta di 5 mL di EtOH 95%, goccia a goccia, mentre vortex. A questo punto, le cellule possono essere conservati a 4 ° C per almeno unmese. </li></ol> 2. Denaturazione e colorazione di BrdU e del DNA <ol><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti alle cellule precipitato ed eliminare l&#39;95% EtOH. Risospendere in 1 ml di HCl 2N e 0,5% Tx-100 con l&#39;aggiunta in modo goccia a goccia mentre vortex. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. </li><li> Centrifugare come prima nella sezione 2.1 e aspirare il surnatante con cura poiché le cellule formano un pellet molto sciolto in questa fase. Delicatamente risospendere in 1 ml di 0.1M NaB 4 O 7 (pH 8,5) e incubate per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Cellule pellet come sopra nella sezione 2.1 e risospendere in 0,5 mL di soluzione di anticorpi (PBS contenente BSA 1% e 0,2% di Tween-20) con il mouse anticorpi anti-BrdU diluito 1 a 50. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. </li><li> Celle a pellet di nuovo e risospendere in 50 mL di soluzione contenente anticorpi di coniglio anti-topo anticorpi secondari coniugati con FITC diluito 1 a 25. Incubare per 30 minutida banco e proteggere dalla luce. </li><li> Centrifugare le cellule un&#39;ultima volta e risospendere in 0,5 ml di ioduro di propidio e RNasi soluzione (PI-RNAse soluzione PBS con BSA 1%, 10 mg / mL di ioduro di propidio, 0,25 mg / ml RNasi A) e incubare al buio a 37 ° C per 30 minuti. In alternativa l&#39;RNA può essere digerito notte a 4 ° C al buio. </li><li> Passare la soluzione attraverso un colino per eliminare aggregati di cellule e raccogliere singole cellule in un apposito tubo per l&#39;assorbimento del campione sul citofluorimetro. Anche in questo caso, i campioni devono essere protetti dall&#39;esposizione diretta alla luce. </li></ol> 3. Analisi mediante citometria di flusso <ol><li> Le cellule devono essere analizzati con un citometro a flusso standard che è in grado di discriminare doppiette (due celle che passano attraverso la cella di flusso come uno) con capacità di rilevamento appropriati per FITC e ioduro di propidio. Singole cellule possono essere rilevati in questa applicazione citometria a flusso di gating per gli eventi sulla base di scatter in avanti e laterale pop dispersionementari, e utilizzando le proprietà di colorazione del DNA con ioduro di propidio. L&#39;aspetto di un complotto doppietto punto discriminante varia tra citofluorimetri e si basa sulle proprietà colorazione ioduro di propidio, vedere il locale impianto di citometria a flusso per un consiglio su come impostare un discriminatore doppietto nella vostra analisi. In generale, in una popolazione di cellule proliferanti in modo asincrono, le singole celle sono di solito i due picchi più abbondanti (2N e 4N DNA) nella trama doppietto discriminante e un cancello dovrebbe essere disegnato intorno a loro. In questo modo selezionare gli eventi singola cella che vengono utilizzati per tutte le successive analisi di seguito. </li><li> Il primo campione da analizzare deve essere una cultura in modo asincrono proliferanti che funge da controllo positivo per la colorazione e citofluorimetro set-up. Regolare la sensibilità di fotomoltiplicatori per la colorazione ioduro di propidio in modo tale che i picchi 2N e 4N dalle cellule singoletto sono centrate a 200 e 400 (unità arbitrarie) sul asse X. Spesso si macchia una s abbondanteupply di queste cellule per garantire che tutti i parametri della citometria a flusso sono state opportunamente adeguata senza usare questo esempio. Questo controllo positivo è utile anche per i nuovi utenti a familiarizzare con il funzionamento della citometria a flusso. </li><li> Regolare la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per la rilevazione FITC tale che le popolazioni G1 e G2 / M sono al di sopra di fondo. Cellule BrdU positive dovrebbero essere circa 10 volte più luminoso e l&#39;asse Y dovrebbe essere visualizzato come una scala logaritmica. A volte è utile inserire un controllo negativo per la colorazione BrdU (sostituendo l&#39;anti-BrdU con anticorpi non specifici IgG al punto 2.3) per distinguere chiaramente le cellule colorate positivamente. </li><li> Regolare la compensazione tra ioduro di propidio e FITC tale che i singoli eventi acquisiti dal modulo citofluorimetro un arco a forma di ferro di cavallo da G1 in basso a sinistra fino alla fase S e giù in basso a destra per G2 / M. Si prega di consultare il seguente riferimento per una più approfondita displayscussione dei principi e l&#39;uso di citometria a flusso e riferimenti lì per applicazioni specifiche 2. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> 5 000 a 10 000 eventi singola cella con la gamma di contenuto desiderato DNA devono essere raccolti per ogni campione al fine di avere fiducia che la popolazione di cellule in coltura sono stati completamente campionati. </li><li> Una volta che le cellule sono stati misurati per ioduro di propidio e contenuti BrdU cui hanno bisogno per essere assegnati alle fasi G1, S o G2 / M. Fare tracciando cancelli intorno alle due popolazioni BrdU negativa centrata a 200 e 400 (G1 e G2 / M, rispettivamente). Tutto ciò che sopra queste caselle devono essere inclusi in una sola porta che misura fase S (Fig. 1A). La percentuale di cellule in ogni porta rappresenta il numero relativo di cellule in G1, S e G2 / M (Fig. 1B). </li></ol> 5. Protocollo alternativo per l&#39;analisi del ciclo cellulare in una popolazione mista di cellule <ol><li> Questo protocollo alternativo èpiù utile quando la trasfezione di vettori di espressione di routine si traduce in una bassa percentuale di cellule che esprimono il prodotto del gene di interesse, o quando il trattamento della droga per selezionare una popolazione pura di cellule non è praticabile. Ciò si traduce in una percentuale relativamente piccola di cellule di interesse contaminazione con una grande popolazione di cellule untransduced. In questo caso, co-trasfezione plasmidi che esprimono il gene o shRNA di interesse lungo con un plasmide che esprime un marker per la rilevazione di cellule transfettate mediante citometria di flusso, come una membrana ancorata GFP 3 o uno straniero marcatore di superficie delle cellule, come CD19 4 o CD20 5. </li><li> Ai fini di questo protocollo useremo CD20 colorazione a titolo di esempio, tuttavia, la colorazione di CD19 è sostanzialmente identica. Nel caso di transfezione con CD20, non c&#39;è bisogno di etichettare BrdU, semplicemente celle immagazzinano come descritto nei passaggi 1,2-1,5 sopra e colorare con l&#39;aggiunta di 20 l FITC coniugato anti-CD20 anticorpi alle cellule su ice per 20 minuti al buio. Fissare le cellule, come descritto in 1,6 passo. Le cellule possono ancora essere conservati per almeno un mese a 4 ° C al buio. Per il rilevamento di GFP, omettere la colorazione degli anticorpi da questo passaggio e fissare e conservare le cellule come descritto. </li><li> Reidratare le cellule di rivestimento nella centrifuga a 500 xg per 5 minuti e risospendere in 5 ml di PBS contenente l&#39;1% BSA. </li><li> Re-agglomerare le cellule a 500 xg per 5 minuti e risospendere le cellule in 0,5 ml di soluzione di ioduro di propidio e RNase come descritto sopra nella sezione 2.5. </li><li> Continua a seguire le istruzioni di preparazione delle cellule in 2,6 e analisi le istruzioni ai punti 3.1 e 3.2. </li><li> Regolare la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per la rilevazione FITC tale che le cellule non colorate sono al di sopra di fondo. Idealmente, le cellule CD20-positive FITC sarà 10X a 100X più intensamente colorato di sfondo e l&#39;asse Y di questa trama dovrebbe essere visualizzato come una scala logaritmica (fig. 2A). CD20 cellule positive che sono 10 volte più luminosa rispetto backgtondo (e con colorazione ioduro di propidio tra 200 e 400) dovrebbero essere selezionati per la visualizzazione in un ioduro di propidio contro la conta delle cellule istogramma come mostrato in fig. 2C. Per le linee di cellule che esprimono i marcatori che sono prontamente colorati vivacemente (es. 10X a 100X sopra di fondo) la CD20 positivo, cut-off dovrebbe essere fissato a sfondo 10X. Inclusione delle cellule colorazione più deboli aumenta la variabilità in questi esperimenti, presumibilmente perché il gene di interesse è anche debolmente espresso in queste cellule. Per le linee di cellule che solo resa debolmente macchiato CD20 positivi (cioè meno di sfondo 10X), la determinazione di un largo taglio dovrebbe essere effettuato con un controllo negativo costituito da CD20 macchiato, le cellule untransfected. </li><li> Almeno 1000 CD20 eventi positivi devono essere raccolti per ogni campione. Esperimenti con meno di 1000 eventi produrranno elevata variabilità. I pacchetti software come ModFit LT (Verity Software), AV Multi Cycle (Phoenix Sistemi di flusso) e di flusso Jo (Albero Star) utilizzare stime matematiche delle popolazioni G1, S e G2 / M che contribuiscono alla forma della curva di istogrammi come quello mostrato in fig. 2B e C. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Forniamo tre esempi di analisi sperimentale del ciclo cellulare utilizzando il nostro approccio. Il primo utilizza l&#39;espressione retrovirali del dipendente p27Kip1 inibitore della chinasi ciclina in fibroblasti embrionali di topo. Ventiquattro ore dopo la selezione dei farmaci per l&#39;infezione virale era completa, le cellule sono state impulso etichettati con BrdU per un&#39;ora. In questo esperimento espressione ectopica dell&#39;inibitore è usato per arrestare la proliferazione delle cellule (Fig. 3A e B). Come mostrato in fig. 3B poco BrdU eventi positivi sono evidenti nella fase S porta in risposta a p27. Allo stesso modo, la percentuale di cellule in fase S per cellule che esprimono p27 è piuttosto basso come diagramed in fig. 3C. Questo tipo di analisi è stato molto efficace nel caratterizzare i difetti controllo del ciclo cellulare nelle cellule derivate da ceppi diversi di gene mirati topi 6, 7, 8. Nel secondo esperimento, non trasformato cellule epiteliali mammarie (MCF10A) sono stati trattati con la citochina crescita inibitori, beta fattore di crescita trasformante uno (TGF-β1) per 24 ore. Le cellule sono state etichettate con BrdU per quattro ore immediatamente prima della raccolta. Come mostrato in fig. 4 sull&#39;etichettatura BrdU nelle cellule in fase S è notevolmente diminuita del TGF-β1 segnalazione, la specificità del nostro colorazione è anche convalidato con un controllo IgG negativo (Fig. 4C). La quantificazione delle diverse fasi del ciclo cellulare conferma che TGF-β1 in primo luogo inibisce la proliferazione nella fase G1 del ciclo cellulare, portando a un accumulo in questa fase. Nel nostro ultimo esempio, pRB carente SaOS-2 cellule sono transfettate con un vettore CMV-CD20 espressione e sia CMV-RB o CMV-β-Gal come controllo. Tre giorni dopo la transfezione le cellule sono state raccolte, macchiato, e fissa. Analisi di citometria a flusso di queste cellules è mostrato in fig. 5. Questo dimostra la distribuzione del ciclo cellulare delle cellule di controllo negativo transfettate (Fig. 5A) in confronto con la seguente distribuzione 72 ore di espressione pRB (Fig. 5B). A seguito di curve fitting da un software Cicli multipli, un confronto diretto della proporzione delle fasi del ciclo cellulare è mostrato in fig. 5C. Questo rivela l&#39;accumulo di cellule in G1 seguente espressione pRB e l&#39;impoverimento relativo di cellule dalle fasi S e G2 / M. Abbiamo usato variazioni su questo test per sondare i meccanismi di arresto G1 ampiamente 9, 10, 11, 12, 13. Questi esempi dimostrano come controllo del ciclo cellulare può essere misurata in risposta a una varietà di stimoli o di manipolazioni delle cellule. Questo approccio può quindi essere adattato a molte applicazioni che richiedono la misura della posizione del ciclo cellulare negli esperimenti di tipo culturale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg" /> Figura 1. Quantitzione delle fasi del ciclo cellulare mediante ioduro di propidio combinato e colorazione BrdU (PI-BrdU). (A) Questo pannello mostra tre citometria a flusso dimensionale di ioduro di propidio e cellule colorate BrdU. Si noti che le cellule con contenuto di DNA 2N e 4N sono centrate sui 200 e 400 segni sulla asse X scala per intensità della colorazione ioduro di propidio. Intensità di colorazione BrdU viene misurata su una scala logaritmica per l&#39;asse Y. Si noti la posizione delle porte utilizzate per quantificare le cellule nelle fasi G1, S e G2 / M del ciclo cellulare. (B) la percentuale relativa di cellule in ciascuna delle porte G1, S e G2 / M di A sono riportati su questo grafico. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg" /> Figura 2. Quantificazione delle fasi del ciclo cellulare nelle cellule selezionate con ioduro di propidio e la superficie delle cellule CD20 marcatore. (A) Questo pannello mostra ioduro di propidio e CD20 colorazione per una miscela di cellule, alcune delle quali ectopica esprimere CD20 e pRB. Si noti che le cellule con2N e 4N del DNA (le popolazioni più abbondanti) sono centrate sui 200 e 400 segni sulla asse X. La posizione del + CD20 cancello seleziona le celle che sono macchiati di almeno 10 volte più luminosa di fondo. (B) Un grafico di conta delle cellule contro colorazione ioduro di propidio è indicato per le cellule CD20 negativi in ​​un pannello che si moltiplicano in modo asincrono. (C) Un grafico simile a quello mostrato per le cellule CD20 positive dal pannello di A che sono state indotte ad arrestare con l&#39;espressione pRB e contengono cellule con contenuto di DNA soprattutto 2N. Questo dimostra che un arrestato sotto-popolazione può essere distinto da altre cellule in questa cultura utilizzando questa tecnica di colorazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg" /> Figura 3. Inibizione della proliferazione cellulare da p27Kip1. (A) PI-BrdU analisi è utilizzato per misurare le fasi del ciclo cellulare in una popolazione in modo asincrono proliferazione di cellule che sono state trasdotte con un vuoto vecto pBABE retroviralir. (B) Una simile analisi di cellule trasdotte con pBABE-p27. Si noti l&#39;assenza di cellule nella fase S e la maggiore intensità degli eventi in G1 e G2 / M cancelli. (C) La determinazione quantitativa di cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare in modo asincrono proliferazione di controllo e cellule che esprimono p27. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg" /> Figura 4. Inibizione della proliferazione cellulare da TGF-β1 (A) PI-BrdU analisi di cellule proliferanti in modo asincrono MCF10A. (B) Analisi delle cellule trattate con 100 pM di TGF-β1 per 24 ore. Notare l&#39;accumulo di cellule principalmente nella fase G1 del ciclo cellulare. (C) Validazione di colorazione BrdU sostituendo il anti-BrdU con un anticorpo primario non specifico controllo IgG nelle cellule proliferanti in modo asincrono. (D) quantificazione grafica delle fasi rispettivi ciclo cellulare da A e B. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg" /><br/&gt; Figura 5. Inibizione della proliferazione cellulare da pRB. (A) rispetto al conteggio delle cellule colorazione ioduro di propidio di CD20 e ß-gal cellule transfettate viene mostrato. Si tratta di un controllo importante come la trasfezione può parzialmente sincronizzare le cellule, rendendo la popolazione untransfected (CD20 - cellule) come un controllo inadeguato per la trasfezione sub-popolazione. Cellule trasfettate devono essere comparati con le altre cellule analogamente transfettate. (B) conta cellulare contro grafico ioduro di propidio di CD20 e pRB transfettate cellule. Si noti la presenza quasi esclusiva di un picco 2N. (C) Rappresentazione grafica di proporzioni ciclo cellulare fase determinata da A e B con metodi curva di raccordo nel software Cicli multipli.

<ol>
	<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 5573-5573 (1983).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+introduction.">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods. Mol. Biol. 699, 1-1 (2011).</li><li>Kalejta, R. F., Brideau, A. D., Banfield, B. W., Beavis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integral+membrane+green+fluorescent+protein+marker,+Us9-GFP,+is+quantitatively+retained+in+cells+during+propidium+iodide-based+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry.</a> J. Exp. Cell. Res. 248, 322-322 (1999).</li><li>Qin, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+E2F-1+is+a+downstream+target+of+RB+action.">The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action.</a> Molecular and Cellular Biology. 15, 742-742 (1995).</li><li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control.">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262, 2050-2050 ( ).</li><li>Henley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+derived+mutation+in+the+retinoblastoma+gene+with+a+distinct+defect+for+LXCXE+dependent+interactions.">A cancer derived mutation in the retinoblastoma gene with a distinct defect for LXCXE dependent interactions.</a> Cancer Cell. Int. 10, 8-8 (2010).</li><li>Francis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+connection+between+pRB+and+transforming+growth+factor+beta+in+growth+inhibition+and+mammary+gland+development.">A functional connection between pRB and transforming growth factor beta in growth inhibition and mammary gland development.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 4455-4455 (2009).</li><li>Isaac, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+regulates+pericentric+heterochromatin.">The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).</li><li>Julian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+E2F1-specific+binding+domain+in+pRB+and+its+implications+for+apoptotic+regulation.">Characterization of an E2F1-specific binding domain in pRB and its implications for apoptotic regulation.</a> Oncogene. 27, 1572-1572 (2008).</li><li>Hirschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overlapping+kinase+and+phosphatase+docking+site+regulates+activity+of+the+retinoblastoma+protein.">An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).</li><li>Dick, F. A., Dyson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pRB+contains+an+E2F1-specific+binding+domain+that+allows+E2F1-induced+apoptosis+to+be+regulated+separately+from+other+E2F+activities.">pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.</a> Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).</li><li>Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+pRB+pocket+reveals+that+cell+cycle+arrest+functions+are+separable+from+binding+to+viral+oncoproteins.">Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).</li><li>Dick, F. A., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+regions+of+the+pRB+pocket+domain+affect+its+inactivation+by+human+papillomavirus+E7+proteins.">Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins.</a> J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nella nostra esperienza, il successo di queste tecniche dipende da alcuni controlli chiave e le condizioni sperimentali. Uno è stabilire un controllo in modo asincrono proliferano per l&#39;impiego in questi esperimenti. Questo controllo ha tre scopi importanti. In primo luogo, fa sì che le condizioni di coltura utilizzate per tutti i campioni sperimentali sono sufficienti a sostenere la proliferazione continua in assenza di trattamento. Questo esempio serve anche lo scopo di un controllo positivo per la metodologia di colorazione per garantire che BrdU o cellule CD20 positivo può essere rilevato quando sono presenti. Infine, questo esempio è usato per calibrare il citofluorimetro. Questo campione di controllo può essere utilizzato per regolare l&#39;intensità colorante propidio ioduro per rilevare le cellule 2N e 4N a 200 e 400 rispettivamente. Inoltre, la sensibilità di rilevazione di BrdU o CD20 può essere regolata in modo che i segnali negativi e positivi sono concentrate, come mostrato nelle Figure 1A e 2A. Quando tutti i campioni hanno una concentrazione simile di cellule in PI-RSoluzione Nase, poi alcuni aggiustamenti al citometro sono necessari come campioni successivi vengono eseguiti. Questo è importante per ragioni mostrato in fig. 4B e 5B dove l&#39;accumulo G1 forte essenzialmente crea un unico picco G1 che potrebbe essere erroneamente interpretato come G2 / M. Gli esperimenti di rappresentanza anche fare altri punti importanti. Prima di tutto, dimostrano che l&#39;assorbimento BrdU ed etichettatura può variare tra i tipi di cellule. Per questo motivo è importante determinare empiricamente la lunghezza di impulso e condizioni colorazione necessari per individuare adeguatamente le cellule in fase S. In generale, i tipi di cellule che doppio nella cultura in 24 ore o meno possono essere etichettati con BrdU nel giro di un&#39;ora. Tipi di cellule in crescita più lenta può richiedere impulsi più lunghi e alterazioni delle condizioni di colorazione anticorpale e la durata. Cellule MCF10A sono un ottimo esempio in tal senso come lo erano etichettati con BrdU per quattro ore e colorati con il doppio della concentrazione standard di anticorpi per quattro volte più a lungo. Gli investigatoridevono stare attenti a non superare 6 ore di BrdU etichettatura anche con cellule molto lenta crescita come questo può portare ad includere erroneamente di G2 / M cellule nella fase S popolazione. In secondo luogo, nel confrontare gli effetti di p27Kip1 espressione con quelle di TGF-β1, è chiaro che p27 può indurre un accumulo sia in G1 o G2 / M, mentre le fasi di TGF-β1 segnalazione induce un arresto G1. Mezzi tradizionali di rilevazione proliferazione come 3 H-timidina e il conteggio a scintillazione non sono in grado di distinguere queste possibilità. Nel nostro protocollo alternativo dimostriamo l&#39;individuazione di una sotto-popolazione di cellule in una popolazione più ampia untransfected. E &#39;importante determinare empiricamente il giornalista più adatto per la rilevazione di cellule transfettate. Nella nostra esperienza alcuni tipi di cellule sia della superficie cellulare esprimere marcatori male, o non può propriamente loro traffico verso la membrana plasmatica, con conseguente impossibilità di rilevare le cellule transfettate. Likewise, non tutte le cellule tollerare la forma legata membrana di GFP. Selezione del reporter più appropriato dovrebbe essere presa da valutare l&#39;efficienza di transfezione del giornalista così come l&#39;intensità relativa di espressione rispetto ai controlli untransfected. Idealmente, espressione eterologa di queste molecole sarà ben tollerato e questo è indicativo che i marcatori hanno poco o nessun effetto sulla distribuzione del ciclo cellulare. Una limitazione di questi tipi di approcci citometria a flusso è che sono solo in grado di stabilire abbondanze relative delle fasi del ciclo cellulare rispetto a un altro. Per questo motivo è ambiguo se espressione di p27 in Figura 3 induce veramente un arresto in G1 e G2 / M, o se si rallenta la progressione solo attraverso queste fasi relative alla fase-S. Queste possibilità possono essere indagato ulteriormente trattando un campione parallelo di cellule con un inibitore mitotico come nocodazole, o G1 / S come inibitore afidicolina. Dal momento che questi farmaci creare una Dominaarresto nt in M-fase o all&#39;inizio fase S, rispettivamente, le cellule proliferano lentamente si accumula al punto di arresto indotto da farmaci. Per esempio le cellule in G1 arrestato a causa di espressione pRB resterà in G1 nonostante il trattamento nocodazole mentre le cellule di controllo si accumulano nella fase M-13. Presi insieme, questi approcci sperimentali offrono una metodologia flessibile che può essere applicata a una vasta gamma di domande del ciclo cellulare dei mammiferi la ricerca. Si può facilmente rilevare alterazioni nella progressione del ciclo cellulare e quantificare le differenze rispetto ai controlli.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / apparecchiatura </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> La proliferazione delle cellule reagente Etichettatura </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-BrdU </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-topo coniugato con FITC </td><td> Vector Labs </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Cellula Strain filtri </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-CD20 </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> Cycle Software Multi </td><td> Phoenix Flow Systems </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cell cycle position in mammalian cells

La regolazione della proliferazione cellulare è fondamentale per la morfogenesi dei tessuti durante lo sviluppo degli organismi multicellulari. Inoltre, la perdita di controllo della proliferazione cellulare alla base della patologia di malattie come il cancro. Come tale non vi è grande bisogno di essere in grado di studiare la proliferazione cellulare e quantificare la percentuale di cellule in ogni fase del ciclo cellulare. E &#39;inoltre di vitale importanza per identificare le cellule che sono indistintamente replicare il DNA all&#39;interno di una popolazione più ampia. Dal momento che la decisione di una cellula a proliferare è fatto nella fase G1 immediatamente prima di iniziare la sintesi del DNA e progredendo attraverso il resto del ciclo cellulare, la rilevazione della sintesi del DNA in questa fase consente una determinazione univoca dello stato di regolazione della crescita in coltura cellulare esperimenti. Contenuto di DNA nelle cellule può essere facilmente quantificato mediante citometria di flusso di cellule colorate con ioduro di propidio, un colorante fluorescente del DNA intercalanti.Allo stesso modo, la sintesi del DNA attivo può essere quantificato dalle cellule coltura in presenza di timidina radioattiva, la raccolta delle cellule, e misurando l&#39;incorporazione di radioattività in una frazione acido insolubile. Abbiamo una notevole esperienza con l&#39;analisi del ciclo cellulare e raccomandare un approccio diverso. Indaghiamo la proliferazione cellulare utilizzando bromodeossiuridina / fluorodeoxyuridine (abbreviato semplicemente come BrdU) colorazione che rileva l&#39;incorporazione di questi analoghi timina nel DNA sintetizzato di recente. L&#39;etichettatura e la colorazione delle cellule con BrdU, in combinazione con colorazione DNA totale da ioduro di propidio e analisi mediante citometria a flusso 1 offre la misura più accurata delle cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare. È il nostro metodo preferito perché unisce la rilevazione della sintesi del DNA attiva, attraverso la colorazione a base di anticorpi BrdU, con contenuto di DNA totale da ioduro di propidio. Questo permette la netta separazione delle cellule in fase precoce G1 da S, o S in ritardo di fase da G2 / M.Inoltre, questo approccio può essere utilizzato per studiare gli effetti di molti stimoli diversi cellulari e agenti farmacologici sulla regolazione della progressione attraverso queste diverse fasi del ciclo cellulare. In questo rapporto vengono descritti i metodi per l&#39;etichettatura e la colorazione di cellule in coltura, così come la loro analisi in citometria a flusso. Abbiamo anche esempi sperimentali di come questo metodo può essere utilizzato per misurare gli effetti dei segnali di inibizione della crescita di citochine come TGF-β1, e gli inibitori di proliferazione, come l&#39;inibitore della chinasi ciclina dipendente, p27Kip1. Abbiamo anche un protocollo alternativo che consente l&#39;analisi della posizione del ciclo cellulare in una sotto-popolazione di cellule all&#39;interno di una cultura più grande 5. In questo caso, dimostriamo come rilevare un arresto del ciclo cellulare nelle cellule transfettate con il gene del retinoblastoma anche se molto più numerosi da parte delle cellule untransfected nella stessa cultura. Questi esempi illustrano i tanti modi che la colorazione del DNA ecitometria a flusso può essere utilizzato e adattato per investigare questioni fondamentali di controllo del ciclo cellulare dei mammiferi.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells at JoVE.com

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Determinare la posizione del ciclo cellulare di una popolazione di cellule, o la comprensione di come i segnali influenzano la proliferazione, può essere facilmente misurato mediante citometria di flusso utilizzando questo protocollo. Riportiamo un semplice approccio sperimentale alla colorazione delle cellule e quantificare la loro posizione nel ciclo cellulare.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

analysis-of-cell-cycle-position-in-mammalian-cells

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

59.9K Views.  University of Western Ontario. Determinare la posizione del ciclo cellulare di una popolazione di cellule, o la comprensione di come i segnali influenzano la proliferazione, può essere facilmente misurato mediante citometria di flusso utilizzando questo protocollo. Riportiamo un semplice approccio sperimentale alla colorazione delle cellule e quantificare la loro posizione nel ciclo cellulare.

Video: Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

Ricerca

Biologia

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-chase Analisi di N-linked catene di zuccheri da glicoproteine ​​in cellule di mammifero

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

Analisi di espressione di mammifero Linker-istoni Sottotipi

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Methods Article

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero