Supportato da Career Development Award dalla ricerca per prevenire la cecità, le sovvenzioni NIH EY19312 e EY19543 (VJK), così come da sovvenzione illimitata di ricerca per la Prevenzione della Cecità e EY02687 (Dipartimento di Oftalmologia e Scienze visiva presso la Washington University).

1. Fare Elettrodi <ol><li> Preparare elettrodi di vetro. Pesare 120 mg agar e mescolare in 10 mL di acqua distillata (concentrazione finale di agar 1,2%). Sciogliere la soluzione di agar in bagno di acqua calda. Riempire il bicchiere capillari (usiamo Instruments Presision Word TW100-4 capillari con le seguenti dimensioni: lunghezza = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, e il volume interno = 44 mL), con la soluzione di agar con siringa di plastica. Solidificare la agar a temperatura ambiente per 10 min. Così, fino a ~ 200 capillari può essere riempito (il resto della miscela agar può essere conservato a -4 ° C e riutilizzato più volte). </li><li> Tagliare i capillari in due metà con un coltello di diamante. </li><li> Bagnare gli elettrodi vetro con conseguente soluzione topo elettrodo per almeno 24 ore a 4 ° C. Conservare gli elettrodi a 4 ° C e di usare il periodo di 3-4 mesi. </li></ol> 2. Configurazione del test <ol><li> Dark-adattare il mouse durante la notte. Utilizzare wild-type (per esempio, C57Bl / 6) i topi per le registrazioni transretinal asta T-driven e alfa - / - asta di topi privi di segnalazione 8 per le registrazioni cono transretinal. </li><li> 1 Preparare la soluzione di perfusione L, 100 ml di soluzione di elettrodi, e 20 ml di soluzione di incubazione (vedi sotto) e filtrare il liquido di perfusione attraverso un Millipore 0,45 um o 0,22 um filtro (opzionale). </li><li> Calibrare la sorgente luminosa (505-nm LED o lampadina stimolatore alogena ottica) con un fotometro posto al piano della retina. Nel caso della sorgente di luce LED, utilizzare un diffusore ottico per ottenere uniformità della luce. </li><li> Preparare la camera di perfusione per l&#39;esperimento (costruzioni camera può variare). La camera è fatta di plexiglas 3 mm, con un fondo fatta dal coperchio di una piccola capsula di Petri di plastica, e ha un volume attivo perfusione di ~ 400 pl (L = 25 mm, L = 8 mm, H ≈ 2 mm). Riempire il spazio elettrodo inferiore della camera con soluzione elettrodo contenente 2 mM L-glutammato e 10 mM BaCl 2. Utilizzo di tubi in plastica e un capillare di vetro, un collegamento tra la soluzione nello spazio di elettrodo inferiore (fatta di connettore del tubo in plastica attaccato al fondo della camera) e il porta-elettrodo. Assicurarsi che non vi siano bolle nel elettrodi, le tubazioni di collegamento, o il titolare elettrodo (eliminare la soluzione con siringa di plastica, se necessario). </li><li> Montare la camera di registrazione sulla scena del microscopio (opzionale: il microscopio può essere montato su un anti-vibrazione tavolo e schermati all&#39;interno di una gabbia di Faraday per minimizzare il rumore meccanica ed elettromagnetica). Collegare il portaelettrodo inferiore al polo headstage positivo dell&#39;amplificatore differenziale (ad es Warner Instruments DP-311 amplificatore). Centro e allineare l&#39;elettrodo camera bassa apertura con lo spot luminoso stimolo. Collegare la linea di perfusione alla camera di registrazione e attivare la perfusione via. </li><li> Bubble la soluzione di perfusione con% O 95 2/5% CO 2 mentre in incubazione a 40 ° C water bagno. CO 2 regola il pH della soluzione a 7,2. La soluzione fluisce dal flacone alla camera di registrazione per gravità passando attraverso un resistore ceramico riscaldamento a 36-37 ° C. Per ridurre la perdita di calore, la stufa deve essere posizionato il più vicino alla camera di registrazione possibile, idealmente sul palco del microscopio. </li><li> Con un regolatore di flusso regolare la portata di circa 1 mL / min. </li><li> Collegare l&#39;elettrodo superiore al secondo (negativa) del polo headstage utilizzando un supporto secondo elettrodo. Associare la sonda termocoppia all&#39;elettrodo superiore utilizzando un O-ring. Assicurarsi che le punte degli elettrodi e termocoppia sono vicine in modo che la lettura della temperatura viene preso come vicino al centro della retina come possibile. Immergere la punta dell&#39;elettrodo superiore nel liquido di perfusione e posizionarlo nel centro della camera. Lasciare 10-15 min per la stabilizzazione basale. </li><li> Regolare la tensione DC per il riscaldatore in modo che la temperatura della soluzione è di 36 -37 ° C. </li></ol> 3. Isolamento della retina di topo <ol><li> Sotto fioca luce rossa, l&#39;eutanasia il mouse adattato al buio con CO 2 e dislocazione cervicale. Opzionale: lasciare un segno di riferimento su ogni bulbo oculare mouse cauterizzare il punto più dorsale della sclera con una penna cauterizzazione o riscaldata pin dissezione. Tutte le procedure successive sono eseguite sotto la luce a infrarossi utilizzando convertitori di immagine all&#39;infrarosso idonei a un microscopio da dissezione. </li><li> Dissect gli occhi con forbici curve applicando una leggera pressione e distendendo la pelle sui lati di ciascun occhio. Hemisect entrambi i bulbi oculari con l&#39;illuminazione ad infrarossi utilizzando microscissors o una lama di rasoio. </li><li> Rimuovere la cornea e la lente. Rimuovere tanto del vitreo possibile. </li><li> Peel la retina primo strato dell&#39;epitelio pigmentato e, se necessario, accuratamente pulirla con pinze per rimuovere granuli rimanenti di dell&#39;epitelio pigmentato. Ci sono tipicamente usando retina complesso sia per asta e cono transretregistrazioni dolosi. Tuttavia, se si desidera registrare in particolare dalla parte dorsale della retina di topo che ha più M / L-coni 9, prima di sbucciarli retina rimuovere la parte ventrale del oculare con una lametta o microscissors utilizzando il marchio cauterio come riferimento. </li><li> Posizionare il bulbo oculare secondo hemisected in una piccola scatola di Petri con soluzione di incubazione e incubare il preparato in una scatola a tenuta di luce saturata con ossigeno puro fino al momento dell&#39;uso. Tipicamente, in queste condizioni l&#39;oculare secondo mouse può essere conservato per diverse ore a temperatura ambiente e utilizzato per le registrazioni. </li><li> Usando una pipetta di vetro o plastica trasferire la retina isolato di una goccia di soluzione di perfusione (ca. 300 ul) sul coperchio di una capsula di Petri. Aggiungere 5-6 gocce di soluzione di piccoli elettrodi contenenti BaCl 2 di pre-incubazione la retina con BaCl 2. Posizionare un pezzo quadrato (ca. 5x5 mm) del lato posteriore angolo ingrassato (usiamo Dow Corning 111 lubrificante valvola e sigillante) Millipore filtro di carta (0,45 um HARG tipo) con pre-made foro nel suo centro (2-2,5 mm di diametro) alla goccia stessa soluzione. Uso posizione pinze la retina sopra la carta da filtro (lato fotorecettori alto) e premere i bordi sulla periferia di piatto montarlo. La retina deve essere centrato sopra l&#39;apertura nella carta da filtro. </li><li> Uso pinze trasferire la carta da filtro con la retina alla camera di perfusione e posizionarlo sopra del punto stimolo allineato spazio di elettrodo inferiore. Leggermente premere i bordi ingrassati della carta da filtro di legame con la camera. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo superiore sopra il centro della retina (un po &#39;toccare lo strato dei fotorecettori). Centraggio l&#39;elettrodo superiore sulla retina aumenta l&#39;ampiezza del segnale (fino al 20-40% ~ rispetto dell&#39;immissione più vicino al bordo retina). Sebbene posizione degli elettrodi come distorce leggermente l&#39;effettiva intensità dello stimolo luce che raggiunge un piccolo settore della retina (~ 12-15% della sua superficie totale), è ancora il modo migliore di porre gli elettrodidell&#39;elettrodo. La preparazione è ora pronto per le registrazioni transretinal. </li></ol> 4. Registrazioni Transretinal <ol><li> A seconda della linea di mouse, record di asta o M / L-cone-driven risposte flash di prova da dim all&#39;intensità luminosa di luce calibrata 505 nm LED fornita da fonte di luce o stimolatore ottico. Nel caso della nostra sorgente luminosa a LED, l&#39;intensità del flash è controllato da una combinazione di controllo computerizzato della tensione di ingresso LED, resistori selezionabili, e un insieme di filtri a densità neutra (usiamo E-colore # 211 0,9 filtri ND films da Laboratories Rosco ) posto tra il LED e la retina. La durata della prova LED lampo (20 ms) è controllato da un computer. Se si utilizza uno stimolatore lampada alogena ottico, l&#39;intensità del flash prova e lunghezza d&#39;onda può essere controllato da un insieme di filtri a densità neutra e filtri di interferenza a banda stretta, rispettivamente. Test di durata del flash può essere controllata da computer basati su persiane. </li><li> Optional: per mantenere efficientesoppressione della componente gliale di fotorisposta con BaCl 2 durante il giorno, cambiare la soluzione elettrodo inferiore volte (ad esempio prima della prova ciascuna retina) di spurgo utilizzando una siringa di plastica pieno di soluzione fresca. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Soluzioni <ol><li> Mouse perfusione soluzione retina: 112,5 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1.2 mM CaCl 2, 10 HEPES (pH 7,2), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinato, 0,5 mM Na glutammato, 0,02 mM EDTA, e 10 mM di glucosio. Inoltre, la soluzione è addizionato con 2 mM L-glutammato e 10 pM DL-AP-4 per bloccare i componenti di ordine superiore della fotorisposta 10,11, e con 0,1% MEM vitamine e MEM soluzioni aminoacidi (Sigma) per migliorare la retina redditività. </li><li> Topo soluzione elettrodo: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). La soluzione in elementi più bassospazio ctrode contiene anche 2 mM L-glutammato di bloccare la trasmissione sinaptica 10 e, inoltre, 10 mM BaCl 2 per sopprimere la componente gliale del fotorisposta 3,12. </li><li> Incubazione della soluzione Retina: sciogliere 272 mg L-15 (Sigma) e 20 mg di BSA in 20 mL di acqua deionizzata. Finale L-15 e concentrazioni di BSA sono 13,6 mg / ml e 1 mg / ml, rispettivamente. Regolare il pH a 7,4 con 1 M HCl. </li></ol><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" /> Figura 1. Schema che mostra l&#39;isolamento di retina di topo per transretinal registrazioni ERG. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" /> Figura 2. Fotografia della camera di perfusione e gli elettrodi di registrazione con i loro titolari. Frecce rosse indicano la direzione del flusso perfusione. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg"/&gt; Figura 3. Schema del setup sperimentale per transretinal registrazioni ERG. Frecce rosse indicano la direzione del flusso perfusione. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" /> I risultati rappresentativi Figura 4:. Registrato famiglia di topo risposte transretinal rod-driven. Fotorisposte erano filtro passa-basso a 30 Hz (8 poli Bessel), digitalizzato a 1 kHz e memorizzati su un computer per ulteriori analisi. Tracce indicate corrispondono alle medie di 5-6 risposte con intensità di luce fioca e 2-3 risposte con intensità di luce saturazione. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" /> Figura 5: I risultati rappresentativi. Famiglia di mouse registrata risposte transretinal cono-driven. Fotorisposte erano filtro passa-basso a 30 Hz (8 poli Bessel), digitalizzato a 1 kHz e memorizzati su un computer per ulteriori analisi. Tracce indicate sono Averages di risposte 5-10 con intensità di luce fioca e 3-5 risposte con intensità di luce saturazione.

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	<li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments.">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li><li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings.">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+photoproducts:+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina.">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li><li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle.">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li><li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M/L-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein.">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li><li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit.">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li><li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li><li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response.">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li><li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery.">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li><li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina.">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo di asta-e cono-driven transretinal registrazioni ERG sopra descritto sta diventando un potente strumento per studiare la funzione dei fotorecettori del mouse sia nel tipo selvatico e animali geneticamente modificati. Oltre alla caratterizzazione delle proprietà di facile fotorisposta base, questa semplice tecnica fornisce una grande stabilità durante risposta durature esperimenti condotti su prossima al intatte preparati retina. Sia adattato al buio dell&#39;ampiezza della risposta massima asta fotosensibili...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> DL-AP-4 </td><td></td><td> Bioscienze Tocris </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> Tutti gli altri reagenti </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetro capillari </td><td></td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> TW100-4 </td><td> Per la realizzazione di elettrodi </td></tr><tr><td> Carta da filtro </td><td> HARG </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> Fotometro </td><td></td><td> UDT Instruments </td><td> S350 </td><td> Per la calibrazione della luce </td></tr><tr><td> Sensore di silicio radiometrica </td><td></td&gt; <td> UDT Instruments </td><td> 221 </td><td> Per la calibrazione della luce </td></tr><tr><td> Anti-vibrazioni tavolo </td><td></td><td> Technical Manufacturing Corporation </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 </td><td> Per ridurre al minimo rumore meccanico </td></tr><tr><td> Compressore d&#39;aria Panther P 15TC </td><td></td><td> Werther International </td><td> P 15TC </td><td> Collegato al tavolo anti-vibrazioni </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> Per la dissezione del mouse gli occhi </td></tr><tr><td> Convertitori di immagini a infrarossi </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> Bound to stereomicroscopio </td></tr><tr><td> Amplificatore differenziale DP-311 </td><td></td><td> Warner Instruments </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A Digitizer </td><td>; </td><td> Molecular Devices </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Dual Channel a 8 poli Filter </td><td></td><td> KROHN-HITE Corporation </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> Resistenza in ceramica </td><td></td><td> TE Connectivity </td><td> CGS SBCHE618RJ </td><td> Per riscaldare il liquido di perfusione </td></tr><tr><td> Termocoppia </td><td> T </td><td> Physitemp Instruments </td><td> IT-18 </td><td></td></tr><tr><td> Temperature Monitor </td><td></td><td> Omega </td><td> DPi32 </td><td> Collegato a termocoppia </td></tr><tr><td> LED 505 nm </td><td></td><td> TT Electronics / Optek Technology </td><td> Digi-Key P / N 365-1185-ND </td><td> Per applicare lampi di analisi e di luce sbiancamento </td></tr><tr><td> Pen cauterio </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> Per marcare la parte dorsaledel bulbo topo </td></tr><tr><td> PClamp 10 Elettrofisiologia di acquisizione dati e software per l&#39;analisi </td><td></td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal erg recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses

Ci sono due classi distinte di formazione di immagini fotorecettori della retina dei vertebrati: bastoncelli e coni. I bastoncelli sono in grado di rilevare singoli fotoni di luce, mentre i coni operano continuamente sotto rapida evoluzione delle condizioni di luce intensa. L&#39;assorbimento della luce da parte di asta-e pigmenti visivi cono-specifiche nei segmenti esterni dei fotorecettori fototrasduzione innesca una cascata che porta alla chiusura dei ciclici nucleotide-gated canali sulla membrana plasmatica delle cellule e la iperpolarizzazione. Questa luce cambiamento indotto nella membrana attuale e potenziale può essere registrato come fotorisposta, da una classica tecnica di aspirazione 1,2 elettrodo di registrazione o da registrazioni elettroretinografico transretinal (ERG) da retine isolate con farmacologicamente bloccate componenti risposta postsinaptica 3-5. Quest&#39;ultimo metodo consente di droga accessibili a lunga durata delle registrazioni da fotorecettori del mouse ed è particolarmente utile per ottenere fotorisposte stabili from i coni del mouse scarse e fragile. In caso di coni, tali esperimenti possono essere eseguiti sia in condizioni di buio adeguate e seguenti illuminazione intensa che candeggianti essenzialmente il pigmento visivo, per monitorare il processo di recupero cono fotosensibilità durante l&#39;adattamento al buio 6,7. In questo video, ci mostrerà come eseguire le registrazioni transretinal asta e M / L-cone-driven da dark-adattato retina mouse. Registrazioni stelo sarà effettuata utilizzando retina di tipo selvatico (C57BL / 6) topi. Per semplicità, cono le registrazioni saranno ottenute da organismi geneticamente modificati asta transducina α-subunità knockout (Tα - / -) topi che mancano di asta di segnalazione 8.

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Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Descriviamo un metodo relativamente semplice di transretinal elettroretinogramma (ERG) per l&#39;ottenimento di registrazioni fotorisposte asta e cono da retina di topo intatto. Questo approccio sfrutta il blocco della trasmissione sinaptica da fotorecettori per isolare le loro risposte chiare e registrarli usando elettrodi posizionati sul campo in tutto il isolato piatto montato retina.

Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.6K Views.  Washington University School of Medicine. Descriviamo un metodo relativamente semplice di transretinal elettroretinogramma (ERG) per l'ottenimento di registrazioni fotorisposte asta e cono da retina di topo intatto. Questo approccio sfrutta il blocco della trasmissione sinaptica da fotorecettori per isolare le loro risposte chiare e registrarli usando elettrodi posizionati sul campo in tutto il isolato piatto montato retina.

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Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome sezionamento mouse Retina preparare Culture fotorecettori

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the analysis of density and size gradients of retinal cell types, the direction tuning of direction-selective ganglion cells, and the examination of topographic degeneration patterns in some retinal diseases. However, there are many different ocular dissection methods reported in the literature that are used to identify and label retinal orientation in the mouse retina. While the method of orientation used in such studies is often overlooked, not reporting how retinal orientation is determined can cause discrepancies in the literature and confusion when attempting to compare data between studies. Superficial ocular landmarks such as corneal burns are commonly used but have recently been shown to be less reliable than deeper landmarks such as the rectus muscles, the choroid fissure, or the s-opsin gradient. Here, we provide a comprehensive guide for the use of deep ocular landmarks to accurately dissect and document the spatial orientation of an isolated mouse retina. We have also compared the effectiveness of two s-opsin antibodies and included a protocol for s-opsin immunohistochemistry. Because orientation of the retina according to the s-opsin gradient requires retinal reconstruction with Retistruct software and rotation with custom code, we have presented the important steps required to use both of these programs. Overall, the goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable set of methods for accurate retinal orientation that is adaptable to most experimental protocols. An overarching goal of this work is to standardize retinal orientation methods for future studies.

This protocol provides a comprehensive dissection and analysis guide for the use of deep ocular landmarks, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct, and custom code to accurately and reliably orient the isolated mouse retina in anatomical space.

Dove si taglia materia: Una dissezione e analisi guida per l'orientamento spaziale della Retina di topo da oculare luoghi d'interesse

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel telemetric electroencephalography system in combination with standard self-adhesive hydrogel electrodes. The piglets are calmed down without the use of sedatives. After their release into the pigpen, the piglets behave normally&#8212;they drink and sleep in the same cycle as their siblings. Their sleep phases are used for the EEG recordings.

Here, we present a protocol to record telemetric electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen without the use of a sedative, making it possible to record typical EEG patterns during non-REM sleep, like spindle bursts.

Registrazioni di EEG non invadente da muoversi liberamente suinetti

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the brains of AD patients, these do not improve memory functions. Since A&#946; aggregates in the brain before the appearance of memory impairments, targeting A&#946; may be inefficient for treating AD patients who already exhibit memory deficits. Therefore, downstream signaling due to A&#946; deposition should be blocked before AD development. A&#946; induces axonal degeneration, leading to the disruption of neuronal networks and memory impairments. Although there are many studies on the mechanisms of A&#946; toxicity, the source of A&#946; toxicity remains unknown. To help identify the source, we propose a novel protocol that uses microscopy, gene transfection, and live cell imaging to investigate early changes caused by A&#946; in axonal growth cones of cultured neurons. This protocol revealed that A&#946; induced clathrin-mediated endocytosis in axonal growth cones followed by growth cone collapse, demonstrating that inhibition of endocytosis prevents A&#946; toxicity. This protocol will be useful in studying the early effects of A&#946; and may lead to more efficient and preventative AD treatment.

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &amp;#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Here a protocol to investigate the early effects of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain is presented. This shows that A&#946; induces clathrin-mediated endocytosis and collapse of axonal growth cones. The protocol is useful in studying early effects of A&#946; on axonal growth cones and may facilitate prevention of Alzheimer's disease.

Visualizzazione di collasso del cono di crescita assonale ed effetti precoci β amiloide in neuroni coltivati del topo

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

Culture arricchite di coni dalla retina degli embrioni di pollo per studiare le interazioni cellulari tra bastone e cono

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo Letture di lesioni vascolari nella retina del topo per promuovere la riproducibilità

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Mouse Retina Isolation and Flattening

After fixing the enucleated eyeball of the euthanized mouse, transfer it to a glass slide and place it under a dissecting microscope. Using forceps, clamp the margin of the cornea to prevent eyeball movement. With the dissecting scissors, cut around the cornea at a depth of approximately one millimeter through the cornea scleral limbus, and then remove the lens and vitreous body.Holding the optic disc at the center, cut the retina radially along the four quadrants, reaching approximately 2/3 of the retina's radius. Clamp one of the scleral edges using toothed forceps. Hold the sclera edge with untoothed forceps and move from the toothed forceps toward the sclera base.Carefully peel the retina. Wet the retina with 200 microliters of PBS using a pipette. Remove excess PBS using absorbent paper, and flatten the retina with a small bristle brush if needed.Slowly add cold methanol drop-by-drop onto the retina's inner surface until it covers completely. Once the retina turns white and develops increased tenacity, gently flatten the retina and remove impurities, such as residual pigment membranes and the vitreous body, with a small bristle brush. After inverting the retina, treat it with methanol as previously demonstrated, and transfer it into a well of 24 well plate, Soak it in methanol and store it at 20 degrees Celsius for one to two hours for immediate immunostaining.Then rinse the retina with PBS after removing methanol from the plate. The retinol ganglion cells of the retinas before and after methanol treatment were visualized using confocal microscopy, which indicated that the 12 months of methanol preservation did not affect the RGC immunostaining.