Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Research Council svedese (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61x-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; le fondamenta della Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Martha Lundqvist e Sigurd och Elsa Goljes Minne e Società Svedese di Medicina SLS-95151. Professor Gene D. Block, UCLA, si ringrazia per preziosi commenti sul manoscritto. Ringraziamo il dottor Michael Andäng e la dottoressa Helena Johard per il bloccante dei canali HCN, e il Prof. Abdel El-Manira per la fornitura di microscopio video. Considerazioni etiche: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal Karolinska Institutet e &quot;Stoccolma Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. Tutti gli esperimenti su animali vengono eseguiti con l&#39;intento di ridurre al minimo ogni possibile stress o disagio per l&#39;animale.

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li><li>Green, D. J., Gillette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+firing+rate+recorded+from+single+cells+in+the+rat+suprachiasmatic+brain+slice.">Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice.</a> Brain Res. 245, 198-200 (1982).</li><li>Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythmic+changes+of+neuronal+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+the+rat+hypothalamic+slice.">Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice.</a> Brain Res. 247, 154-158 (1982).</li><li>Groos, G., Hendriks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+electrical+discharge+of+rat+suprachiasmatic+neurones+recorded+in+vitro.">Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro.</a> Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).</li><li>Moore, R. Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system.">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , 13-15 (1991).</li><li>Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat:+intrinsic+anatomy.">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats.">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li><li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. a. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+circadian+rhythms+in+c-fos+gene+expression+from+suprachiasmatic+nucleus+cultures.">Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures.</a> Curr Biol. 7, 758-766 (1997).</li><li>Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Yamazaki, S., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+luminescence+reporting+of+circadian+gene+expression+in+mammals.">Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals.</a> Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).</li><li>Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+preparation+time+on+phase+of+cultured+tissues+reveal+complexity+of+circadian+organization.">Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization.</a> J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (1997).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).</li><li>O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP-dependent+signaling+as+a+core+component+of+the+mammalian+circadian+pacemaker.">cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker.</a> Science. 320, 949-953 (2008).</li><li>Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+altered+period1+expression+in+the+suprachiasmatic+nuclei+of+Vipr2-/-+mice.">Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice.</a> J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+Period1+clock+gene+expression+in+NOS+amacrine+cells+of+the+mouse+retina.">Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina.</a> Brain Res. 1050, 101-109 (2005).</li><li>Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+clock+nucleus:+a+multiphasic+oscillator+network+regulated+by+light.">The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light.</a> J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).</li><li>LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+half-life+GFP+mouse+model+for+analysis+of+suprachiasmatic+nucleus+organization.">A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization.</a> Brain Res. 964, 279-287 (2003).</li><li>Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+Period+1+expression+within+the+suprachiasmatic+nucleus.">Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus.</a> J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).</li><li>Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+aged+rats.">Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats.</a> Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).</li><li>Croning, M. D., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+brain+slice+chamber+designs+for+investigations+of+oxygen+deprivation+in+vitro.">Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro.</a> J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).</li><li>Burgoon, P. W., Boulant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+properties+of+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons.">Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).</li><li>Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation.">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins.">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li><li>Kohn, R. A., Dunlap, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+buffering+capacity+of+bicarbonate+in+the+rumen+and+in+vitro.">Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro.</a> J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).</li><li>Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photic+and+circadian+expression+of+luciferase+in+mPeriod1-luc+transgenic+mice+in+vivo.">Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vantaggi e svantaggi della tecnologia giornalista luciferasi In contrasto con ex metodi in vivo, come la RT-PCR, ibridazione in situ e Western blot che richiedono il campionamento dei tessuti in molti diversi momenti (per un periodo di bassa risoluzione di solito 2-4 ore a seconda della frequenza di campionamento) al fine di studiare diurno variazioni nelle espressioni dei geni e delle proteine, la tecnologia giornalista luciferasi permette ad alta risoluzione (1-10 min) studi di oscillazioni circadiane per molti giorni nella stessa preparazione. Gli studi in tal modo, il numero di animali utilizzati è ridotto al minimo e dettagliata degli effetti sulla fase e periodo del ritmo sono fattibili, che normalmente non è possibile utilizzando tecniche convenzionali di campionamento con risoluzione minimo storico. Tuttavia, anche se le misurazioni ampiezza relativa del ritmo sono possibili, va sottolineato che la tecnologia giornalista non è quantitativo e non può quindi essere utilizzato per misurare la quantità di geni trascritti o proteine ​​tradotte. Le registrazioni dei tessuti può essere avviato e analizzati immediatamente dopo la coltura, un grande vantaggio per studiare direttamente gli effetti molecolari dello stress in vivo, in vivo indotta dalla luce sfasamenti ecc cultura SCN organotipica permette di lungo periodo (settimane) la manipolazione farmacologica del cervello adulto tessuto contenente un intatto rete maturo sinaptica e la tecnologia giornalista luciferasi permette registrazioni stabile per molte settimane. Così, il tessuto non ha bisogno di essere neonatale o postnatale precoce al fine di ottenere colture sane e, in contrasto con l&#39;acuta fetta trattamenti farmacologici cronici possono essere eseguite. In contrasto con plasmide-reporter trasfezioni in colture cellulari, che non fanno portare alla incorporazione di DNA nel genoma, il transgenico-luciferasi modelli animali (così come Lenti-virus trasfezioni) sono favorevoli se alterazioni epigenetiche sono da studiare. Si deve in questo contesto inoltre ricordato che l&#39;imaging luminescenza è oggi possibile con telecamere CCD ad alta sensibilità 11, permettendo registrazioni anche nei neuroni SCN singola (~ 6-10 micron) e di altri tipi cellulari, utilizzati dai grandi laboratori studiando i ritmi circadiani. Infine, alcuni investigatori circadiano usa comunemente il monitoraggio di espressione molecolare con altri giornalisti, come la proteina fluorescente verde, al fine di studiare geni orologio / oscillazioni proteine ​​16-19. Aspetti di spessore della fetta Gli spessori qui raccomandato della fetta SCN (200-300 micron) potrebbe essere ridotto o aumentato, se desiderato. Tuttavia, anche se il tessuto si appiattisce sulla membrana dopo alcuni giorni di cultura, non è consigliabile superare i 500 micron di spessore della fetta inizialmente tagliati al fine di preservare la vitalità del tessuto 7. Una fetta più sottile di 100 micron è di ragioni meccaniche e pratiche difficili da maneggiare. Perché il tessuto SCN è eterogeneo lo spessore della fetta può influenzare la fase del segnale di uscita luciferasi, dal momento che diverse regioni del SCN (ad esempio il &quot;core&quot; rispetto al &quot;guscio&quot;, e delle regioni dorsali contro ventrale) oscillano con le diverse fasi 20 e differenziale re-sincronizzazione dopo sfasamenti 21. Lo spessore della fetta influisce anche sulla base del numero di fotoni da più tessuti emette un maggior numero di fotoni. L&#39;ampiezza delle oscillazioni molecolari possono in questo modo indirettamente essere influenzata dalle dimensioni del l&#39;espianto. Per queste ragioni, il controllo e colture trattate devono essere sempre delle stesse dimensioni, spessore e contenenti la stessa regione del SCN al fine di oscillare nella stessa fase e con la stessa ampiezza. I due nuclei unilaterale, invece, oscillano in fase tra loro e con ampiezze simili fino a quando il taglio vibratome è orizzontale e non inclinato (che a sua volta dipende dal taglio che la separazione tra il cervelletto e le due emisferi è perpendicolare per la superficie del tavolo). Un investigatore che esegue la coltura SCN possono verificare che le culture SCN non oscillano in fase tra loro. Praticare e standardizzazione della tecnica di taglio, cioè le fette sono sempre tagliati alla stessa rostro-caudale livello del SCN, migliorerà il risultato. Passaggi critici <ol><li> Apporto di ossigeno è fondamentale. Perché il cervello richiede un sacco di ossigeno 22, la procedura di taglio deve essere veloce (il più vicino è quello di 3,1-3,10 ~ 5-6 minuti il meglio è in modo da mantenere il tessuto sano). </li><li> Il SCN è sensibile alle variazioni di temperatura e lo scambio di media. Il SCN è sensibile alla temperatura e variazioni di temperatura possono grande sfasamento il pacemaker e causare artefatti sperimentali 23. Se media o soluzioni sono sostituiti o aggiunti durante un esperimento in corso, per esempio quando si applica un farmaco dopo un paio di giorni di cultura, i media o solution deve essere pre-riscaldato a 36-37 ° C (la stessa temperatura nella camera) prima di addizione. Negli esperimenti farmacologici che coinvolgono scambi di media, è importante lavorare sempre con la pre-condizione terreno di coltura cellulare. Inoltre / wash-out con fresco, mezzano incondizionato può potenzialmente sfasamento del ritmo molecolare SCN 24 nonché altre culture tipo di cellula 25. </li><li> Composizione media. E &#39;importante la cultura del tessuto di pH corretto e osmolalità. L&#39;aria-buffering terreno contiene una grande quantità di HEPES, che ha una capacità ottimale del buffer nel range di pH 6,8-8,2 ed è anche adatto per il buffering dei cambiamenti di pH che possono verificarsi a causa della respirazione cellulare. HEPES, invece, è più sensibile alle variazioni di temperatura rispetto al bicarbonato di sodio, che è incluso in piccole quantità nel terreno di coltura. Bicarbonato di sodio ha una maggiore capacità di tamponamento del pH più basso (5,1-7,1) Gamma 26, in tal modo appropriato in un CO 2 nell&#39;atmosfera. Tuttavia, una maggiore quantità di bicarbonato di sodio in aria-buffering medium (DMEM 2902) aumenta la osmolalità modo significativo e non può essere aggiunto senza contemporaneamente diluire il mezzo, che a sua volta nella composizione errata di aminoacidi, vitamine e ioni. Consigli per la preparazione del mezzo: <ol><li> Essere preciso e attento durante la miscelazione del mezzo. </li><li> Utilizzare soluzioni di riserva solo fresco o appena scongelato. </li><li> In caso di osmolalità molto elevato non vale la pena di diluizione. Più di 5-6% di media-diluita molto probabilmente non funziona. Usare D-glucosio per aumentare osmolalità se è troppo bassa. </li></ol></li><li> Fase turni a causa di tempi di preparazione Il tempo di preparazione fetta è critica. Effetto nullo o minimo sui fase si ottiene se la procedura viene eseguita fetta tra ZT 6-12 dicembre. Tutte le dissezioni fetta devono essere effettuate presso la stessa fase del ciclo diurno o circadiano al fine di minimizzare l&#39;errore dovuto alla variazione di fase tra i preparativi. </li></ol> Eventuali modifiche <ol><li> Per elettrofisiologia SCN acuta, il taglio deve essere eseguito con una suoneria (Artificial liquido cerebrospinale; ACSF) tampone, satura di ossigeno (95% O 2, 5% CO 2) prima dell&#39;inizio taglio. Inoltre, l&#39;ossigeno è necessario aggiungere continuamente al buffer durante l&#39;intera procedura taglio, in quanto l&#39;attività elettrica e sinaptica è direttamente dipendente dalla fornitura di ossigeno 22. </li><li> Fette orizzontale e sagittale può anche essere successo preparato e colto del SCN. Gli autori hanno esperienza con le registrazioni luciferasi a fette orizzontali, che secondo la nostra esperienza dare oscillazioni circadiano con minore ampiezza rispetto al taglio coronale. </li><li> Il SCN è di circa 1 mm di lunghezza rostro-caudale e la tecnica di taglio qui descritto è indirizzati verso l&#39;acquisizione di una sezione di SCN nella regione centrale. Tuttavia, più di una sezione SCN possono essere ottenute da topo e cervello dei topi, permettendo l&#39;indagine del gene circadiano / espressione della proteina a livelli più rostrale rispetto caudale del nucleo SCN. </li><li> Culture fetta da animali giovani, cuccioli o anche dopo la nascita degli embrioni, può anche essere preparati. Si prega di notare che il cervello e il cranio in cuccioli molto giovani sono molto morbidi e sensibili. Inoltre, il nervo ottico è sottile e non pienamente sviluppata. Fare attenzione quando sezionare il cervello dei cuccioli in modo che la regione SCN non sia danneggiato. Per esempio, i micro pinza ossivora strumenti non possono essere usati per aprire il cranio di cuccioli di topo, perché sono troppo grandi. Forbici sono sufficienti per tagliare i tessuti molli nei cuccioli giovani. </li><li> Il vetro di copertura tecnica basata cultura qui descritto può essere utilizzato anche per luminescenza immagine usando un CCD / EM-CCD, anche nei neuroni SCN singolo. </li><li> Altre regioni del sistema nervoso centrale e nei tessuti degli organi periferici da transgenici PER2:: LUC animali può essere facilmente ottenuto, colti e analizzati in termini di oscillazioni molecolari, come la PER2:: LUC espressione continua ad oscillare per molti giorni anche in diversi altri tessuti e tipi di cellule 10. La maggior parte di questi tessuti periferici, per il fegato esempio, non richiedono una membrana per la sopravvivenza, ma sono invece colti direttamente immerso nel mezzo 11. Si prega di notare che la fase di spostamento a causa di sezionamento, coltura e lo scambio di media non può seguire gli stessi principi di SCN. </li></ol> Significato In topi transgenici e ceppi di ratto (mPER2:: LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) l&#39;attività enzimatica luciferasi riflette proteina o ritmi espressione genica e può essere valutato mediante la registrazione bioluminescenza. La luciferasi generati bioluminescenza dà un segnale debole, ma la luminescenza di fondo è vicino a zero, rendendo questo metodo vantaggioso. Inoltre, poiché la molecola luciferasi è instabile e rapidamente degradata non c&#39;è phototossicità, che possono comparire durante il lungo periodo di illuminazione eccitatori 28. Prese insieme, queste caratteristiche permettono di lunga durata esperimenti di rendere la tecnologia giornalista luciferasi altamente vantaggiosa in ricerca circadiano.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>B27 supplement 50x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>40#1</td>
<td>&#8776; 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture membranes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>0.4 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM low glucose w/o phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2902</td>
<td>Powder for 1L</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1003 055</td>
<td>&#8776; 55 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtration set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431097</td>
<td>Pore size 0.22 &mu;m
Polyethersulfone</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>0203-7-PS</td>
<td>Dumant #7</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15630-056</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS 10x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco </td>
<td>14065-049</td>
<td>500 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOCH3 7.5%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25080-060</td>
<td>50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Luciferin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1602</td>
<td>Beetle luciferin, potassium salt</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro rongeur tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>332-097-140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430165</td>
<td>&#8776; 35 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PMT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>H9319-11MOD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Paragon</td>
<td>P503</td>
<td>Size 11</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>09-761-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus

Una centrale circadiano (~ 24 ore) orologio coordinamento ritmi quotidiani in fisiologia e del comportamento risiede nel nucleo soprachiasmatico (SCN) che si trova nell&#39;ipotalamo anteriore. L&#39;orologio è sincronizzato direttamente dalla luce attraverso la retina e del nervo ottico. Oscillazioni circadiani sono generati attraverso l&#39;interazione feedback negativo di una serie di cosiddetti &quot;geni dell&#39;orologio&quot; ei loro prodotti proteici, compreso il periodo (al) geni. Il clock del core dipende anche dalla depolarizzazione della membrana, di calcio e campo 1. Il SCN mostra oscillazioni giornaliere di espressione del gene orologio, l&#39;attività metabolica e attività elettrica spontanea. Sorprendentemente, questa attività ciclica endogena persiste a fette tessuto adulto del SCN 2-4. In questo modo, l&#39;orologio biologico possono essere facilmente studiate in vitro, permettendo indagini molecolari, elettrofisiologici e metabolici della funzione di pacemaker. Il SCN è una piccola struttura ben definita bilaterale trova proprio sopra il chiasma ottico 5. Nel ratto contiene ~ 8,000 neuroni in ogni nucleo e ha dimensioni di circa 947 micron (lunghezza, asse rostrocaudal) x 424 micron (larghezza) x 390 micron (altezza) 6. A sezionare il SCN è necessario tagliare una fetta cervello a livello del cervello dove il SCN può essere identificato. Qui, descriviamo la procedura di dissezione e taglio del SCN, che è simile per il mouse e il cervello di ratto. Inoltre, ci mostra come la cultura del tessuto sezionato organotypically su una membrana 7, una tecnica sviluppata per la cultura SCN tessuto da Yamazaki et al. 8. Infine, abbiamo dimostrato come il tessuto transgenici possono essere usati per misurare l&#39;espressione dei geni orologio / proteine ​​utilizzando la tecnologia dinamica luciferasi giornalista, un metodo che in origine era usato per le misurazioni circadiano da Geusz et al. 9. Noi qui utilizzare tessuti SCN dal transgenico knock-in PERIOD2:: topi luciferasi prodotto da Yoo et al 10.. I topi contengono una proteina di fusione del PERIODO (PER) 2 e l&#39;enzima luciferasi lucciola. Quando PER2 si traduce nella presenza del supporto per la luciferasi, cioè luciferina, l&#39;espressione PER2 può essere monitorato come bioluminescenza quando luciferasi catalizza l&#39;ossidazione della luciferina. Il numero di fotoni emessi è correlato positivamente alla quantità di proteina prodotta PER2, ei ritmi bioluminescenza corrispondere al ritmo PER2 proteina in vivo 10. In questo modo la variazione ciclica nell&#39;espressione PER2 può essere continuamente monitorato in tempo reale durante molti giorni. Il protocollo che seguiamo per la coltura dei tessuti e la registrazione in tempo reale bioluminescenza è stato accuratamente descritto da Yamazaki e Takahashi 11.

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Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

La procedura di fette preparazione contenente l&#39;adulto del mouse nucleo ipotalamico soprachiasmatico (SCN), e un modo rapido per la cultura del tessuto SCN in condizioni cultura organotipica, sono segnalati. Inoltre, la misurazione della oscillatorio espressione della proteina del gene orologio utilizzando la tecnologia dinamica luciferasi giornalista è descritto.

Fetta Preparazione, coltura tissutale organotipica e Registrazione luciferasi di attività Clock gene nel nucleo soprachiasmatico

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

slice-preparation-organotypic-tissue-culturing-luciferase-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

34.9K Views.  Karolinska Institutet. La procedura di fette preparazione contenente l'adulto del mouse nucleo ipotalamico soprachiasmatico (SCN), e un modo rapido per la cultura del tessuto SCN in condizioni cultura organotipica, sono segnalati. Inoltre, la misurazione della oscillatorio espressione della proteina del gene orologio utilizzando la tecnologia dinamica luciferasi giornalista è descritto.

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The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l&#39;esame di danno neuronale

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Ricerca

Neuroscienze

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipica Culture Slice ippocampale

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imaging Pheromone Sensing in preparazione dei tessuti Vomeronasal acuta Slice mouse

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

L&#39;analisi di morfologia dendritica delle cellule di Purkinje in Culture Slice organotipiche

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Registrazione e analisi dei ritmi circadiani in Running-ruota Attività nei roditori

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

L&#39;analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the stimulation parameters (e.g., orientation, field strength, and stimulation duration) need to be examined in mice brain slice preparations. Testing and arranging the orientation of the electrode relative to the position of the mice brain slice are feasible. The present method preserves the thalamocingulate pathway to evaluate the effect of DCS on anterior cingulate cortex seizure-like activities. The results of the multichannel array recordings indicated that cathodal DCS significantly decreased the amplitude of the stimulation-evoked responses and duration of 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity. This study also found that cathodal DCS applications at 15 min caused long-term depression in the thalamocingulate pathway. The present study investigates the effects of DCS on thalamocingulate synaptic plasticity and acute seizure-like activities. The current procedure can test the optimal stimulation parameters including orientation, field strength, and stimulation duration in an in vitro mouse model. Also, the method can evaluate the effects of DCS on cortical seizure-like activities at both the cellular and network levels.

Studies have shown that cathodal transcranial direct-current stimulation can produce suppressive effects on drug-resistant seizures. In this study, an in vitro experimental setup was devised in which the direct-current stimulation and multielectrode array recording of seizure-like activity were evaluated in mice brain slice preparation. The direct-current stimulation parameters were evaluated.