Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Charles Luetje per la fornitura del T-labirinto e la sala comportamento. Questo lavoro è supportato dalla American Heart Association (a YA), l&#39;Istituto Nazionale per il Disturbo neurologici e colpo di Grant R01NS64269 (a RGZ), e Pew Charitable Trust (a RGZ).

1. Introduzione In questo video, ci mostrerà due saggi comportamentali utilizzando Drosophila per dimostrare la misura di locomozione e le funzioni di apprendimento e memoria che sono compromesse nei disordini neurodegenerative. In primo luogo, mostreremo come il comportamento motorio può essere misurata con il test negativo geotassi. In secondo luogo, si valuterà la capacità di apprendimento e la memoria vola utilizzando positivamente phototactic che sono addestrati ad associare la luce con un gusto amaro avversivo e poi testato 6 ore dopo per valutare le funzioni di memoria. Infine, si discutono le implicazioni ei limiti di questi test comportamento. 2. Attrezzature e reagenti <ol><li> Vola lavoro <ul><li> Ambito stereo (Zeiss) </li><li> Pennelli piccoli per spingere le mosche </li><li> Drosophila anidride carbonica (CO 2) dell&#39;apparecchio di anestesia (Geneseesci, Inc) </li></ul></li><li> Geotassi test negativo <ul><li> 28,5 x 95 polistirolo Vial mm (Capitol Vial, Inc.) </li><li> Mini-allarme timer / cronometro (VWR International) </li><li> Penne Sharpie </li><li> Nastro adesivo </li></ul></li><li> Avversiva fototassi Soppressione Assay <ul><li> Chinino cloridrato (Sigma Aldrich, numero CAS: 6119-47-7) </li><li> Acqua distillata </li><li> Digital scala di misurazione per la diluizione precisa in peso </li><li> Connettori rapidi Disconnetti, polietilene ad alta densità (Nalgene VWR Catalog No. 62868-021) </li><li> 15 Centrifuga Tubo mL (VWR International), tagliata in segno di 2 ml da fine chiuso per adattarsi con la Quick Disconnect adattatore connettore per fonte di luce </li><li> Singolo canale 200 pipetter microlitri per caricare soluzione di chinino su carta da filtro rivestimento della camera </li><li> T-Maze (Simple sistemi comportamentali; Figura 1) </li><li> Foglio di alluminio </li><li> Sorgente luminosa (Zeiss) </li><li> Una lampada con luce rossa. </li><li> Filtro di carta </li><li> Mini-allarme timer / cronometro (VWR International) </li></ul></li></ol> 3. Preparazione delle mosche <ul><li> Le mosche sono mantenuti su standard di farina di mais-agar-melassa, lievito di media a 25 ° C 12 ore su un ciclo luce / buio. </li><li> Vola Virgin sono isolati in anestesia anidride carbonica nel giorno della eclosion. Per gli studi di invecchiamento, le mosche sono mantenuti in gruppi di venti per fiala e trasferito in una fiala fresco ogni 3 giorni. E &#39;importante utilizzare le mosche fratello dalla croce stessa dei genitori per gli studi di invecchiamento, di minimizzare le differenze derivanti da substrato genetico. </li><li> Per entrambi i test, le mosche sono sessuato e mantenuti in gruppi di dieci mosche per flaconcino. La differenza di genere sul comportamento è significativo ed è consigliabile non mescolare le mosche maschio e femmina in uno studio di dati potrebbe essere difficile da interpretare e riprodurre 6. </li><li> Per il saggio di geotassi negativo, mosche vengono ordinate in gruppi di dieci per flaconcino e testato un&#39;ora dopo l&#39;anestesia. E &#39;importante per le mosche di recuperare completamente da anestesia in quanto ciò potrebbe avere un effetto sulle attività locomotoria. </li><li> Per il saggio di APS, vola di ogni gruppo vengono inseriti in una fiala vuota polistirolo inumidito con acqua carta da filtro per sei ore prima che il test viene eseguito. Questo assicura che le mosche sono affamati prima che il test e sarà più percettivo al gusto avverse. Poco prima del test viene eseguito, ogni volare da un gruppo di dieci è posto in una provetta vuota centrifuga 15 ml, che sono state limitate in modo impreciso, per evitare la fuga. </li></ul> 4. Geotassi test negativo <ul><li> Geotassi è generalmente misurata per 10-20 gruppi di dieci persone del genotipo stesso o di trattamento (100-200 vola totale per ciascun genotipo / trattamento) 7. Gruppi sorta di dieci mosche di sesso femminile o maschile per un apparato di CO 2 l&#39;anestesia e il luogo di ogni gruppo in un flaconcino a parte. Attendere almeno un&#39;ora per le mosche di recuperare da anestesia. </li><li> Preparare l&#39;apparato arrampicata per ogni gruppo, in modo che due fiale polistirolo vuote sono verticalmente uniti da nastro di fronte all&#39;altra. E &#39;importante assicurarsi che le aperture dei flaconcini sono perfettamente allineati tra loro per fornire una superficie piana di arrampicata per le mosche. </li><li> Per il flacone inferiore, misurare una distanza verticale di 8 cm al di sopra della superficie inferiore e contrassegnare ogni fiala disegnando un cerchio lungo l&#39;intero perimetro del flaconcino. </li><li> Trasferimento di un gruppo di dieci vola nel flacone inferiore attentamente impedire la fuga di una mosca. Coprire immediatamente il flacone inferiore con la fiala superiore e nastro in modo sicuro in prossimità del contatto con aperture. Lasciare le mosche per acclimatarsi alla nuova impostazione per 1 minuto prima di effettuare il test. </li><li> Battere delicatamente la vola verso il fondo del flaconcino e misurare il numero di mosche che possono salire sopra il marchio da 8 cm per 10 secondi dopo il rubinetto. </li><li> Ripetere questo test lo stesso gruppo dieci volte, consentendo periodo di riposo per 1 minuto tra ogni prova. </li><li> Registrare il numero di mosche per ogni gruppo che hanno superato gli 8 cm marchio come unpercentuale totale di mosche. </li></ul> 5. Avversiva fototassi saggio di soppressione (APS Assay) Originariamente adattato da Le Bourg e Buecher (2002) 4, questa analisi sfrutta il comportamento positivo phototactic in treno vola a loro di associarsi luce con stimoli avversi (in questo caso, il gusto amaro del chinino). Dopo una formazione / condizionamento fase, mosche wild-type in grado di associare l&#39;area illuminata con gusto repulsivo e evitarlo. Vola con compromessa capacità di apprendimento non riuscirà a fare questa associazione. Inoltre, il saggio APS può essere utilizzato anche per misurare la memoria a breve termine funzione di mosche 5 sottoponendo già vola addestrati per la stessa prova 6 ore dopo condizionamento per verificare la loro abilità nel ricordare il compito imparato. <ol><li> Preparazione della soluzione di chinino <ul><li> Sciogliere chinina cloridrato in acqua distillata per ottenere una soluzione 0,1 M magazzino (1.98g in 50mL di acqua distillata). Soluzione di riserva possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di un anno in piccole aliquote </li><li> Preparare una soluzione di lavoro di 1 microM diluendo la soluzione madre in acqua distillata. </li></ul></li><li> Preparazione del T-Maze <ul><li> T-labirinto è costituito dalla colonna centrale con la botola e due camere indipendenti, una camera di &quot;dark&quot; e una camera &quot;illuminata&quot; (Figura 1). </li><li> Preparazione Camera: prendere due tubi 15ml centrifuga di plastica e tagliate a 2 ml marchio dal fondo chiuso concluderà con una sega manuale. Montare gli adattatori connettore ad ogni estremità, e sigillare il collegamento con parafilm. L&#39;adattatore alla fine del tubo serve come lo slot di ingresso per la sorgente di luce a collo d&#39;oca. Collegare un tubo con la sorgente di luce e questo tubo sarà la camera &quot;illuminata&quot;. Avvolgere il tubo altre con un foglio di alluminio per fungere da camera &quot;oscura&quot;. </li><li> Aggiungi 180uL o di acqua distillata o di soluzione di chinino per filtrare carta e porre in camera di luce. </li><li> Assemblare la T-labirinto avvitando le camere luminose e scure su ogni lato della colonna centrale, con la botola in mezzo chiuso (Figura 1). </li><li> Inserire la fonte di luce nella camera illuminata. </li></ul></li><li> Formazione vola a sopprimere fototassi con stimoli avversi <ul><li> Svitare la camera oscura dal T-labirinto e trasferire una mosca in questa camera e subito avvitare il tubo di nuovo al buio labirinto. </li><li> Spegnere le luci in sala e accendere la spia rossa. </li><li> Consentire al volo per acclimatare nella camera oscura per 30 secondi e lentamente accendere la fonte di luce illumina la camera illuminata. Aprire lentamente la botola che separa le due camere. </li><li> Se la mosca si dirige verso la camera illuminata entro 10 secondi, è considerato positivamente phototactic ed è pronto per essere addestrato per l&#39;analisi. Fallimento in fototassi indica problemi nel sistema visivo e vola con fototassi negativi devono essere esclusi dal test. </li><li> Per la soppressione avversivo fototassi (APS) la formazione, tocca al volo che ha dimostrato fototassi positivo ritorno alla camera oscura, chiudere la botola e spegnete la luce. Attendere 30 secondi di acclimatazione. Durante questo tempo mettere carta da filtro con una soluzione di chinino nella camera illuminata. Aprire lentamente la botola e accendere la luce. Lasciare che il cammino volare nella camera di chinino rivestito illuminata. Dopo un minuto, toccare il volo di ritorno alla camera oscura e ripetere questo 9 volte di più. (In genere, tipo selvatico vola evitare la camera illuminata dopo 3 o 5 studi di formazione.) </li><li> Immediatamente dopo l&#39;allenamento, cinque studi di prova sarà condotta. In ogni prova, prova, attendere 10 secondi dopo la luce è accesa per il volo addestrati a camminare verso la camera illuminata. Il mancato piedi dalla fiala illuminata sarà registrato come &quot;Pass&quot;, che equivale a &quot;compito appreso attraverso rinforzo&quot;. Il tasso Pass più di cinque prove consecutive viene registrato e mostrato sotto nella figura 2 come PC0 (0 condizionamento post ora). </li></ul></li><li> La valutazione a breve termine funzione di memoria in Flies <ul><li> Dopo una formazione iniziale e PC0 registrazioni, ogni volo è posto di nuovo nella sua fiala cibo originale e tenuti da parte per sei ore. </li><li> Sei ore di formazione post, sottopone ogni volare a 5 studi ancora allo stesso modo di prima, e registrare il numero di volte al volo evita (pass) o va in (non riuscito) il flacone illuminato. Questo tasso di passaggio viene registrato come PC6 (6 ore dopo condizionamento), che è un indicatore della memoria a breve termine. </li></ul></li></ol> 6. Interpretazione dei dati e analisi statistica <ol><li> Geotassi test negativo <ul><li> I dati grezzi generati da questa analisi rappresenta il numero di mosche che attraversano l&#39;8-cm marchio in 10 secondi in ogni gruppo. Convertire questa percentuale e per calcolare il tasso medio di passaggio per ogni gruppo di oltre 10 sessioni. </li><li> Dati sono rappresentati graficamente come un pass rate medio per gruppo (genotipo, trattamento, ecc) con l&#39;errore standard della media (SEM). </li><li> Differenze tra i gruppipuò essere determinata per essere statisticamente significativo o non si utilizza un test t di Student o ANOVA. </li></ul></li><li> Avversiva fototassi Soppressione Assay <ul><li> I dati grezzi di questa analisi è rappresentato come il numero di volte ogni volo evita la camera illuminata in cinque prove successive. Il tasso di passaggio è calcolato come la percentuale di prove evitare di successo nel corso degli studi clinici totale. Calcolare il tasso medio di passare in questo modo per un minimo di 15 mosche per gruppo. </li><li> I dati vengono rappresentati graficamente come il tasso medio di passare PC0 (subito dopo il condizionamento; indicatore di &quot;apprendimento&quot;) o il tasso medio di passare PC6 (6 ore dopo il condizionamento; indicatore &quot;memoria&quot;) con i rispettivi SEM. </li><li> Indici di apprendimento e memoria vengono confrontate tra i gruppi sia di tipo selvatico e &quot;geneticamente manipolati-benigno&quot; gruppo (come la GFP iperespressione di aria) in modo appropriato. </li></ul></li></ol> 7. Rappresentante Risultati In questo esperimento video, stiamo valutando deficit di apprendimento e la memoria e il motore nelle mosche iperespressione umano Tau nel sistema nervoso centrale e confrontando le loro prestazioni a quelle delle mosche overesprimenti GFP. Sovraespressione neuronale del Tau umani in Drosophila ha dimostrato di causare gravi vacuolizzazione nel cervello 8 e portare a significativi deficit di apprendimento e di funzioni di memoria 9. Come mostrato nella Figura 2A, 10 giorni maschio o femmina vola sovraesprimono umano Tau hanno deficit motorio significativo rispetto ai pari età GFP sovraesprimono mosche. Inoltre, queste mosche non associare la luce con gusto amaro come dimostrato dal tasso di PC0 passare rispetto al gruppo di controllo, così come non ricordare questa associazione, come indicato dalla diminuzione del tasso di passaggio PC6 (Figura 2B). Questo esperimento conferma ulteriormente che i modelli di Drosophila possono essere usati per studiare le malattie neurodegenerative umane e ricapitola alcuni dei fenotipi comportamentali osservati negli esseri umani e mammiferi. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. T-Maze di installazione per analisi avversivo Soppressione fototassi. A. L&#39;impostazione generale sperimentale per l&#39;esperimento APSA con la sorgente luminosa collegata al tubo &quot;illuminato&quot; falco, foderato con carta da filtro e il tubo &quot;dark&quot; a sinistra (coperto in fogli), separati da una botola. B. Durante la fase di test e allenamenti, la mosca è nella camera oscura e la botola aperta dopo la luce è accesa nella camera illuminata. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Risultati rappresentativi dal geotassi negativo e sperimentare APS con iperespressione di mosche GFP o Tau con un pan-neuronale driver. A. Nel test geotassi negativo, 10 giorni di età maschile (colonna blu) o femmina (colonna rossa) vola sovraesprimono GFP ha mostrato una maggiore attività di arrampicata di Tau-sovraesprimono mosche. B. di 20 giorni vecchia femmina vola iperespressione GFP ha mostrato una migliore apprendimento (PC0) e memoria (PC6) le funzioni di Tau iperespressione di mosche.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Sia geotassi negativo e saggi APS sono robusti test comportamentali per misurare le variazioni locomotore o di apprendimento e capacità di memoria derivanti da manipolazioni genetiche o ambientali. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi di questi saggi che attendono un&#39;ulteriore ottimizzazione. Nel saggio geotassi negativo, le mutazioni in alcuni geni può rendere gravi disfunzioni motorie nelle mosche. In tali casi, le mosche difficilmente può scalare i muri, in risposta alla forza di gravità su agitazione. Saggi di altro comportamento che, direttamente misurare il movimento può essere più appropriato. Questi test includono il comportamento riflesso di raddrizzamento che misura la paralisi e il sequestro 10, e il comportamento optomotor 11 che registra la perdita di coordinazione motoria. Nel saggio APS, l&#39;ostacolo prima può essere vola a caso fermarsi all&#39;ingresso della camera illuminata, senza andare avanti. Questo diventa più un problema se l&#39;invecchiamento è una delle condizioni studiate, dal momento che vola più anziani sono meno attivi in ​​generale e tendono a fermarsi e riposare per lunghi periodi di tempo. In questo caso lo sperimentatore deve fornire stimoli meccanici di promuovere la libera, che non è sempre efficace. In secondo luogo, si potrebbe sostenere che la mancata andare ai risultati camera illuminata da una perdita di fototassi positivo. Questo è raramente il caso, in quanto il lavoro precedente ha mostrato che vola tornare indietro alla capacità di risposta luce una volta che il negativo rafforzare viene rimosso 4. In terzo luogo, la durata del contatto con lo stimolo avversivo può variare da prova a prova. Questa variazione di solito può essere ridotto circonda la parete interna della camera con carta da filtro imbevuto di prevenire vola da evitare il chinino. Inoltre, lo sperimentatore può garantire che ogni volo passano abbastanza tempo a contatto con la carta da filtro, aumentando la quantità di tempo trascorso nella camera da diversamente specificato 1 minuto. In sintesi, geotassi negativo e saggi APS sono modi veloci e semplici per valutare deficit comportamentali e quantitativamente indicare locomotore e di apprendimento e le capacità di memoria in Drosophila. Questi test sono particolarmente utili nella modellazione umana malattie neurodegenerative in Drosophila.

<table border="1"><tbody><tr><th> Materiale </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commento </th></tr><tr><td> Polistirolo Vial </td><td> Vial Campidoglio, Inc. </td><td> 28Fly </td><td> 28,5 x 95 Vial polistirolo mm, qualità dei materiali importanti, male se troppo scivoloso per le mosche a salire. </td></tr><tr><td> Dissezione stereoscopio </td><td> Zeiss </td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2 filiali a collo d&#39;oca guida di luce (12V/30W) </td></tr><tr><td> Chinino cloridrato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 6119-47-7 </td><td> Sciogliere in acqua distillata. </td></tr><tr><td> Quick Disconnect Connettori </td><td> Nalgene (VWR) </td><td> 62868-021 </td><td> Polietilene ad alta densità </td></tr><tr><td> T-Maze </td><td> Semplici sistemi comportamentali </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Singolo canale 200 microlitri pipetta </td><td> Eppendorf </td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying locomotor, learning, and memory deficits in drosophila models of neurodegeneration

I progressi nei metodi di genetica hanno permesso lo studio dei geni coinvolti in malattie neurodegenerative umane utilizzando Drosophila come sistema modello 1. La maggior parte di queste malattie, tra cui l&#39;Alzheimer, il Parkinson e la malattia di Huntington sono caratterizzati da età-dipendente deterioramento delle funzioni di apprendimento e memoria e coordinazione motoria 2. Qui usiamo test comportamentali, tra cui il test negativo geotassi 3 e il test di soppressione phototaxic avversivo (APS test) 4,5, per mostrare che alcune delle caratteristiche di comportamento associato neurodegenerazione umana può essere riassunta nelle mosche. Nel test geotassi negativo, la tendenza naturale di mosche a muoversi contro la gravità, quando agitato è utilizzata per studiare i geni o le condizioni che possono ostacolare la capacità locomotoria. Nel saggio APS, le funzioni di apprendimento e la memoria sono testati in modo positivo-phototactic vola addestrati per associare la luce con gusto amaro avverso e, quindi, evitare questa tendenza altrimenti naturale a muoversi verso la luce. Test questi addestrati vola 6 ore dopo la formazione è utilizzata per valutare le funzioni di memoria. L&#39;utilizzo di questi saggi, il contributo di fattori genetici o ambientali verso lo sviluppo di neurodegenerazione può essere facilmente studiato in mosche.

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Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Test per misurare il comportamento delle funzioni locomotore, apprendimento, memoria e abilità in<em&gt; Drosophila</em&gt;.

Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

assaying-locomotor-learning-memory-deficits-drosophila-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

33.2K Views.  University of Miami, Miller School of Medicine. Test per misurare il comportamento delle funzioni locomotore, apprendimento, memoria e abilità in Drosophila.

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Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Saggio attività locomotoria per studiare ritmi circadiani del sonno e parametri in Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Ricerca

Neuroscienze

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer&#39;s Disease Model Mice

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including acquisition of spatial memoryand long-term spatial memory 1. The MWM is a relatively simple procedure typically consisting of six day trials, the main advantage being the differentiation between the spatial (hidden-platform) and non-spatial (visible platform) conditions 2-4. In addition, the MWM testing environment reduces odor trail interference 5. This has led the task to be used extensively in the study of the neurobiology and neuropharmacology of spatial learning and memory. The MWM plays an important role in the validation of rodent models for neurocognitive disorders such as Alzheimer&#x2019;s Disease 6, 7. In this protocol we discussed the typical procedure of MWM for testing learning and memory and data analysis commonly used in Alzheimer&#x2019;s disease transgenic model mice.

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer&#039;s Disease Model Mice

The Morris Water Maze is a behavioral task to test hippocampal-dependent learning and memory. It has been widely used in the study of neurobiology, neuropharmacology and neurocognitive disorders in rodent models.

Morris Maze prova d&#39;acqua per deficit di apprendimento e memoria in topi modello della malattia di Alzheimer

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

Registrazione ottica di attività neurale suprathreshold con risoluzione singola cellula e single-picco

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinazione del locomotore attività spontanea in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

Valutare l&#39;apprendimento spaziale e la memoria in piccoli rettili squamate

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Condizionamento del corteggiamento di Drosophila come misura dell&#39;apprendimento e della memoria

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...