Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (AG023088 a BR).

Nota: Il ceppo Canton-S è la linea di fondo wild-type standard ottenuta da Bloomington Stock Center. 1. Preparazione Cibi e Ricetta per 1.000 ml di Alimenti Nota: Questa sezione descrive il protocollo per la preparazione dei cibi. Grandi vasi metallici sono usati per preparare circa 18 L di cibo alla volta. Il protocollo qui descritto viene ridimensionato e utilizza 1.000 ml H 2 O. Il cibo è autoclavato due volte. <ol><li> Mescolare 113 g di saccarosio e 28 g di lievito di birra in 643 ml di acqua. Lasciare gli ingredienti su una serie piastra calda a 25 ° C con una ancoretta mescolare tutto per 15 minuti. </li><li> Soluzione cibo autoclave per 20 min. </li><li> Mescolare 49 g di farina di mais e 8,1 g di agar-agar in 268 ml di acqua e aggiungere alla miscela di cibo autoclavato descritto al punto 1.2. Mescolare bene con un cucchiaio o una frusta. </li><li> Autoclave miscela cibo per altri 20 min. </li><li> Mettere il cibo in un piatto e lasciate raffreddare con miscelazione costante con un ancoretta. Iof ulteriori soluzioni devono essere aggiunti agli alimenti, come il mifepristone (RU486), mantenere il cibo in un piatto caldo istituito a 60 ° C e aggiungere la soluzione quando il cibo raggiunge la temperatura desiderata. </li><li> Sciogliere 2.4 g tegosept in 10,7 ml 100% EtOH e mantenere su un piatto freddo con un agitatore per sciogliere completamente e miscelare per circa 15 min. </li><li> Aggiungere la soluzione tegosept al cibo quando la temperatura del cibo è 60 ° C e miscelare bene. </li><li> Utilizzare una pompa o un dosatore di mangime per versare circa 10 ml di cibo in un&#39;ampia flaconcino. Utilizzando un dispenser cibo si può versare alimentare simultaneamente in 100 ampi, fiale di plastica (1 vassoio) alla volta. </li><li> Coprire i flaconcini con Kimwipes e telo e lasciare il cibo a temperatura ambiente per 12-24 ore a raffreddare. Conservare il cibo a 4 ° C ed utilizzare entro 3-4 settimane. Riscaldare il cibo a temperatura ambiente prima dell&#39;uso per il lavoro mosca. </li></ol> 2. Preparazione di fiale di vetro <ol><li> Preparare il cibo secondo il protocollo elencato nel passaggio 1. </li&gt; <li> Aliquota 5 ml di cibo in ogni stretta, fiala di vetro, che è la dimensione giusta per i monitor della popolazione. Questa quantità di cibo dovrebbe essere sufficientemente basso da essere sotto l&#39;anello più basso del monitor popolazione. </li><li> Dopo il cibo si raffredda fino a temperatura ambiente coprire le fiale con tappi spugna sé a 4 ° C per 2 settimane. Poiché la quantità di cibo in un flaconcino è piuttosto bassa, è meglio usare il cibo entro una settimana o due per evitare l&#39;essiccazione. </li><li> Riscaldare le fiale a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li></ol> 3. Manutenzione delle mosche genitori <ol><li> Far crescere le mosche in fiale di plastica larghe con prodotti alimentari di laboratorio standard e di conservare le fiale in una umidificata, camera ambientale a temperatura controllata a 25 ° C su una 12 ore di luce / buio ciclo. Il periodo di luce diurna inizia alle 06:00 in questo laboratorio. </li><li> In mattinata chiara adulto vola dai flaconi da cui verranno raccolti mosche parentali. </li><li> Raccogliere flie nuova ecloseds e separarli per sesso su un tappetino di CO 2 entro 8 ore dopo eclosion per assicurarsi che le mosche femminili sono vergini. Le mosche iniziano ad accoppiarsi 8 ore dopo eclosion. </li><li> Quando le mosche maschio e femmina vergine sono tra 5 e 10 giorni di età, mettere 10 maschi e 10 femmine mosche in un flaconcino con cibo standard e diversi granelli di lievito attivo sulla parte superiore. Nota: controllare la densità delle larve utilizzando lo stesso numero di mosche e tenerli in una fiala per due giorni. Aggiunta di lievito attivo favorisce la produzione di uova. </li><li> Mantenere in linea per accoppiarsi e deporre le uova in una camera climatica a temperatura controllata a 25 ° C con 12 ore di luce / buio ciclo per 2 giorni. Impostare 5-10 fiale di mosche genitori. </li><li> Passare in linea per un nuovo flacone di plastica ogni altro giorno e mantenere le fiale con le uova in un incubatore a 25 ° C. </li></ol> 4. Raccolta di mosche sperimentali <ol><li> Dopo nove giorni in linea inizieranno a Eclose dai flaconi dove il parentaL mosche uova (di cui al punto 3.6.) previste. Chiaro e scartare le mosche che eclosed durante il primo giorno e ritorno le fiale da incubatrice. La maggior parte delle mosche eclosed il giorno 1 sono femmine. Una popolazione più sincronizzata delle mosche si Eclose il giorno 2. </li><li> Entro 24 ore posto in linea di nuova eclosed di CO 2 pad e raccogliere 25 maschili e 25 femminili in linea per flaconi con un pennello o un cucchiaio di metallo. Tenere mosche sulla CO 2 pastiglie per un breve periodo di tempo per ridurre al minimo gli effetti di CO 2. Annotare il giorno della eclosion sul flacone. Montare almeno 5 flaconi replicati a fini sperimentali o per gruppi di controllo. </li><li> Tenere i flaconcini in camere climatiche a temperatura controllata a 25 ° C con 12 ore di luce / buio ciclo. </li><li> Passare in linea per un nuovo flacone di plastica ogni altro giorno usando un imbuto. </li><li> Età linea fino a raggiungere l&#39;età desiderata per la sperimentazione. </li></ol> 5. Impostazione dei monitor di mobilità <ol><li> Posizionare ildella popolazione controlla in un incubatore a temperatura controllata. </li><li> Collegare ogni monitor con un cavo telefonico a 4 fili per l&#39;unità di interfaccia di alimentazione (PSIU) via splitter 5-vie (multilinea), che possono collegare fino a cinque monitor individuali per una apertura nel PSIU. Vedere le Figure 1A e 2B. </li><li> Collegare il PSIU ad una presa di corrente di linea (100-240 V). Collegare il connettore di uscita dell&#39;alimentatore in una delle prese PSIU 2 di accoppiamento. La luce verde adiacente si illumina di verde quando è collegato correttamente. </li><li> Collegare il PSIU all&#39;hardware (USB) Universal Serial Bus. Collegare il cavo USB tra l&#39;hardware USB con un Macintosh o un PC Windows per la registrazione dei dati. Sarebbe meglio avere un computer dedicato solo per la raccolta dei dati, poiché la raccolta funziona per giorni alla volta. </li><li> Scaricare il software USB (PSIUdrivers.zip). Software del driver USB viene utilizzato dall&#39;interfaccia alimentazione e deve essere scaricato solo una volta. Si sintetizza uncollegamento dati tra il programma di computer e monitor PSIU / attività. Per un uso PC una porta COM e per un Macintosh utilizzano una porta seriale semplice. </li><li> Scarica il programma informatico per Macintosh OSX (Intel) o per PC Windows (XP/Vista/7) Programmi seguendo le istruzioni fornite dal fabbricante Notes 308.pdf. </li><li> Avviare il programma di computer e impostare il programma cliccando sulle preferenze, luci e monitor. Il programma verrà eseguito fino a quando l&#39;utente seleziona &quot;quit&quot; per fermare il programma. Se il programma del computer o il computer è spento il monitor continuerà a contare le interruzioni del fascio, ma i conti non saranno registrati fino a quando il programma viene rilanciato. In questo caso la prima lettura comprenderà tutti i conteggi dall&#39;ultima volta l&#39;PSIU inviato i dati al computer. </li><li> Selezionare la scheda Preferenze e selezionare la porta seriale, PSIU per Macintosh e COM per il PC. </li><li> Selezionare l&#39;intervallo di lettura che va da pochi secondi, minuti o un&#39;ora. </li> &lt;li&gt; Seleziona i monitor: Ogni monitor dispone di un numero unico che viene dato dal produttore. Selezionare l&#39;intervallo di monitor che corrisponde ai numeri riportati ai monitor dal costruttore. </li><li> La scatola Lights: Assicurarsi che tutti i monitor siano collegati correttamente, che è contrassegnato da una luce verde accanto al numero di monitor sul software. Una luce rossa indica che la connessione è persa, e una scatola nera indica che il sistema è spento o non correttamente configurato. </li></ol> 6. Impostazione dell&#39;esperimento <ol><li> Rimuovere le fiale di vetro contenenti alimenti da 4 ° C e lasciare al caldo a temperatura ambiente. </li><li> Separare le mosche maschio e femmina della stessa età sulle emissioni di CO 2 pad. Per gli studi di invecchiamento è possibile iniziare gli studi di mobilità fin da 3 giorni di età. </li><li> Mettere 10 maschile o 10 mosche femmine in ogni fiala di vetro contenente cibo. Utilizzare almeno tre fiale per ogni linea sperimentale e di controllo delle mosche e per ogni genere. </li><li> Tenere il vials dalla loro parte fino in linea recuperano da CO 2 al fine di garantire le mosche non rimanere bloccati nel cibo. Mosche separate a circa 8:00 e lasciare per circa 2 ore a temperatura ambiente per recuperare da CO 2. </li><li> Porre i flaconi all&#39;interno dei monitor popolazione alloggiati nelle incubatrici. </li><li> Eliminare i dati raccolti entro le prime 24 ore dopo le mosche sono messi in incubatrice per far loro adattarsi al nuovo ambiente. </li><li> Passare linea dopo 3 o 4 giorni per nuovi flaconi per evitare l&#39;essiccamento del cibo. Se le mosche sono inclini a morte o sono l&#39;età 40 giorni o più, passare le mosche dopo 2 giorni e utilizzare i dati raccolti per giorno 2. Inoltre, utilizzare più di tre fiale per gruppo per garantire repliche adeguate. I dati provenienti da fiale con mosche morte deve essere ignorata e non inclusi nell&#39;analisi. </li></ol> 7. Esecuzione dei monitor di attività e calcolo del Total attività spontanea <ol><li> Selezionare le preferenze - l&#39;intervallo per la raccolta dei dati &lt;.br /&gt; Nota: Il programma informatico permette la raccolta dei dati a intervalli che vanno da 1 secondo a 60 minuti. 10 e 30 periodi minuti sono stati trovati a fornire informazioni adeguate sulla mobilità senza avere un numero enorme di punti temporali. Al periodo di tempo selezionato, il programma invierà il conteggio totale corrente per ogni monitor al computer e cominciare a contare di nuovo da zero. Il programma per computer memorizza i dati in una nuova cartella creata dal sistema dati informatici. I dati raccolti in ogni monitor vengono memorizzate separatamente, e documenti di testo individuali vengono creati per ogni flacone. I dati raccolti vengono continuamente fino a quando il programma opera. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, la scansione dei dati utilizzando la FileScan110X per Macintosh OSX (Intel) o SystemMB108 per il programma PC Windows (XP/Vista/7). Nota: Il programma Scan elimina le letture duplicate e fa in modo che le registrazioni sono complete. </li><li> Salvare i dati raccolti in un tempo specifico e periodo di giorni. Scegliere un nome sperimentale e copiare i file dalla cartella dati del computer per l&#39;analisi. Nota: A questo punto, gli intervalli di attività possono essere modificati e convertiti in altri differenti. I dati originali rimarranno memorizzati nella cartella dei dati del computer e possono essere recuperati fino a quando non vengono eliminati. </li></ol> 8. Analisi dei dati <ol><li> Copiare i dati raccolti nelle file di testo in colonne di fogli di calcolo Excel per l&#39;analisi dei dati. I dati raccolti da questo software sono in colonne che contengono numeri che rappresentano attività totale in un unico monitor per un periodo di tempo selezionato dallo sperimentatore. Nota: I dati raccolti per ogni monitor sono in file di testo separati. Ci sono 32 colonne per ogni monitor. Le prime sei colonne sono vuote e contengono solo 0; prossimi tre contengono i dati raccolti presso l&#39;anello inferiore, al centro, e l&#39;anello superiore. Il resto dei canali può essere eliminato in quanto non contengono dati. Ogni anello emette ununico valore per volta. Vedi schermata dei dati grezzi in figura 2. </li><li> Calcolare l&#39;attività totale entro un periodo di tempo desiderato per ogni monitor che rappresenta la somma delle attività di raccolta a tre diverse altezze di raggi infrarossi. Nota: Il periodo di tempo può variare da alcune ore, 24 ore o diversi giorni. </li><li> Determinare l&#39;attività locomotoria media e la deviazione standard tra i 3 monitor che rappresentano tre repliche biologiche. Nota: I dati possono essere analizzati per la significatività statistica utilizzando una serie di test. T-test di studenti a due code, una analisi a senso unico della varianza (ANOVA) e un test post-hoc Tukey HSD potrebbero essere utilizzati per determinare gli effetti di diverse manipolazioni ambientali o genetici su 24 ore di attività locomotoria spontanea 16. Ci sono un certo numero di altri programmi che possono essere utilizzati e sono stati pubblicati in precedenza 17. </li></ol>

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Attività locomotoria spontanea di mosche è influenzato da molti fattori quali l&#39;età, background genetico, e di genere 2,13,18,19. Inoltre, fattori ambientali come il contenuto calorico del cibo, temperatura dell&#39;ambiente, l&#39;aggiunta di diversi farmaci, e il giorno / notte ciclo di luce possono influenzare l&#39;attività mosca. Per esempio, mosche maschio della stessa età hanno una maggiore attività fisica spontanea rispetto alle femmine (Figura 1). Pertanto, in linea della s...

Moscerini della frutta, Drosophila melanogaster, sono stati utilizzati come organismo modello prezioso per studiare i meccanismi alla base di comportamenti complessi, quali l&#39;apprendimento e la memoria, l&#39;interazione sociale, l&#39;aggressività, abuso di droghe, il sonno, la funzione sensoriale, corteggiamento e accoppiamento 1,2. Un comportamento che è stato studiato attraverso molteplici protocolli è l&#39;attività locomotoria spontanea. Geotassi negativo è stato uno dei primi metodi sviluppati per la misurazione dell&#39;attività Drosophila, e questo protocollo prevede la misura la percentuale di mosche che raggiungono una certa altezza del flaconcino dopo linea fu scossa al fondo del contenitore 1,3. Questo metodo presenta i vantaggi di essere semplice, poco costoso, e poiché non richiede particolari attrezzature può essere eseguita in qualsiasi laboratorio. E &#39;stato usato come strumento di screening prezioso per studiare gli effetti di differenti manipolazioni genetiche su fly mobilità 3. Tuttavia, è tempo e lavoro ad alta intensità dind ha la possibilità di bias dovuto alla variabile agitazione delle fiale e registrazioni umani. Il metodo geotassi negativo è stato migliorato dallo sviluppo del metodo iterativo Rapid Negative geotassi (RING) 4,5, che prende fotografie delle fiale fly seguenti agitazione delle mosche verso il basso. Il vantaggio di questo protocollo è la sua sensibilità e la possibilità di testare un gran numero di fiale mosca allo stesso tempo. Tuttavia, questo protocollo ha ancora la possibilità di errore umano, e misura solo geotassi negativi. Altri laboratori hanno utilizzato la semplice osservazione in flaconi di coltura per determinare l&#39;attività locomotoria 6. Recentemente sono stati sviluppati diversi sistemi di registrazione video per la misurazione dell&#39;attività locomotoria mosca. Un protocollo di monitoraggio video fornisce tempo per la regolazione prima della registrazione 7. Il metodo descritto da Slawson et al. Utilizza anche un impulso d&#39;aria per fermare movement fino all&#39;inizio della registrazione, che potrebbe essere un fattore di stress agli animali 7. Questo metodo fornisce informazioni sulla velocità media, velocità massima, tempo trascorso in movimento, ecc Un altro sistema di inseguimento tridimensionale misura la velocità massima dei singoli mosche durante ~ 0,2 secondi di libera decollo volo 8. Un protocollo di monitoraggio video tridimensionale utilizza mosche che esprimono GFP e più telecamere dotate di filtri che consentono la rilevazione della fluorescenza per determinare mosca mobilità 9. Mosche in questo protocollo tendono a mostrare modelli ponti cilindrici, che è potenzialmente a causa della forma della cultura Drosophila fiale 10. Questo metodo è stato migliorato utilizzando una cupola che permette di misurare movimento spontaneo di due mosche 11. Un metodo ad alta velocità che utilizza una telecamera per monitorare e quantificare il comportamento individuale e sociale di Drosophila automaticamente è stato anche descritto 12. Zou etal. ha sviluppato un sistema di monitoraggio comportamentale (BMS) che utilizza due telecamere assistita da computer per registrare il comportamento a vita e movimenti come riposo, in movimento, volare, mangiare, bere, o morti di frutta tephritid individuale mosche 13. Diversi altri sistemi video sono stati sviluppati per monitorare l&#39;attività fly comportamentale 14,15. Qui si descrive un metodo per quantificare l&#39;attività Drosophila che utilizza i monitor della popolazione. Questi monitor sono alloggiati in locali e incubatori umidità controllata a 25 ° C su un ciclo di 12 ore di luce giorno-notte. Ogni monitor popolazione ha raggi infrarossi collocati in anelli posizionabile a tre diverse altezze. Ogni volta che una mosca si muove attraverso gli anelli si interrompe il fascio infrarosso, che viene registrato da un microprocessore che, indipendentemente atti e conta delle attività di linea all&#39;interno della fiala. Un microprocessore carica l&#39;attività totale nel flaconcino al computer a interva definita dall&#39;utentels che potrebbero variare da 1 secondo a 60 minuti. Il metodo qui descritto prevede ampio spazio per le mosche si adeguino al nuovo ambiente e consente la misurazione simultanea dell&#39;attività locomotoria spontanea di ben 120 popolazioni di mosche. Inoltre, si descrive la preparazione del cibo, voliamo manutenzione, l&#39;impostazione dei monitor popolazione di mobilità in incubatori a temperatura controllata, e potenziali fattori che potrebbero influenzare i risultati. Questo metodo può essere usato per studiare come diverse modificazioni ambientali o genetici influenzano l&#39;attività locomotoria spontanea delle mosche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose FCC Food Grade 100 LB,</td>
			<td>Fisher Scientific MP Biomedicals</td>
			<td>ICN90471380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brewer&#8217;s Yeast</td>
			<td>Fisher Scientific MP Biomedicals</td>
			<td>ICN90331280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Agar Fine</td>
			<td>SciMart</td>
			<td>DR-820-25F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal</td>
			<td>Fisher Scientific MP Biomedicals</td>
			<td>ICN90141125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H5501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10140001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly CO2 pad</td>
			<td>LabScientific</td>
			<td>BGSU-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila carbon dioxide (CO2) tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paint brush for pushing the flies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shell vial wide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>AS519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buzzplugs for wide plastic vials</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>AS275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (25x95mm)</td>
			<td>Fischer Scientific Kimble 60931-8</td>
			<td>AS-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge plugs for glass vials</td>
			<td>SciMart</td>
			<td>DR-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Food Dispenser</td>
			<td>Applied Scientific (Fischer Scientific)</td>
			<td>AS780Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPM Drosophila Population Monitor</td>
			<td>Trikinetics Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Power Supply with line cord</td>
			<td>Trikinetics Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSIU9 The Power Supply Interface Unit</td>
			<td>Trikinetics Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telephone cables and 5 way splitters</td>
			<td>Trikinetics Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Serial Bus (USB) hardware</td>
			<td>Trikinetics Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macintosh or Windows PC with UCB port</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel)</td>
			<td>www.trikinetics.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7)</td>
			<td>www.trikinetics.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMFileScan108X software for Macintosh</td>
			<td>www.trikinetics.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7)</td>
			<td>www.trikinetics.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB software (PSIUdrivers.zip)</td>
			<td>www.trikinetics.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMSystem Notes 308</td>
			<td><a href="http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf">(http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the spontaneous locomotor activity in drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster è stato utilizzato come un ottimo organismo modello per studiare le manipolazioni ambientali e genetici che influenzano il comportamento. Un tale comportamento è l&#39;attività locomotoria spontanea. Qui si descrive il protocollo che utilizza monitor popolazione Drosophila e un sistema di monitoraggio che consente il monitoraggio continuo dell&#39;attività locomotoria spontanea di linea per diversi giorni alla volta. Questo metodo è semplice, affidabile e obiettivo e può essere utilizzato per esaminare gli effetti dell&#39;invecchiamento, sesso, variazioni nel contenuto calorico degli alimenti, aggiunta di farmaci o manipolazioni genetiche che mimano malattie umane.

<html> L&#39;attività locomotoria spontanea in Drosophila dipende fly genere (Figura 3A), il contenuto calorico del cibo (Figura 3B) e il ciclo luce / buio. Una volta che la luce è spenta attività mosca diminuisce drasticamente. Figura 3A mostra 24 ore di registrazioni di attività locomotoria di mosche maschili e femminili. Un asterisco sul asse x segna il momento in cui la luce era spenta e la transizione al ciclo di buio. Figura 3B illustr...

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Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster sono utili per studiare le manipolazioni genetiche o ambientali che influenzano i comportamenti come l&#39;attività locomotoria spontanea. Qui si descrive un protocollo che utilizza il monitor con raggi infrarossi e software di analisi dei dati per quantificare l&#39;attività locomotoria spontanea.

Determinazione del locomotore attività spontanea in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

determination-spontaneous-locomotor-activity-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

12.6K Views.  University of Connecticut Health Center.  Drosophila melanogaster sono utili per studiare le manipolazioni genetiche o ambientali che influenzano i comportamenti come l'attività locomotoria spontanea. Qui si descrive un protocollo che utilizza il monitor con raggi infrarossi e software di analisi dei dati per quantificare l'attività locomotoria spontanea. 

Video: Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Ricerca

Neuroscienze

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Saggio attività locomotoria per studiare ritmi circadiani del sonno e parametri in Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Assay Semplice per la quantificazione della Social Prevenzione in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Condizioni che influiscono spazio sociale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Un test comportamentale per Mechanosensation di cloni in marcm-based<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...