Noi riconosciamo il sostegno della Facoltà di Scienze Informatica e Facoltà di Scienze, Agricoltura e Ingegneria dell&#39;Università di Newcastle, da parte dell&#39;Università di Ulm, e dal SciMedia Ltd (Tokyo, Giappone).

1. Preparazione del Sistema Nervoso Granchio Stomatogastric Adulto Cancer pagurus L. sono stati ottenuti da fonti locali (Università di Newcastle, Colomba Marine Laboratories) e tenuti in filtrata, l&#39;acqua di mare aerata (10 - 12 ° C). Gli animali sono stati anestetizzati da imballaggio in ghiaccio per 20 - 40 min prima della dissezione. Abbiamo utilizzato sistemi isolati stomatogastric nervoso (STNS) 1. Il STNS è stato immobilizzato in un silicone elastomero alberato (ELASTOSIL RT-601, Wacker, Monaco, Germania) piastra di Petri e continuamente superfused (7 - 12 ml / min) con soluzione fisiologica fredda (10-13 ° C). Soluzione fisiologica composta da (mmol * l-1): NaCl, 440; MgCl 2, 26; CaCl 2, 13; KCl, 11; trisma di base, 10; acido maleico, 5. Saline è stato mantenuto a una temperatura costante di 11 - 13 ° C ed a pH 7,4-7,6. La procedura dettagliata della dissezione STNS e preparazione, tra cui il desheathing del ganglio stomatoastric (STG), sono presentati in questo articolo JOVE da Guttierez e Grashow 1. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con la Direttiva Europea Comunità del Consiglio ° 24 novembre 1986 (86/609/CEE). La figura 1A mostra un diagramma schematico del STNS e Figura 1B mostra un tipico STG desheathed abbia la neuroni disposti a semicerchio pianeggiante nella parte posteriore del ganglio. La piastra di Petri con il STNS è fissato alla piattaforma operativa del microscopio imaging (BW51 WI, Olympus, Tokyo, Giappone) con il pongo. Sia la fase di microscopio e il microscopio sono montate su una tavola vibrante isolato (Scientifica, Uckfield, Regno Unito) per evitare artefatti da movimento durante la registrazione ottica. Gli schemi motori generato nel ganglio stomatogastric (STG) sono monitorati con registrazioni extracellulari 2-4. Questo viene fatto attraverso i seguenti passi: <ol><li> Un compartimento vaselina a base cilindrica è costruito attorno a una sezione del nervo motore principale (LVN) per isolare elettricamente il nervo dal bagno (questo viene fatto sul palco dissezione prima scatola di Petri è posta sulla piattaforma operativa del microscopio di imaging ). </li><li> Uno dei due cavi in ​​acciaio inossidabile elettrodo viene posto in questo comparto, l&#39;altra nella vasca da bagno come un elettrodo di riferimento. </li><li> Il segnale differenziale viene registrato, filtrato e amplificato con un amplificatore differenziale AC (Univ. Kaiserslautern, Germania). </li><li> L&#39;attività motoria del ganglio è controllata mediante un oscilloscopio (DL708E, Yokogawa, Tokyo, Giappone) ed è inoltre registrata usando una scheda di acquisizione dati (Power CED, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) e il Spike 2 v6.10 software (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). I file vengono analizzati utilizzando Spike 2 v6.10 (Electronic Design a Cambridge, Cambridge, UK). </li></ol> 2. Preparazione della soluzione colorante Abbiamo usato la tensione fluorescente sensibile colorante Di-8-ANEPPQ (Bioscience Cambridge) 5, che ha una doppia carica positiva che facilita il caricamento del colorante attraverso microelettrodi utilizzando positivi impulsi di corrente. La soluzione colorante deve essere protetto dalla luce quanto più possibile. La soluzione colorante si prepara come segue: <ol><li> 5 mg di colorante è mescolato con 1 ml di F-127 acido Pluronic in DMSO (Invitrogen) soluzione. </li><li> Il flacone di plastica contenente il colorante dissolto è centrifugato per 20 minuti a 12.000 rotazione / minuto in un Microcentrifuga Sigma 1-14 (Sigma, Osterode, Germania) al fine di separare le particelle del colorante più grande che può intasare il microelettrodo. </li><li> Il supernatante (top 200 mL) della soluzione colorante è separato mediante una pipetta e memorizzati in un flaconcino di plastica separato. Entrambi i flaconi sono avvolti in carta stagnola per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> La soluzione colorante è congelato a -20 ° C. </li><li> Prima di usare la soluzione colorante è fuso ponendo la provetta chiusa e avvolta nel caldo (25 ° C) per 10-15 minuti. </li></ol> 3. Colorante di caricamento mediante iniezione intracellulare mediante microelettrodi Sharp Abbiamo usato microelettrodi forte per caricare i neuroni con il colorante. Per controllare il carico colorante usiamo il sistema di imaging MiCAM02 (SciMedia, Tokyo, Giappone) 6. Il sistema di imaging è dotato di due telecamere CCD: la fotocamera HR ha un chip sensore più grande (6,4 mm x 4,8 mm) che fornisce una migliore risoluzione spaziale con la migliore risoluzione temporale è 1,4 ms, la fotocamera HS è una più piccola (2,9 mm x 2,1 millimetri), ma più veloce chip del sensore consentendo una più rapida immagini aventi 0,7 ms come la sua migliore risoluzione temporale. Le fasi del carico colorante sono i seguenti: <ol><li> Microelettrodi sono tirati con un P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) estrattore elettrodo con 10 cm di lunghezza, 1 mm di diametro esterno tubi di vetro con filamento (GB100TF 8P, Prodotti Scienza, Hofheim, Germania). Gli elettrodi sono tirati per avere una resistenza algamma di 25-40 MOhm in 3M KCl (appropriato per le impostazioni dei parametri tirando seguire il libro di cucina pipetta fornita dal creatore del estrattore elettrodo). </li><li> La soluzione colorante congelato è fuso e una quantità molto piccola di essa viene aspirata in un ago Microfil (Microfil - 34G, strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL, USA) - il colorante aspirato riempie intorno ° 2 / 3 del l&#39;ago Microfil . </li><li> La soluzione colorante in Microfil l&#39;ago viene iniettato nella punta di un microelettrodo. Il microelettrodo è posto in una scatola scura per 15 minuti. </li><li> Il microelettrodo è riempito con una soluzione 3M KCl. L&#39;elettrodo viene posto nuovamente dentro una scatola buia stoccaggio elettrodo per altri 10-20 minuti per consentire la soluzione di colorante per raggiungere la punta fine dell&#39;elettrodo per l&#39;aspirazione della forza capillare che agiscono in microelettrodo. </li><li> Il microelettrodo pronto viene inserito in un portaelettrodo e fissato sul headstage dell&#39;amplificatore intracellulare (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, USA). </li><li> L&#39;amplificatore intracellulare è collegato alla scheda di acquisizione dati che fornisce un impulso per guidare impulsi di corrente nel microelettrodo. </li><li> Il microelettrodo è posta delicatamente nella membrana di un neurone STG utilizzando un manipolatore microelettrodo (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, UK). Dal momento che la distanza di lavoro dell&#39;obiettivo 10x (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 millimetri; Olympus Corporation, Tokyo, Giappone) del microscopio di imaging è molto piccolo, il microelettrodo deve essere posizionato in posizione obliqua (circa 30 °) e il movimento del microelettrodo nella giusta posizione richiede diversi passaggi di riorientamento del microscopio e l&#39;obiettivo di spostare il microelettrodo. Per avviare il microelettrodo viene spostato in una posizione tale che la sua punta è superiore alla STG. L&#39;obiettivo microscopio si abbassa fino alla punta dell&#39;elettrodo appare a fuoco. Poi si abbassa ulteriormente, ma non così tanto da toccare il microelettrodo. Il microelettrodo si abbassa fino a che non riappare nel fuoco dell&#39;obiettivo. Questi passaggi si ripetono fino a quando i neuroni appaiono chiaramente nel piano di messa a fuoco dell&#39;obiettivo. Poi il microelettrodo si abbassa fino a che tocca e penetra delicatamente la membrana del neurone STG selezionato. Questo è controllata mediante l&#39;oscilloscopio. </li><li> L&#39;elettrodo intracellulare è usato per registrare l&#39;attività del neurone STG selezionati al fine di individuare il neurone dato il suo profilo di attività e il rapporto tra la sua attività e l&#39;attività STG registrato dall&#39;elettrodo extracellulare 2,3,7. </li><li> L&#39;amplificatore intracellulare è impostato in modalità di iniezione di corrente e viene utilizzato per 30 minuti a iniettare 10 nA positivi passi corrente nel microelettrodo che durano per 1 secondo e sono separati da 1 secondo con lacune senza corrente iniettata al microelettrodo. Le unità corrente iniettata le molecole cariche positivamente colorante nel neurone registrato. Se l&#39;equipaggiamento è disponibile neuroni multipli possono essere iniettati contemporaneamente. </li><li> Dieci minuti dopo il periodo di iniezione e dopo la fine dell&#39;iniezione la diffusione colorante all&#39;interno del neurone sia selezionata. Per fare questo usiamo il MiCAM02 sistema di imaging (SciMedia Ltd, Tokyo, Giappone) con l&#39;obiettivo 10x e illuminazione dal bassissimo sorgente luminosa alogena ondulazione (HL-151; MORITEX, Tokyo, Giappone) attraverso il filtro MSWG2 cubo (con 480-550 nm di eccitazione filtro; Olympus Corporation, Tokyo, Giappone). Il sistema di imaging è impostato per utilizzare la fotocamera HR con 192 x 128 pixel di risoluzione, 40 ms di tempo di imaging, la modalità &#39;hbin&#39;, e 10 fotogrammi al sessione di imaging. Se il ripieno colorante è successo l&#39;imaging dovrebbe mostrare una patch tinto in neurone intorno alla posizione del microelettrodo, e questa patch tinto dovrebbe crescere tra le immagini scattate dopo 10 minuti e dopo 30 minuti. Se la diffusione del colorante è insufficiente dopo 30 min, tempo di iniezione più è concesso. In alternativa, un elettrodo nuovo colorante può essere utilizzato. </li><li> L&#39;elettrodo è tirato fuori del neurone e il neurone è lasciato a rilassarsi per almeno 20-30 minuti. All&#39;interno di questo tempo, il neurone successivo può essere iniettato con colorante. </li></ol> 4. Imaging di neuroni Tinti L&#39;attività dei singoli neuroni possono essere ripreso dopo la procedura di tintura di riempimento. In alternativa due o più neuroni possono essere riempiti immagine l&#39;attività simultanea di diversi neuroni STG. In linea di principio molti e forse tutti i neuroni STG può essere riempito con un colorante. Le immagini dei neuroni è fatto con il sistema 02 MICAM immagini utilizzando la fotocamera HR. La procedura di imaging è la seguente: <ol><li> L&#39;obiettivo microscopio è cambiato e una elevata trasmissione luminosa efficienza obiettivo 20x (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0,95, WD 2,0 millimetri; Olympus Corporation, Tokyo, Giappone) è utilizzato per la raccolta dei dati di imaging. Questo obiettivo raccoglie molta più luce che l&#39;obiettivo 10x e dà anche maggiore ingrandimento fornendo un&#39;immagine più dettagliata dei neuroni. Bein<html> g significa più efficiente luce di quel poco di colorante di caricamento è già visibile con questo obiettivo e anche che siamo in grado di utilizzare l&#39;intensità della luce più bassa per l&#39;imaging riducendo il danno potenziale foto che possono essere causati ai neuroni del colorante. </li><li> Fase operativa del microscopio è posizionato in modo tale che i neuroni che sono destinati ad essere ripreso sono nel campo di vista l&#39;obiettivo e l&#39;obiettivo si concentra su di loro. </li><li> I dati di registrazione extracellulare è immessa nel sistema di imaging 02 Micam attraverso il suo canale di ingresso analogico. Questo permette al relativamente facile relative dei segnali ottici e schemi motori corrispondenti o picchi extracellulare registrato nella fase di analisi. </li><li> Il sistema di Micam 02 è impostato per utilizzare 96 x 64 pixel di risoluzione con 2,2 ms di tempo di imaging o 48 x 32 pixel di risoluzione con 1,5 ms di tempo di imaging. In entrambi i casi l&#39;impostazione &#39;hbin&#39; può essere utilizzata se la tintura dei neuroni non è molto forte. </li><li> Il livello di luce è quanto più basso possibile (cioè il colorante nei neuroni dovrebbe generare ancora sufficiente a fluorescenza per l&#39;imaging) per evitare foto modulazione e danni foto dei neuroni registrati. </li><li> L&#39;illuminazione della stanza e tutte le sorgenti luminose sono rimasti spenti. Inoltre, una tenda nera può essere chiusa attorno alla piattaforma di registrazione per evitare l&#39;esposizione alla luce da fonti esterne. </li><li> Le sessioni di imaging sono impostati per essere tra 4 - 16 secondi di lunghezza. </li><li> L&#39;attività spontanea dei neuroni tinto è registrato nel corso delle sessioni di imaging diverse. </li></ol> 5. Analisi dei Dati Optical Imaging Per analizzare i dati di immagini abbiamo usato il software BVAna (versione 10,08; SciMedia Ltd., Tokyo, Giappone) associati al sistema 02 MICAM di imaging. Il software supporta la visualizzazione dei dati di imaging e offre una gamma di strumenti di analisi pure. Le fasi dell&#39;analisi dei dati e l&#39;interpretazione sono i seguenti: <ol><li> Una regione appropriata circolare di interesse selezionati in ogni neuroni registrati. Di solito usiamo 2-3 regioni pixel raggio di interesse per lo studio dei neuroni a x 48 32 pixel di risoluzione, e 6 - 8 regioni pixel raggio di interesse per lo studio dei neuroni a 96 x 64 risoluzione. </li><li> Il livellamento temporale dei dati può essere necessario, specialmente se il colorante genera quantità relativamente bassa di fluorescenza (valore di fondo basso i dati indicano questo, che può essere dovuto al basso livello di luce che viene utilizzato o basso carico colorante livello, per esempio in una neurite del neurone registrato). Di solito in questi casi abbiamo usato smoothing temporale con 3 - 5 unità di tempo. </li><li> Oltre alle registrazioni ottica abbiamo anche visualizzare la registrazione extracellulare selezionando per visualizzare l&#39;ingresso analogico del sistema di imaging. </li><li> I parametri per la visualizzazione dei dati ottici e l&#39;ingresso analogico deve essere impostato in modo idoneo a vedere tutte le registrazioni sullo schermo del computer. </li><li> Considerando le registrazioni ottiche dei neuroni, la registrazione extracellulare dal LVN, e la classificazione del neurone basato sulla registrazione intracellulare in precedenza, è possibile determinare l&#39;identità del neurone e mettere in relazione la sua attività alle attività neurale registrato dal nervose. </li><li> Si prevede che le registrazioni ottiche mostrano chiaramente, e senza la necessità di una media su più eventi simili, le attività neurale corrispondente ai picchi registrati extracellulare e anche eventi sottosoglia come inibitori post-sinaptico potenziali causati dall&#39;attività di altri neuroni. </li><li> L&#39;esportazione dei dati caratteristiche del software BVAna può essere utilizzato per esportare le registrazioni ottico calcolato per le regioni di interesse selezionati e anche l&#39;ingresso analogico che contiene la registrazione dal LVN. I dati esportati possono essere elaborati e analizzati ulteriormente utilizzando altri software di analisi dei dati, nonché (per esempio, nel caso più semplice di Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) possono essere utilizzati per la visualizzazione e l&#39;elaborazione dei dati aggiuntivi). </li></ol> 6. Rappresentante Risultati La figura 2 mostra la registrazione simultanea di due neuroni (LP, laterale pilorica neurone, PD, pilorica dilatatore neurone) nel generatore pilorica modello centrale di un granchio STG insieme con la registrazione dal LVN. Le registrazioni ottico dei neuroni LP e PD identificati sulla base delle loro registrazioni intracellulari mostrano che effettivamente queste corrispondono bene con le registrazioni extracellulari corrispondenti ai neuroni LP e PD. C&#39;è un consistente ritardo 12 ms tra le registrazioni ottiche e LVN dei picchi di punta (vedi riquadro di Figura 2) a causa del ritardo di trasmissione assonale tra il ganglio e il sito di registrazione extracellulare. I dati presentati mostra anche che l&#39;attività neurale nel soma che corrisponde ai picchi dei neuroni registrati sia chiaramente rilevabile. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. A) Schema del sistema nervoso stomatogastric (STNS). CoG, commissurali ganglio; OG, ganglio esofageo, STG, ganglio stomatogastric; stn, nervo stomatogastric; LVN, nervo del ventricolo laterale. B) Il ganglio granchio stomatogastric (STG) - l&#39;immagine mostra la disposizione semicircolare posteriore di neuroni STG. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Simultanea registrazione singola scansione di un PD e un neurone LP con la registrazione del LVN. I dati mostrano che che le registrazioni del nervo ottico e partita molto bene e che siamo in grado di individuare le attività neurale corrispondente ai picchi registrati formare il nervo. L&#39;inserto mostra una sovrapposizione di movimenti diversi di potenziali d&#39;azione LP - sia otticamente che elettricamente registrate - e la loro media dimostrando la corrispondenza tra otticamente e attività elettrica registrata. A causa del fatto che il nostro metodo di registrazione ottica non filtra le componenti a bassa frequenza dei dati siamo anche in grado di registrare i cambiamenti lenti potenziale di membrana caratteristici per PD e LP neuroni 14.

<ol>
	<li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection.">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Bartos, M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercircuit+control+of+motor+pattern+modulation+by+presynaptic+inhibition.">Intercircuit control of motor pattern modulation by presynaptic inhibition.</a> J. Neurosci. 17, 2247-2256 (1997).</li><li>Blitz, D. M., Nusbaum, M. 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G., Weimann, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behavioral+repertoire+of+the+gastric+mill+in+the+crab,+Cancer+pagurus:+an+in+situ+endoscopic+and+electrophysiological+examination.">The behavioral repertoire of the gastric mill in the crab, Cancer pagurus: an in situ endoscopic and electrophysiological examination.</a> J Neurosci. 13, 1793-1803 (1993).</li><li>Zecevic, D., Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., London, J. A., H&#246;pp, H. P., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundreds+of+neurons+in+the+Aplysia+abdominal+ganglion+are+active+during+the+gill-withdrawal+reflex.">Hundreds of neurons in the Aplysia abdominal ganglion are active during the gill-withdrawal reflex.</a> J Neurosci. 9, 3681-3689 (1989).</li><li>Briggman, K. L., Kristan, W. 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N., Smith, J., Lansner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cortex+as+a+central+pattern+generator.">The cortex as a central pattern generator.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 477-483 (2005).</li><li>Stein, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+stomatogastric+rhythms.">Modulation of stomatogastric rhythms.</a> J Comp Physiol A. 195, 989-1009 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il colorante sensibile tensione di imaging di 8,9 STG neuroni in combinazione con i tradizionali metodi di elettrofisiologia (registrazioni elettrodo intra ed extracellulare) consente una migliore comprensione di come questo piccolo, funziona bene conosciuto e ancora complesso sistema neurale. La STG è un prototipo di centrale modello generatore (CPG) reti neuronali (comprende il piloro e gastriche reti ritmo mulino) 10,, 11, quindi una migliore comprensione delle proprietà emergenti funzionali del STG aiuterà anche a capire come, in generale, reti CPG generare la loro funzionalità a livello di rete. Reti CPG giocano un ruolo critico nel controllo motorio 12 e anche nelle funzioni cognitive superiori 13, di conseguenza, una migliore comprensione delle loro proprietà emergenti possono avere un grande impatto in molte aree delle neuroscienze.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MiCAM02</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia Ltd, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>BVAna v.10.08</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia, Tokyo, Japab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>HL-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Moritex, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra-low ripple halogen light source</td>
</tr>
<tr>
<td>BX51 WI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upright microscope for epifluorescence imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>20x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>XLUMPLFL20XW/0.95</td>
<td>NA 0.95, WD 2.0mm</td>
</tr>
<tr>
<td>10x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>UMPLFL10XW</td>
<td>NA 0.30, WD 3.3mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>MSWG2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antivibration table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>63-534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PatchStar electrode manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>PS-7000C</td>
<td>Micro-electrode manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>CED Power 1401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data acquisition board</td>
</tr>
<tr>
<td>DL708E Oscilloscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>AC differential amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University of Kaiserslautern, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>P-97 Flaming &#x2013; Brown type electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrode puller</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma Microcentrifuge 1-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, Osterode, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Centrifuge</td>
</tr>
<tr>
<td>Genex Pipettors Mline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
<td>PIP7774</td>
<td>PIP7774</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass micropipette with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
<td>GB100TF 8P</td>
<td>Glass for microelectrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>MicroFil &#x2013; 34G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microfil needle</td>
</tr>
<tr>
<td>Spike 2 v6.10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrophysiology software</td>
</tr>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Bioscience Ltd, Cambridge, UK</td>
<td>BT61014</td>
<td>Fluorescent voltage sensitive dye</td>
</tr>
<tr>
<td>F-127 Pluronic Acid, DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Paisley, UK</td>
<td>P-3000MP</td>
<td>Solvent</td>
</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>S9888</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2 . 2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>C3881</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>P3911</td>
<td>Crab saline component, electrolyte solution</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2 . 6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M9272</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Trizma base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>T1503</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Maleic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M0375</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Elastosil RT-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wacker, Munich, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lining of Petri dishes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical imaging of neurons in the crab stomatogastric ganglion with voltage-sensitive dyes

Voltaggio-sensibile di imaging tinta di neuroni è una metodologia chiave per la comprensione del funzionamento delle reti neuronali sono organizzate e come l&#39;attività simultanea di neuroni che partecipano porta alla nascita della funzionalità integrante della rete. Qui vi presentiamo la metodologia di applicazione di questa tecnica per generare neuroni modello individuato nel ganglio granchio stomatogastric. Dimostriamo il caricamento di questi neuroni con la tensione fluorescente sensibile colorante Di-8-ANEPPQ e mostriamo come immagine l&#39;attività dei neuroni colorante caricato utilizzando il MiCAM02 ad alta velocità e ad alta risoluzione CCD sistema di imaging. Dimostriamo l&#39;analisi dei dati di imaging registrati utilizzando il software di imaging BVAna associati al sistema MiCAM02 imaging. La simultanea di tensione-sensibili di imaging colorante dell&#39;attività dettagliati dei neuroni nel ganglio più granchio stomatogastric applicata insieme con le tradizionali tecniche di elettrofisiologia (registrazioni intracellulari ed extracellulari) apre radicalmente nuove opportunità per la comprensione di come centrale generatore di reti neurali lavoro modello.

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Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Qui vi presentiamo la metodologia per una rapida e ad alta risoluzione fluorescenti tensione-sensibili di imaging tintura di attività dettagliata dei neuroni del ganglio stomatogastric granchio.

Imaging ottico di neuroni nel ganglio Granchio Stomatogastric con tensione sensibili Coloranti

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

optical-imaging-neurons-crab-stomatogastric-ganglion-with-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.9K Views.  Ulm University. Qui vi presentiamo la metodologia per una rapida e ad alta risoluzione fluorescenti tensione-sensibili di imaging tintura di attività dettagliata dei neuroni del ganglio stomatogastric granchio.

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Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Ricerca

Neuroscienze

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina in Zebrafish adulti con coloranti fluorescenti

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

3-D imaging e analisi di neuroni infetti<em&gt; In Vivo</em&gt; Con<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Registrazione ottica a singolo fotone a campo largo nelle sezioni cerebrali utilizzando Colorazione sensibile alla tensione

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Isolamento e cultura dei neuroni del Ganglione Ciliario

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...