Il nostro laboratorio di ricerca è sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute on abuso di alcool e l&#39;alcolismo.

<html> I. Preparazione per l&#39;iniezione Questa sezione descrive le fasi di preparazione che devono essere prese prima di iniettarlo cDNA nel nucleo dei neuroni. La procedura di isolamento per i neuroni è oltre la portata di questo articolo, ma è importante avere i neuroni dissociate in singole cellule e ben aderente alla superficie inferiore di 35 millimetri dishes cellule cultura (vedi discussione per consigli utili per raggiungere questo obiettivo). Anche se una serie di neuroni diversi potrebbero essere utilizzati, gangli periferici come i gangli cervicale superiore (SCG) o gangli delle radici dorsali sono da preferire per la dissezione perché sono comodamente accessibili e produrre un gran numero di neuroni. Ulteriori vantaggi di usare i neuroni SCG è che sono una popolazione relativamente omogenea di cellule e ben caratterizzati 1,2,3,4. A. Preparazione del plasmide cDNA per l&#39;iniezione <ol><li> Per prevenire la contaminazione o rottura del DNA, i guanti dovrebbero essere indossati durante la preparazione. </li><li> DNA che codifica per la proteina di interesse è subcloned in un vettore adatto espressione mammiferi, come il PCI (Promega, Madison, WI), ai sensi del regolamento del altamente e costitutivamente attiva da citomegalovirus (CMV) promotore. Se la proteina non è etichettato, un reporter plasmide, EGFP codifica per esempio (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), è co-iniettata per confermare l&#39;iniezione di successo e di espressione. Il DNA è isolato con una alta colonna di separazione di qualità (ad esempio QIAfilter Midi-preparazione kit, Qiagen, Chatsworth, CA) e ulteriormente purificato con una unità di centrifuga filtro con un filtro di PVDF (0,1 micron, Millipore, Bedford, MA) per rimuovere le particelle in preparazione plasmide, che può ostruire pipette iniezione durante il processo di iniezione. I plasmidi sono conservati a -20 ° C ad una concentrazione di circa 1 mg / mL in un buffer adeguato stoccaggio del DNA (es. tampone TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Immediatamente prima di microiniezione, cDNA plasmidico sono diluiti e mescolati alla concentrazione finale desiderata in TE buffer o H 2 O. Tipicamente, 5-10 ng / ml di gene reporter è sufficiente per etichettare le cellule iniettate, e la concentrazione totale di cDNA da iniettare non deve superare i 200 ng / mL dato che il DNA è viscoso ad alte concentrazioni e può ostruire pipette iniezione. Una piccola quantità di cDNA per l&#39;iniezione (microlitri 5-10) si prepara mescolando gocce di soluzione sulla superficie pulita di un piccolo pezzo di Parafilm (lato sotto lo strato di carta). Mescolare le gocce di soluzione insieme da pipeting su e giù più volte con un pipetor ed evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria durante la miscelazione. </li><li> Utilizzando una punta pipetta microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), trasferire la soluzione cDNA ad un tubo di ematocrito appositamente preparato (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Vedere la sezione materiali per le istruzioni sulla preparazione dei tubi di ematocrito (tabella materiali). Posizionare il tubo contenente la soluzione ematocrito cDNA iniezione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifugare la provetta per 15-30 minuti a 10 000 g in una microcentrifuga dotato di un rotore ad angolo fisso o oscillante (Eppendorf), a temperatura ambiente (20-24 ° C) per particelle di sedimento nella soluzione cDNA che possono bloccare le microiniezione pipetta. La soluzione iniettabile cDNA possono essere conservati a temperatura ambiente durante la sessione di iniezione. </li></ol> B. Realizzazione di pipette di iniezione <ol><li> Pipette monouso microiniezione di vetro sono disponibili in commercio (ad esempio Femtotips, Eppendorf), che sono convenienti ma costoso ($ 10 per ogni pipetta microiniezione). Pipette di iniezione può essere prodotto in laboratorio utilizzando un programmabile P-97 estrattore Flaming pipetta Brown (Instrument Company Sutter, Novato, CA) e filamented, a pareti sottili tubi di vetro borosilicato capillare (Strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL). Questa opzione è più conveniente e consente il controllo di forma e dimensione microiniezione pipetta. </li><li> A due stadi programma viene utilizzato per tirare strette puntali microiniezione. Dal momento che l&#39;apertura di pipette microiniezione è troppo stretto per esaminare al microscopio ottico, la qualità di pipette di iniezione devono essere valutate direttamente iniettando poche cellule prima che le impostazioni del programma sono finalizzati. Di seguito sono approssimativi impostazioni per le impostazioni di calore, tirare, velocità e tempo: (pull 1) 600, 115, 15, 250; (pull 2) 640, 130, 65, 200. Queste impostazioni variano a diversi lotti di vetro e dalla condizione del filamento di riscaldamento l&#39;estrattore, e deve essere adattata alle necessità. Per maggiori dettagli vedi 5. </li><li> Tirare diversi (2-5) pipette di iniezione per ogni piatto di neuroni da iniettare, in caso di danni o problemi durante la sessione di iniezione. Pipette iniezione di conservare in un recipiente coperto, per evitare che la polvere di entrare la punta della pipetta microiniezione. </li></ol> II. Microiniezione intranucleari tenda &quot;&gt; In questa sezione i dettagli del processo di iniezione del DNA nel nucleo dei neuroni. microiniezione Un set-up base comprende una rovesciata microscopio a contrasto di fase (ad esempio Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) per visualizzare il processo, micromanipolatore (ad esempio Eppendorf 5171) per controllare il movimento della pipetta di iniezione e una pressione di iniezione (ad esempio Eppendorf FemtoJet Express) per espellere la soluzione di cDNA dalla pipetta. Collegamento della pressione iniettore al micromanipolatore consente la sincronizzazione di questi ultimi due processi durante le iniezioni. Other facoltativo, ma altamente raccomandato, componenti includono un sistema di monitoraggio video montato (CCD, Cohu Inc., San Diego, CA; bianco e nero, monitor video, Sony Corporation, Tokyo, Giappone). Questo sistema non è un requisito assoluto per preparazioni iniettabili; tuttavia, il monitor in bianco e nero offre un elevato contrasto per una migliore visualizzazione del nucleo cellulare e offre una visualizzazione più confortevole durante le sessioni di iniezione lungo. Inoltre, un computer portatile con software per gestire un portatile controller può essere utilizzato per semi- automatizzare il processo di iniezione (vedi la discussione per i dettagli). Il momento ideale per iniettare neuroni SCG è di 3-6 ore dopo la dissociazione. A questo punto, le cellule sono sferiche, strettamente collegato al fondo del piatto, e il nucleo è chiaramente visibile, sotto un microscopio a contrasto di fase, come una centrale rotondo organello con una membrana scura, contenente un singolo o più nucleoli (Figura 1A). <ol><li> Posizionare un piatto di neuroni dissociato al centro del palco microscopio. Regolare la messa a fuoco e ottimizzare l&#39;ottica a contrasto di fase del microscopio così i nuclei dei neuroni sono chiaramente visibili. </li><li> Pipettare 2 ml di soluzione preparata cDNA in una pipetta microiniezione con una punta di pipetta microloader. Evitare di elaborare una soluzione vicino al fondo della provetta ematocrito dal momento che questo può suscitare le particelle che si stabilì durante la centrifugazione. Il filamento in pipette microiniezione dovrebbero aiutare nel disegno soluzione per la punta, ma se persistono piccole bolle d&#39;aria, picchietti leggermente la parte del vetro per rimuoverli. </li><li> Inserire la pipetta microiniezione nel supporto capillare della pressione degli iniettori e quindi fissare il supporto al micromanipolatore. Il titolare è fissato ad un angolo di 45 °. </li><li> Abbassare la pipetta microiniezione nel piatto. Come la pipetta entra nel terreno di coltura, si forma un menisco che influisce sulla rifrazione della luce e riduce la qualità dell&#39;immagine dei neuroni. Per alleviare questo problema, la torretta anello di fase può essere leggermente spostata fino a quando i nuclei dei neuroni sono ancora chiaramente visibili. </li><li> Alcuni sistemi di pressione di iniezione hanno una funzione &quot;pulito&quot; che si applica la massima pressione d&#39;aria dalla punta microiniezione pipetta per una breve durata. Utilizzare questa funzione per cancellare la pipetta di detriti prima dell&#39;inizio e durante le iniezioni, se la punta sembra intasato. Se il liquido disperso non è visibile sullo schermo durante l&#39;utilizzo di questa funzione, sostituire con una pipetta nuova iniezione. </li><li> Centro la pipetta microiniezione nel monitor di visualizzazione e allineare la punta accanto a un neurone e nello stesso piano focale come il nucleolo. Impostare questa posizione più bassa l&#39;asse z limite al micromanipolatore. Questa posizione è la profondità della pipetta microiniezione avanzeranno al durante le iniezioni. Ora la posizione della punta di circa 30 micron di sopra di questo punto quindi la pipetta microiniezione cancella la parte superiore dei neuroni. </li><li> La modalità di &quot;iniettare&quot; di un micromanipolatore 5171 Eppendorf può essere definito con le seguenti impostazioni per eseguire iniezioni intranucleari. Il iniettare funzione è attiva, mentre la funzione di impalare è lasciato. Un percorso di iniezione diagonale (lungo la X e Z-asse) produce la minor quantità di danno cellulare, e quindi la modalità assiale deve essere utilizzato per preparazioni iniettabili. Una velocità d&#39;iniezione di 300 micron / s è sufficiente, e sincronizzare l&#39;accumulo di pressione quando la pipetta microiniezione raggiunge la serie z limite. </li><li> La pressione iniettore controlla la quantità di soluzione cDNA iniettato nel nucleo. Nella modalità &quot;automatico&quot; di iniezione, la consegna del DNA è a tempo controllato e avviato dal micromanipolatore collegati. La pressione di iniezione (Pi) dovrebbe essere impostata tra 100-200 ettopascal (hPa, 1 hPa ~ 0,015 psi); pressioni d&#39;iniezione superiori non migliorano i tassi di successo o la qualità delle iniezioni e può indicare altri problemi con le dimensioni punta microiniezione pipetta o la purezza del DNA . Una durata di iniezione (ti) di 0,3 s ed una pressione di compensazione (Pc) di 30 hPa, che fornisce una pressione costante positiva a evitare l&#39;entrata di occlusione particelle dal mezzo di coltura in la punta della pipetta, dovrebbe essere usato. </li><li> Posizionare il neurone per essere iniettato sotto la punta della pipetta microiniezione utilizzando il microscopio assi xy controllo stadio. Allineare la punta della pipetta sopra il centro del nucleo, concentrandosi avanti e indietro tra tlui punta e nucleoli. </li><li> Iniettare il nucleo premendo il pulsante di iniettare (in micromanipolatore). Per la fase di iniezione, il movimento della pipetta microiniezione e il rilascio della soluzione di cDNA sono controllati dal micromanipolatore. E &#39;difficile confermare il successo iniezioni intranucleari ad occhio, ma l&#39;iniezione della soluzione di viscosità relativamente bassa cDNA (rispetto per l&#39;ambiente viscoso nucleare), appare spesso come una piuma bianca in contrasto di fase ottica e può essere utilizzato come indicatore di iniezione nel nucleo. A volte la pipetta microiniezione non penetra la membrana nucleare e trilli semplicemente il nucleo. Un tentativo seconda iniezione nella stessa posizione può portare ad una iniezione di successo del DNA nel nucleo. Rigonfiamento della cellula è di solito indicativa di involontaria iniezione citoplasmatica. Inoltre, significativo rigonfiamento nucleare non è ben tollerato dai neuroni e di solito porta alla morte cellulare subito dopo, così, la pressione di iniezione e la durata non deve superare i valori suggeriti. </li><li> Continua iniettando neuroni, riposizionando la fase microscopio per allineare il neurone successivo sotto la pipetta microiniezione. Sistematicamente navigare attraverso il piatto di iniettare circa 50-100 nuclei prima di tornare il piatto dei neuroni per l&#39;incubatore per l&#39;incubazione durante la notte. Neuroni con successo iniettato può essere identificato il giorno successivo dalla espressione del gene reporter. </li></ol> III. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: ganglio cervicale superiore (SCG) neuroni. Contrasto di fase della SCG neuroni 3 ore successive alla dissociazione (A). In questa fase, il nucleo è chiaramente visibile che favorisce l&#39;allineamento della punta della pipetta microiniezione. Il nucleo appare al centro di neuroni con un singolo (a sinistra) o multipla (a destra) nucleoli scuro. SCG neuroni 16 ore dopo l&#39;iniezione di EGFP cDNA nel nucleo (B). Sinistra, SCG neuroni visto sotto a contrasto di fase illuminazione. A destra, immagine epifluorescente dei neuroni stessi che mostra l&#39;iniezione di successo e conseguente espressione di EGFP in un neurone. Barra di scala bianca è di 20 micron. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2: Whole-cell registrazioni delle correnti attraverso heterologously-espresso proteine ​​G accoppiate interiormente rettificazione K + (GIRK) canali da SCG neuroni. GIRK correnti (I GIRK) sono stati evocati da una rampa di tensione di 200 ms da -140 a +40 mV da un potenziale di detenzione di -60 mV (inserto di A) dopo l&#39;attivazione del endogena α 2-adrenergici di noradrenalina (NE, 10 mM) . Tracce sovrapposte sono registrazioni dal neurone stesso e indicare prima (nero) e dopo l&#39;applicazione di uno solo NE (blu) o NE più 10 mM Ba 2 + (rosso). Le linee tratteggiate indicano il livello zero di corrente. Per la registrazione io GIRK, la soluzione esterna contenuta (in mm) 130 NaCl, 5.4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl 2, 0,8 MgCl 2, 15 di glucosio, 15 saccarosio, e 0,0003 TTX, portato a pH 7.4 con NaOH. La soluzione di registrazione interna contenuta (in mm) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, e 0,3 Na 2 GTP, portato a pH 7.2 con KOH. La mancanza di corrente suscitato dalla rampa di tensione in presenza di NE in uninjected neuroni SCG (A) dimostra che i neuroni SCG non esprimono canali GIRK endogena. Iniezione di successo di plasmide codifica cDNA un funzionale GIRK canale 11 dà luogo a grandi correnti durante la rampa di tensione quando esposto a NE (B, a sinistra). Le correnti hanno le caratteristiche tipiche delle correnti attraverso i canali GIRK: l&#39;attivazione di una proteina G agonista del recettore accoppiato (NE), la rettificazione verso l&#39;interno, e il blocco delle correnti dai bloccante putativo canale GIRK, Ba 2 + (B, traccia a destra rosso). Cerchi aperti e pieni rappresentano io GIRK presso l&#39;azienda e la corrente di picco, rispettivamente. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2.

<ol>
	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

Problemi comuni riscontrati e suggerimenti: Come accennato in precedenza, le iniezioni di successo nucleare dipendono dall&#39;avere cellule aderenti alle piastre di coltura dei tessuti. Posticipando l&#39;inizio di iniezioni poche ore dopo la procedura cellula dissociazione permette ai neuroni di aderire al fondo dei piatti. In aggiunta, piatti rivestimento con 0,1 mg / ml di alto peso molecolare poli-L-lisina (Sigma, St. Louis, MO) adesione aiuti di neuroni alla superficie inferiore dei piatti. Blocco di pipette microiniezione, soprattutto quando si cerca di iniettare una elevata concentrazione di DNA, può essere un problema frequente. Utilizzando alta qualità colonne di separazione per isolare e purificare DNA plasmidico, e di eseguire la procedura di purificazione addizionale citato (filtri spin, spinning in tubi di ematocrito) può contribuire a rimuovere le particelle prima di iniettarlo. Durante le iniezioni, la funzione &quot;pulita&quot; della pressione iniettore può essere utilizzato (per 0,2 s è sufficiente), ma se questo non risolve il problema, una pipetta nuova iniezione dovrebbe essere usato. Se la maggioranza di pipette microiniezione occludersi durante una sessione di iniezione, in considerazione modificando le impostazioni del estrattore pipetta di vetro per la produzione di puntali microiniezione con una maggiore apertura. Un altro problema che si pone nel corso di iniezioni nucleare è l&#39;irregolarità della superficie inferiore di piatti di coltura di tessuti. Questa variabilità influenza direttamente la precisione di mira puntali di iniezione al nucleo in quanto la profondità del attraversa pipetta durante le iniezioni è fisso. Pertanto, questo asse z limite deve essere regolato durante il ciclo di iniezioni all&#39;interno della stesso piatto. Sarà evidente quando un adeguamento è necessario: non ci sarà alcuna indicazione di iniezione nucleare (nessun pennacchio bianco o nel nucleo della cellula è mancato del tutto), o la punta della pipetta di iniezione si avvicina al fondo del piatto (comprimendo la cellula o anche schiantarsi la punta della pipetta sul fondo del piatto). Vetro-clonazione cilindri (. OD 10 mm, Cat. No. 2090-01010, Bellco Vetro, Vineland, NJ) possono essere utilizzati durante la placcatura dei neuroni di limitare in un più piccolo, un&#39;area più limitata, quindi riducendo al minimo la distanza necessaria per muoversi la pipetta di iniezione tra le iniezioni. Questi cilindri clonazione sono stati rimossi prima di eseguire microiniezioni. Svantaggi della tecnica: Microiniezioni intranucleari sono tecnicamente impegnativi, che richiedono pazienza e un alto grado di destrezza manuale da parte dell&#39;operatore. Competenza con questa tecnica, come ogni altra abilità, viene con la pratica. Quindi, si consiglia di praticare iniezioni nucleare del gene reporter solo prima di tentare esperimenti reali. Per aiutare ulteriormente il processo di iniezione, può essere possibile consolidare i passi del micromanipolatore e la pressione di iniezione in un programma per computer. Programmi come Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) possono essere utilizzati per memorizzare le impostazioni microiniezione e programmare i controllori multifunzione (ShuttlePRO, Contour Design, Windham, NH) per semi-automatizzare il processo di iniezione (vedere 6,7,8 per i dettagli). Un altro svantaggio della tecnica microiniezione intranucleari è la bassa percentuale di successo. Circa il 10-20% dei tentativi iniezioni nucleare portare ad espressione della proteina. Anche se questa efficienza può essere sufficiente per le applicazioni che non richiedono un gran numero di cellule che esprimono, elettrofisiologia ad esempio, per vari saggi biochimici questo potrebbe non essere sufficiente. Le applicazioni della tecnica: Nonostante i suoi svantaggi, microiniezione intranucleari del DNA è una tecnica estremamente utile per heterologously che esprimono proteine ​​nei neuroni. Alti livelli di espressione della proteina si ottengono con microiniezioni nucleare a causa del gran numero di plasmidi rilasciato nel nucleo durante le iniezioni, un promotore molto attivo CMV, che regolano la trascrizione genica, e la stabilità a lungo di plasmidi nel nucleo. Proteine ​​sovra-espressione è particolarmente utile nelle dominante negativo esperimenti in cui sono richiesti alti livelli di proteine ​​eterologhe per sopraffare la proteina endogena. Un altro vantaggio di intranucleari iniezioni è la capacità di fornire una percentuale consistente di costrutti cDNA al nucleo quando costruisce più vengono iniettati. Con i metodi di transfezione altra parte, è difficile introdurre riproducibile la stessa proporzione di DNA ogni costrutto in cellule diverse all&#39;interno dello stesso piatto e tra trasfezioni. Iniezione diretta di soluzione cDNA nel nucleo elimina questa fonte di variabilità e permette il rapporto tra proteine ​​espresse da essere titolati in modo efficace. Metodi di trasfezione tradizionali hanno efficacia limitata nel post-mitotico delle cellule a causa della scarsa incorporazione di DNA nel nucleo 9 e tossicità chimica associata a REAG trasfezionegenitori 10. Microiniezioni nucleare superare questi problemi attraverso l&#39;introduzione di materiale genetico nel nucleo meccanicamente. Sebbene questa tecnica è più coinvolto, la possibilità di studiare l&#39;effetto di una proteina in un sistema biologico funzionale, completo di endogeno vie di segnalazione, più che compensa la natura laboriosa di questa tecnica. Tutte le procedure sperimentali su animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institutes of Health Linee guida per la cura degli animali e Usa.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ultrafree-MC Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC30VV00</td>
<td>Durapore PVDF filter; 0.1 &mu;m pore-size</td>
</tr>
<tr>
<td>TE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc</td>
<td>351-010-131</td>
<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-hematocrit capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-362-574</td>
<td>Unheparinized Preparation: 
Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&deg;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5417 R</td>
<td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader 20 &mu;l pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection capillary glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW120F-4</td>
<td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td>
</tr>
<tr>
<td>Charge-coupled device (CCD) camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cohu Inc.</td>
<td>6410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Video monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony Corporation</td>
<td>PVM-122</td>
<td>Black and White, 9&#x201D; screen </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5171</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>FemtoJet Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contour Design</td>
<td>S-PROV2</td>
<td>Programmable multimedia controller</td>
</tr>
<tr>
<td>Igor Pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WaveMetrics</td>
<td>Version 4.05A</td>
<td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

Colture primarie di cellule neuronali sono strumenti preziosi per lo studio della funzione delle proteine ​​in quanto rappresentano un sistema più biologicamente rilevanti rispetto alle linee cellulari immortalizzate. Tuttavia, il post-mitotico natura di neuroni primari impedisce un&#39;efficace espressione eterologa proteine ​​mediante procedure comuni come l&#39;elettroporazione o chimicamente mediata trasfezione. Così, altre tecniche devono essere impiegati per esprimere efficacemente le proteine ​​in queste cellule non si dividono. In questo articolo, si descrivono i passaggi necessari per eseguire iniezioni intranucleari di costrutti di cDNA dissociato in neuroni adulti simpatico. Questa tecnica, che è stata applicata a diversi tipi di neuroni, possono con successo indurre l&#39;espressione di proteine ​​eterologhe. L&#39;attrezzatura indispensabile per la procedura di microiniezione comprende un microscopio invertito per visualizzare le cellule, una pipetta di iniezione di vetro riempita con una soluzione di cDNA che è collegato ad un 2 N (g), sistema di pressione di consegna, e di un micromanipolatore. Il micromanipolatore coordina il movimento iniezione di pipetta microiniezione con un breve impulso di pressione N 2 per espellere soluzione cDNA dalla punta pipetta. Questa tecnica non ha la tossicità associata a molti metodi di trasfezione altri costrutti del DNA e permette più di essere espresso con un rapporto costante. Il basso numero di cellule iniettate rende la procedura di microiniezione adatto per gli studi di singola cellula, come le registrazioni elettrofisiologiche e di imaging ottico, ma potrebbe non essere l&#39;ideale per le analisi biochimiche che richiedono un numero maggiore di cellule e l&#39;efficienza di trasfezione superiore. Anche se microiniezioni intranucleari richiedono un investimento di attrezzature e di tempo, la capacità di raggiungere alti livelli di espressione della proteina eterologa in un ambiente fisiologicamente rilevanti rende questa tecnica uno strumento molto utile per studiare la funzione delle proteine.

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Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Iniezione diretta intranucleari di cDNA è una tecnica di transfezione efficace per la post-mitotico delle cellule. Questo metodo fornisce un alto livello di espressione della proteina eterologa dai costrutti di cDNA singole o multiple e consente la funzione delle proteine ​​da studiare in un ambiente fisiologicamente rilevanti con una serie di saggi di singola cellula.

Microiniezione intranucleari di DNA in dissociato neuroni dei mammiferi adulti

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Views.  National Institutes of Health (NIH). Iniezione diretta intranucleari di cDNA è una tecnica di transfezione efficace per la post-mitotico delle cellule. Questo metodo fornisce un alto livello di espressione della proteina eterologa dai costrutti di cDNA singole o multiple e consente la funzione delle proteine ​​da studiare in un ambiente fisiologicamente rilevanti con una serie di saggi di singola cellula.

Video: Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparazione del dissociato Culture Neuron mouse corticale

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Ricerca

Biologia

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

Transfection DNA dei mammiferi muscoli scheletrici con In Vivo Elettroporazione

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Iniezione intraperitoneale in Zebrafish adulti

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.