Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Deirdre Nelson per gli utili commenti e per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH DE019244, DE019197 e DE021841 a ML, F32DE02098001 di SJS e C06 RR015464 all&#39;Università di Albany, SUNY.

Il protocollo prevede quattro fasi principali, come illustrato nella Figura 1. Tutti i passaggi sono descritti in dettaglio. Costruzione adenovirus e purificazione virale deve essere fatto prima della raccolta di organi per l&#39;uso nella trasduzione genetica di sezionati rudimenti epiteliali. Tutti gli standard di BSL-2 misure di sicurezza devono essere seguite quando si lavora con adenovirus. 1. Embrionali di topo sottomandibolare Gland (SMG) Raccolta e Microdissection <ol><li> Eutanasia topi di sesso femminile a tempo-in stato di gravidanza (ceppo consanguinei CD-1 o ICR) con emissioni di CO 2 narcosi, seguita da dislocazione cervicale e archi raccolta di embrioni di topo al giorno embrionale 13 (E13, 3-5 gemme epiteliali) seguenti procedure approvate dal IACUC istituzionale comitato. Il giorno della scoperta tappo vaginale è designato come E0. Ghiandole salivari possono essere raccolte e coltivate nella fase E12 quando vi è un singolo germoglio primario e gambo con fessure iniziandoper iniziare. SMGs prima di questa fase, richiedono condizioni di coltura diverse da quelle indicate. </li><li> Trasferire stringhe embrioni in sterili 10 piatti tessuto centimetri coltura riempite con 25 ml di DMEM / Ham &#39;s Medio F12 (F12) manca rosso fenolo (Life Technologies), integrato con 100 U / ml di penicillina, e 100 pg / ml di streptomicina (pen-strep, Life Technologies). </li><li> Usando un bisturi sterile (# 11 pale) e pinza (# 5, Strumenti scientifici Arti, 11252-20), rimuovere gli embrioni dalle sacche in una separata 10 portata cm contenente 25 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. </li><li> Sever le teste di embrioni con un taglio angolato appena sotto la mascella inferiore. </li><li> Isolare le mandibole inferiori dalle teste sotto un microscopio da dissezione stereo con una base di luce trasmessa (Nikon SMZ645 o equivalente) con un taglio sotto la mascella superiore. Posizionare i tessuti sopra un ulteriore pezzo di vetro piuttosto che direttamente sul componente in vetro della base del microscopio. </li><li> Raccogliere le mandibole inferiori in 3 ml di DMEM/F12 + pen-strep in una piastra da 35 sterile cultura del tessuto mm. </li><li> Una fetta mandibola sulla scena microscopio da dissezione modo che la linguetta è sul fondo della fetta, ma è rivolta verso la posizione 12:00. </li><li> Utilizzando un lato due pinze incrociate in un movimento a forbice, rimuovere ed eliminare il rd 1/3 inferiore della fetta mandibola. </li><li> Ruotare di 90 ° sezione a destra (se la mano destra) e, con un taglio a forbice con le pinze, tagliare la parte superiore della fetta mandibola (senza il taglio della lingua) a metà strada nella fetta. </li><li> Sbucciare il tessuto in eccesso e rimuoverlo per esporre i fucili mitragliatori sotto. Ci sarà uno su ciascun lato vicino alla base della lingua. </li><li> Usando un paio di pinze a tenere premuto il tessuto con la lingua, usare il forcipe altri a prendere in giro la SMG di distanza dalla lingua. Ripetere l&#39;operazione per la ghiandola altro. </li><li> Raccogliere le ghiandole salivari microdissezione in 3 ml di DMEM/F12 + pen-strep in un nuovo tessuto sterile 35 millimetricultura piatto. Nota: le ghiandole sottomandibolari più grandi (3-5 gemme epiteliali) insieme al più piccolo collegato ghiandola sublinguale (1 auricolari) possono essere coltivate intatto saltando al punto 4 ed eseguito le fasi 4.1, 4.3, e 4.4, come descritto in precedenza 2,8. </li></ol> 2. SMG separazione epiteliale Rudiment <ol><li> Posto 5 (o più) ghiandole salivari in un fondo di vetro, diametro 50 mm micropozzetti piatto (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) contenente 200 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS privo di Ca + + e Mg + +, Life Technologies) contenente 0,4% (v / v) dispasi (Life Technologies, cat. no. 17.105-041) e incubare per 15 min a 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, utilizzando una sterile 200 microlitri punta della pipetta, aspirare accuratamente la soluzione dispasi senza disturbare le ghiandole. Immediatamente aggiungere 200 microlitri di DMEM/F12 supporto contenente 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pre-sterilizzati con un filtro di 0,22 micron) per neutralizzare l&#39;dispasi. </li> &lt;li&gt; Sotto un microscopio da dissezione, usando un paio di pinze con le punte fini (# 5 Dumostar, Strumenti scientifici Arti, 11295-20), separare delicatamente il mesenchima allentato intorno ai germogli SMG epiteliali e condotti, avendo cura di lasciare l&#39;epitelio intatto . </li><li> Pre-wet una sterile 200 ml con puntale DMEM/F12-BSA media e pipettare delicatamente i rudimenti epiteliali in un nuovo piatto di 50 mm di diametro pozzetto contenente 200 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. Utilizzare una punta di alta qualità 200 microlitri pipetta con un bordo liscio. </li><li> Nel piatto che contiene i pezzi mesenchima, scartare qualsiasi non-tessuto mesenchimale comprese le ghiandole sublinguali e le gemme staccate ghiandola sottomandibolare. </li></ol> 3. L&#39;infezione adenovirale di Rudimenti epiteliali <ol><li> Marca 200 pl di supporti infezione virale diluendo l&#39;adenovirus di interesse in DMEM/F12 + pen-strep in una provetta da microcentrifuga modo che il titolo della soluzione risultante è 1x10 8 -10 9 PFUs. Iltitolo ottimale necessaria per diversi virus possono variare. È importante usare cloruro di cesio (CsCl)-preparazioni purificate virali per efficienza assorbimento ottimale. </li><li> Rimuovere il supporto dal piatto contenente i cinque rudimenti epiteliali. Rapidamente aggiungere 200 microlitri di media infezione, mantenendo i rudimenti sempre umida. Prendere le necessarie precauzioni nel maneggiare il virus e lo smaltimento dei puntali contaminati. Disinfettare eventuali virus superfici contaminate con soluzione di candeggina al 10%. </li><li> Spostare i rudimenti epiteliali lontani l&#39;uno dall&#39;altro con una pinza per evitare che si attacchino e consentire loro di depositarsi sul fondo della piastra. Incubare rudimenti in media virali per 1 ora a temperatura ambiente. Durante l&#39;incubazione, separare i rudimenti, se si muovono vicini. Dondolo eccessivo o movimento permetterà le ghiandole ad ammassarsi. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere delicatamente le virali contenenti i media ed eliminare in modo appropriato, facendo attenzione a non disturbare il rudiments. Aggiungere 200 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. Ripetere il lavaggio almeno altre due volte e sostituirlo con 200 ml di DMEM/F12 + pen-strep media. I lavaggi sono fondamentali per rimuovere eventuali virus che non è fortemente collegato al epitelio e per prevenire l&#39;infezione del mesenchima. </li><li> Incubare rudimenti epiteliali con 200 ml di DMEM/F12 contenente 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356.231) per 20 min. Troviamo che questo breve incubazione in Matrigel minimizza la regressione di fessure esistenti durante il periodo di coltura iniziale, ma questo passaggio può essere omesso se l&#39;esposizione a Matrigel non è desiderato. </li></ol> 4. Ex vivo di cultura fucili mitragliatori ricombinato <ol><li> Posizionare ogni rudimento, uno alla volta, utilizzando un pre-wet 200 microlitri punta della pipetta, sopra un intaglio (piccolo taglio) 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch membrana filtro (Whatman) galleggianti su 200 microlitri di terreni di coltura ( 5 rudimenti / filtro) in un fondo di vetro per micropiastre. La cultura dei mediaè: DMEM/F12 + pen-strep contenente 50 ug / ml di transferrina e 150 ug / ml di acido ascorbico, come precedentemente descritto 2,8. La transferrina è noto per stimolare la sopravvivenza e la ramificazione morfogenesi delle ghiandole salivari e espianti di organi di altri 9. Aggiunta di acido ascorbico è stato mostrato per stimolare SMG ramificazione. 10 E &#39;noto per agire come cofattore in molte reazioni di idrossilazione di vie metaboliche (come idrossilazione prolina durante la formazione di fibre collagene 11) e stimola anche la produzione di fibronectina e laminina in espianti altri organi 12. </li><li> Rimuovere come media molto sulla parte superiore del filtro possibile dopo l&#39;aggiunta di ogni rudimento epiteliale. Quantità eccessiva di supporti sulla parte superiore del filtro può causare il filtro di affondare, mentre meno dei media, rende il posizionamento dei rudimenti e mesenchima molto più facile. Supporti in eccesso può essere rimosso o con una pipetta o utilizzando pinze per afferrare il materiale tra le punte. </li><li> Luogo pezzi mesenchima derivato from 3-4 ghiandole sulla parte superiore e / o intorno ad ogni rudimento epiteliale. Rimuovere eventuali supporti aggiuntivi che circonda le ghiandole per evitare movimenti del mesenchima lontano dai rudimenti. Mesenchima deriva dal più ghiandole non è utile ma meno può essere dannoso per la crescita epiteliale rudimento. </li><li> Incubare SMGs ricombinati in un incubatore umidificato (95% aria / 5% CO 2) a 37 ° C per 48 -72 ore, come desiderato. </li><li> Acquisire campo chiaro e / o immagini fluorescenti di ghiandole in scena a 0 ore (se lo si desidera), 2 ore dopo la ricombinazione e ogni 24 ore in seguito con microscopio ottico invertito, in posizione verticale, o stereo dotato di una fotocamera digitale con un obiettivo di ingrandimento 4X o 5X per catturare l&#39;intera ghiandola ricombinato in un singolo fotogramma di vista. Immagini della ghiandola salivare mostrano il miglior contrasto utilizzando l&#39;impostazione campo chiaro o l&#39;anello di fase eventualmente montata un certo punto del percorso della luce (che non è possibile a completamente automatizzati microscopi). Contrasto di fase standard non èt necessario poiché la ghiandola è spesso e crea contrasto. </li><li> I desiderati punti temporali, SMGs ricombinati possono essere fissate per 20 minuti con soluzione fissativa realizzati 2% paraformaldeide (PFA) in 1X PBS contenente 5% (w / v) di saccarosio (per preservare meglio la struttura cellulare interna, mantenendo le cellule in uno stato isosmotic). Diversamente 4% PFA, 2% PFA manterrà una quantità significativa del segnale GFP se il fissativo è completamente rimosso dopo fissazione. Le ghiandole possono essere conservati per un massimo di 1 settimana in 1X PBS al buio a 4 ° C fino intera immunocitochimica montaggio e di imaging confocale viene eseguita, come riportato precedentemente 3,6,13-15. Idealmente, immunocitochimica e di imaging deve essere eseguita subito dopo la fissazione per ottenere le migliori immagini. Ghiandole possono anche essere lisate in tampone RIPA per SDS-PAGE seguita da Western blotting. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;ex vivo epitelio-mesenchimale tecnica di ricombinazione è stato pubblicato per la sottomandibolare ghiandole salivari nel 1981 16. In questo protocollo, si ampliano il metodo originale, usando l&#39;infezione adenovirale per manipolare cellule epiteliali espressione genica nel contesto di una ghiandola ricombinato. Abbiamo dimostrato che una percentuale delle cellule epiteliali sono infettati con l&#39;adenovirus, mentre la percentuale di cellule che sono infettate dipende dalle proprietà del...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 americano senza rosso fenolo </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina e streptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> Magazzino 10X </td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Congelare aliquote monouso a-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Frazione V, endotossine basso </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Dovrebbe essere alto titolo (1x10 10 pfu / ml). CsCl virus purificate sono più efficaci di virus purificato su colonna in questo saggio. </td></tr><tr><td> 16% paraformaldeide </td><td&gt; Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15710 </td><td> Diluita al 2% in PBS con 5% di saccarosio (w / v) </td></tr><tr><td> 1X tampone fosfato salino (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Preparato da stock 10X </td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> no Calcio, Magnesio no, no rosso fenolo </td></tr><tr><td> Transferrina </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml di soluzione in magazzino DMEM/F12 media. Congelare monouso aliquote a-20C </td></tr><tr><td> Acido L-ascorbico (vitamina C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml di soluzione concentrata in DMEM/F12 media.Freeze monouso aliquote a-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Elenco dei reagenti necessari per SMG protocollo ricombinazione. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 piatti centimetri plastica sterili </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Piastre di coltura di tessuti-non-trattata può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Stereo microscopio da dissezione con base a luce trasmessa </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Ogni dissezione stereo microscopio può essere utilizzato che ha una base a luce trasmessa. </td></tr><tr><td> 35 millimetri di tessuto di coltura piatti </td><td> Falco </td><td> 353001 </td><td> Piastre di coltura di tessuti-non-trattata può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Diametro 50 mm micropozzetti piatti </td><td> MatTek Corporation </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch filtri a membrana </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> Diametro di 13 mm, 0,1 millimetri dimensione dei pori </td></tr><tr><td> Widefield microscopio a fluorescenza </td><td> Carl Zeiss, Stati Uniti d&#39;America </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Ogni microscopio a fluorescenza (in posizione verticale, inverted o stereo microscopio da dissezione) può essere utilizzato per monitorare l&#39;espressione della GFP a basso ingrandimento con una fotocamera digitale allegata. </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Microscopia confocale è necessario vedere le strutture cellulari dettagliate. Qualsiasi microscopio confocale può essere utilizzato. </td></tr><tr><td> Topi di sesso femminile in stato di gravidanza, a tempo-deformazione CD-1 o ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Gli embrioni sono raccolti il ​​giorno 13 (con il giorno della scoperta spina designato come giorno 0). </td></tr><tr><td> Bisturi # 11 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Manico bisturi # 3 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinze in lega di acciaio inox, 0,05 millimetri 0,02 millimetri X </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11252-20 </td><td> Ideale per la raccolta di ghiandole da embrioni </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 forcipe dumostar lega, 0,05 millimetri 0,01 millimetri X </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11295-20 </td><td> Punta fine sono necessari per la rimozione di mesenchima da epitelio. Aghi tungsteno può anche essere usato. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Apparecchiatura utilizzata nelle SMG protocollo di ricombinazione. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

Branching morfogenesi avviene durante lo sviluppo di molti organi, e l&#39;embrione ghiandola sottomandibolare mouse (SMG) è un modello classico per lo studio di branching morfogenesi. Nel SMG sviluppo, questo processo comporta fasi iterative di gemma epiteliale e formazione condotto, per dare infine origine a una complessa rete ramificata di acini e condotti, che servono per produrre e modificare / trasportare la saliva, rispettivamente, nella cavità orale 1 - 3. Il epiteliale associata membrana basale e aspetti del compartimento mesenchimale, comprese le cellule mesenchimali, fattori di crescita e la matrice extracellulare, prodotti da queste cellule, sono fondamentali per il meccanismo di ramificazione, anche se come gli eventi cellulari e molecolari sono coordinate rimane poco compresa 4 . Lo studio dei meccanismi molecolari di guida anticipi morfogenesi epiteliali la nostra comprensione dei meccanismi di sviluppo e permette di comprendere meglio possibile rigeapprocci di medicina ative. Tali studi sono stati ostacolati a causa della mancanza di metodi efficaci per la manipolazione genetica dell&#39;epitelio salivare. Attualmente, trasduzione adenovirale rappresenta il metodo più efficace per il targeting cellule epiteliali in ghiandole adulti in vivo 5. Tuttavia, in espianti embrionali, mesenchima denso e la membrana basale che circonda le cellule epiteliali ostacolo all&#39;accesso virale alle cellule epiteliali. Se il mesenchima viene rimosso, l&#39;epitelio possono essere trasfettate con adenovirus, e può riprendere rudimenti epiteliali branching morfogenesi in presenza di Matrigel o laminina-111 6,7. Mesenchima-free crescita epiteliale rudimento richiede anche una ulteriore integrazione con fattori di crescita solubili e non pienamente ricapitolare morfogenesi ramificazione come si verifica in ghiandole intatti 8. Qui si descrive una tecnica che facilita adenovirale trasduzione delle cellule epiteliali e la cultura del e transfettatepithelium con mesenchima associati. Dopo microdissezione dei fucili mitragliatori embrionali, la rimozione del mesenchima, e l&#39;infezione virale dell&#39;epitelio con una GFP contenente adenovirus, si dimostra che l&#39;epitelio ricombina spontaneamente con mesenchima non infetti, ricapitolando intatta la struttura ghiandolare SMG e la ramificazione morfogenesi. La popolazione geneticamente modificato delle cellule epiteliali possono essere facilmente monitorato con metodi standard di microscopia a fluorescenza, fluorescenza se-tagged costrutti adenovirali sono utilizzati. Il metodo di ricombinazione tessuto descritto è attualmente il metodo più efficace ed accessibile per la trasfezione di cellule epiteliali con un vettore wild-type o mutanti all&#39;interno di un costrutto complesso tessuto 3D che non richiede la generazione di animali transgenici.

Il flusso delle fasi principali sperimentali è descritto nella Figura 1. Un esempio di un SMG intatto, un rudimento isolato epiteliale, e il mesenchima corrispondenti sono mostrati nella Figura 2. Immagini brightfield di SMGs ricombinati, che continuano a subire branching morfogenesi quando coltivate ex vivo per i tempi riportati, sono mostrati in Figura 3. Ghiandole ricombinati coltivate per 48 ore esprimere GFP epiteliale sono mostrati in Figura 4.</...

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Una tecnica per manipolare geneticamente le cellule epiteliali in tutta<em&gt; Ex vivo</em&gt; Embrionali di topo in coltura ghiandole sottomandibolari (SMG) con il trasferimento del gene virale è descritto. Questo metodo sfrutta la capacità innata di SMG epitelio e mesenchima di ricombinare spontaneamente dopo la separazione e l&#39;infezione dei rudimenti epiteliali con vettori adenovirali.

Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  University at Albany, SUNY. Una tecnica per manipolare geneticamente le cellule epiteliali in tutta Ex vivo Embrionali di topo in coltura ghiandole sottomandibolari (SMG) con il trasferimento del gene virale è descritto. Questo metodo sfrutta la capacità innata di SMG epitelio e mesenchima di ricombinare spontaneamente dopo la separazione e l'infezione dei rudimenti epiteliali con vettori adenovirali.

Video: Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissezione delle ghiandole salivari e midgut da Ae. aegypti zanzare

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Ricerca

Biologia

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

La preparazione di 2-dGuo-trattati Organ Culture Timo

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

Metilazione del DNA: Modifica bisolfito e analisi

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

Dissezione e immunocolorazione delle ghiandole salivari larvali da zanzare Anopheles gambiae

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...