Gli autori desiderano ringraziare il Centro di Patologia Veterinaria della Scuola di Medicina Veterinaria dell'Università del Surrey per i servizi di istologia. Ringraziamo anche i dottori L. Dixon, A. Reis e M. Henstock del Pirbright Institute (Pirbright, Regno Unito) per il loro supporto nell'approvvigionamento dei tessuti animali, e il Dipartimento di Scienze Biochimiche dell'Università del Surrey, in particolare il team tecnico, per il loro continuo supporto. RSM è stato supportato dal premio di borsisteria del Doctoral College (Università del Surrey), DM e PC sono stati supportati dal Centro nazionale per la sostituzione, il perfezionamento e la riduzione degli animali nella ricerca (numeri di sovvenzione: NC/R001006/1 e NC/T001216/1).

Questo protocollo descrive l'assemblaggio e l'uso di un sistema composto da due inserti EasyFlow (bioreattore): uno che rappresenta la camera di reazione (C), contenente il campione di arteria perfusa, e uno che funge da serbatoio del terreno (R) (Figura 1 e Figura 2A). Le arterie carotidi sono state ottenute da suinetti maschi e femmine di 4-6 settimane (6-12 kg) presso il Pirbright Institute, nel Regno Unito. Le procedure sugli animali sono state eseguite ai sensi dell'Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986) (ASPA) e approvate dall'Animal Welfare and Ethical Review Board (AWERB) presso il Pirbright Institute. Gli animali sono stati alloggiati in conformità con il codice di condotta per l'alloggio e la cura degli animali allevati. Tutte le procedure sono state condotte da titolari di licenza personale che sono stati addestrati e competenti ai sensi della licenza di progetto PPL70/8852. I suinetti sono stati abbattuti secondo il metodo della tabella uno nell'ambito dell'ASPA.
1. Produzione di inserti
<ol><li>Fabbricare l'inserto mediante stampa 3D, utilizzando il modello 3D fornito (File supplementare 1). NOTA: la modellazione 3D consente di apportare facilmente modifiche al progetto per adattarle a nuove applicazioni. Per produrre l'inserto possono essere utilizzati anche materiali alternativi e tecniche di produzione alternative. A causa della complessa struttura interna, la sinterizzazione laser selettiva e la stereolitografia sono alternative appropriate15. La poliammide 12 (PA12; vedi Tabella dei materiali) è un buon materiale candidato grazie alle sue prestazioni superiori in termini di ritenzione di liquidi e resistenza a ripetuti cicli di sterilizzazione a caldo16.</li>
	<li>Fabbricare le guarnizioni in silicone e le rondelle in policarbonato tagliando al laser17, utilizzando i disegni forniti nel file supplementare 2. NOTA: Il taglio laser è facilmente esternalizzato e un metodo di produzione economico. Le rondelle possono essere realizzate in acciaio inossidabile, fornendo un componente più resistente per un uso ripetuto. Tutti gli altri componenti sono articoli disponibili in commercio. Un elenco completo dei materiali richiesti è fornito nella Tabella 1. I dettagli commerciali degli articoli sono inclusi nell'Indice dei Materiali.</li>
</ol>2. Sterilizzazione, assemblaggio e adescamento del dispositivo
<ol><li>Sterilizzare tutti i componenti seguendo le istruzioni nella Tabella 1.</li>
	<li>In condizioni di flusso laminare, assemblare due inserti fabbricati (fase 1), come mostrato nella Figura 1A.</li>
	<li>Assemblare il sistema di perfusione come nella Figura 2, seguendo i passaggi seguenti:<ol><li>Collegare due valvole a tre vie collegate alla porta R1 del serbatoio (porta di scambio dei fluidi).</li>
		<li>Collegare l'uscita risultante alla testa della pompa peristaltica utilizzando un tubo dotato di valvola unidirezionale (tubo valvola unidirezionale).</li>
		<li>Collegare la testa della pompa alla porta C4 della camera di reazione utilizzando un tubo di sistema dotato di una valvola unidirezionale. NOTA: Questa diramazione può essere dotata opzionalmente di un sensore di pressione che consente un monitoraggio costante.</li>
		<li>Collegare la porta C1 della camera di reazione al tubo a parete morbida e questa al canale di resistenza (piccolo diametro interno). NOTA: La lunghezza del tubo di resistenza influenzerà notevolmente la pressione presente nel sistema. Questo dovrebbe essere ulteriormente studiato per garantire condizioni di perfusione adeguate.</li>
		<li>Estendere il canale di resistenza con il tubo del sistema, creando un canale di ritorno e chiudendo il circuito di circolazione luminale collegandolo al serbatoio in R5 (Figura 2C).</li>
		<li>Creare un canale di troppo pieno collegando la camera di reazione C3 al serbatoio R3 con la tubazione del sistema.</li>
		<li>Collegare un filtro di ventilazione attraverso R2.</li>
		<li>Creare uno smorzatore di pressione collegando una siringa contenente aria e fluido alla camera di reazione C6. NOTA: Il corretto rapporto aria/fluido dipenderà dalla pressione richiesta smorzamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Adescare il sistema con mezzo di perfusione (terreno di coltura modificato di Dulbecco [DMEM] + 10% [v/v] siero fetale bovino [FBS] + 1% [v/v] penicillina-streptomicina + 1% [v/v] amfotericina B + 30% [v/v] destrano; vedere Tabella dei materiali) attraverso le porte di scambio dei terreni e il serbatoio. NOTA: L'adescamento del sistema riduce il rischio di bolle intrappolate nel sistema e identifica eventuali perdite. Il volume di terreno consigliato è di circa 100-120 ml. Il volume utilizzato dipenderà dal volume morto del tubo utilizzato per la sperimentazione.</li>
</ol>3. Raccolta e preparazione dei campioni
<ol><li>Raccogliere le arterie carotidi comuni sinistra e destra, riducendo al minimo la manipolazione diretta del tessuto arterioso13.</li>
	<li>Posizionare il tessuto in un mezzo di trasporto freddo (DMEM+ 20% [v/v] FBS + 2% [v/v] penicillina-streptomicina + 1% [v/v] amfotericina B, vedere la tabella dei materiali) per il trasferimento.</li>
	<li>In una cabina a flusso laminare, rimuovere il tessuto connettivo in eccesso e tagliare le estremità del tessuto utilizzando una lama per bisturi. Lavare il tessuto due volte in mezzi di trasporto freddi.</li>
	<li>Posizionare il tessuto su un agitatore orbitale nei mezzi di trasporto per almeno 30 minuti per un lavaggio accurato.</li>
	<li>Collegare un segmento non ramificato dell'arteria al sistema del bioreattore utilizzando due connettori luer spinati e fissarlo in posizione utilizzando un legame vascolare (fascette in silicone vascolare; Tabella 1). NOTA: Il legame del vaso fornisce la tensione e la retrazione adeguate per fissare il recipiente. La sezione ovale previene il danneggiamento dei tessuti.</li>
	<li>Far scorrere delicatamente il terreno attraverso l'arteria per verificare la pervietà.</li>
	<li>Dopo aver fissato l'arteria all'inserto fabbricato, riempire lo spazio di reazione con mezzi di perfusione (passaggio 2.4). Infine, riempire delicatamente il circuito di circolazione luminale con il fluido per eliminare l'aria residua dal sistema.</li>
	<li>Collegare lo spazio di reazione con il sistema di perfusione precedentemente assemblato (sezione 2), completando la circolazione. NOTA: Si consiglia di eseguire un controllo di qualità mediante immunoistochimica del tessuto trattato. In questo modo vengono identificati eventuali danni dovuti a un'eccessiva manipolazione durante la preparazione.</li>
</ol>4. Cultura della perfusione e cambiamento dei media
<ol><li>Collocare il sistema di perfusione in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 e quindi collegarlo a una pompa peristaltica (vedi Tabella dei materiali)</li>
	<li>Collegare eventuali sistemi di acquisizione aggiuntivi (facoltativi), come i sensori di pressione (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Lasciare che il sistema si equilibri durante la notte con una bassa portata del fluido di ~10-15 mL/min. NOTA: Sono necessari esperimenti iniziali per determinare le impostazioni della pompa, il flusso del fluido, la pressione del sistema e le impostazioni ottimali degli smorzatori/morsetti di pressione per garantire che siano soddisfatte le condizioni appropriate.</li>
	<li>Il giorno successivo, aumentare il flusso in modo incrementale (+1 rpm ogni ora, equivalente a un aumento di ~2,5 mL/min ogni ora, nel sistema attuale) fino a raggiungere la portata finale (35 mL/min). Monitorare periodicamente il sistema per verificare la presenza di perdite. NOTA: Per calcolare la portata accurata in base alla velocità della pompa peristaltica, gli utenti devono prima eseguire un'adeguata calibrazione della pompa18. Utilizzando la formula (1), la portata volumetrica (Q) può essere calcolata in base al volume erogato (V) in un determinato tempo (t). Per calcolare la velocità di flusso stimata () possiamo utilizzare la portata (Q) precedentemente calcolata e l'area della sezione trasversale del recipiente (A), descritta nell'equazione (<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/65465/65465eq03.jpg" style="margin: auto;">2). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65465/65465eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65465/65465eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	<li>Ogni 3 giorni, sostituire il 50% del terreno (~50 ml) collegando una siringa piena di terreno fresco alla porta di scambio del terreno più vicina alla pompa e una siringa vuota alla porta più vicina al serbatoio per raccogliere il mezzo esausto (Figura 2). NOTA: L'utilizzo di due valvole a tre vie come porte di scambio del fluido facilita il funzionamento continuo della perfusione durante lo scambio del fluido.</li>
	<li>Al termine dell'esperimento, prelevare il tessuto dalla camera di reazione tagliando le estremità collegate al bioreattore utilizzando forbici chirurgiche sterili.</li>
	<li>Smontare, pulire e sterilizzare il sistema per un ulteriore utilizzo.</li>
</ol>5. Analisi del campione
<ol><li>Fissare il campione raccolto in paraformaldeide (PFA) al 4% per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Incorporare il tessuto alla temperatura di taglio ottimale (OCT; vedere la tabella dei materiali)19 e congelare per immersione in isopentano raffreddato in azoto liquido.</li>
	<li>Ottenere sezioni criogeniche di 3-5 mm di spessore utilizzando un criostato.</li>
	<li>Eseguire l'immunoistochimica (ematossilina ed eosina [H&E]) e/o l'immunofluorescenza. Seguire il tipico protocollo di immunofluorescenza:<ol><li>Bloccare le fette per 1 ora a temperatura ambiente con siero di capra al 20% [v/v] in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; vedere la tabella dei materiali).</li>
		<li>Incubare le fette per una notte a 4 °C con anticorpo primario di coniglio contro CD31 diluito 1:50 in PBS (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Lavare tre volte con PBS per 5 min.</li>
		<li>Incubare per 1 ora a 37 °C con anticorpo secondario anti-coniglio di capra marcato con fluorescenza diluito 1:200 in PBS e anticorpo fluorescente α-actina muscolare liscia (SMA) direttamente coniugato diluito 1:200 in PBS (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Lavare tre volte con PBS per 5 min.</li>
		<li>Colorare i nuclei con DAPI diluito 1:1.000 in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare con Sudan Black allo 0,1% (p/v) (vedere la tabella dei materiali) in etanolo al 70% (v/v) per 10 minuti a temperatura ambiente per ridurre l'autofluorescenza dei tessuti.</li>
		<li>Lavare il tessuto con abbondante acqua deionizzata. Montare le guide nel supporto di montaggio.</li>
		<li>Visualizzare i campioni con un microscopio a scansione laser confocale.</li>
	</ol></li>
</ol>

Un nuovo bioreattore stampato in 3D per la coltura ex vivo di vasi sanguigni in perfusione

<ol>
	<li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atherosusceptible+endothelium:+Endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo.">The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li><li>Gugliandolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylethanolamide+and+Polydatin+combination+reduces+inflammation+and+oxidative+stress+in+vascular+injury.">Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury.</a> Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).</li><li>Anselmino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catheter+ablation+of+atrial+fibrillation+in+patients+with+left+ventricular+systolic+dysfunction:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis.</a> Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).</li><li>Viola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+delivery+of+monoclonal+antibodies:+How+do+we+get+there.">Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there.</a> Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).</li><li>Kim, D. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+enhances+functionality+of+tissue-engineered+blood+vessels+in+vivo.">Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo.</a> Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).</li><li>Boparai, K. S., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Fused+Deposition+Modeling.+In:+Module.">Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module.</a> Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , (2017).</li><li>McKeen, L. W., McKeen, L. 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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

I sistemi di perfusione vascolare ex vivo costituiscono una piattaforma unica per studiare la funzione e il comportamento delle cellule vascolari all'interno dei loro tessuti nativi in condizioni controllate, il che consente la dissezione di processi complessi come il rimodellamento vascolare post-lesione22. Tuttavia, la maggior parte dei bioreattori segnalati sono sistemi realizzati internamente basati su componenti su misura e sono spesso difficili da replicare da altri23. Esistono soluzioni commerciali alternative, ma mancano di flessibilità nella progettazione e possono essere relativamente costose24.
Abbiamo sviluppato un sistema alternativo che fornisce una piattaforma facile, economica e riproducibile che può essere prodotta utilizzando tecniche di stampa 3D open-source13. Il presente articolo descrive la configurazione del sistema per consentire applicazioni riproducibili da parte degli utenti finali. Questa configurazione consente l'applicazione di condizioni fisiologiche e patologiche di pressione (40-180 mmHg), portata (6-30 mL/min) e, in combinazione con fluidi che imitano la viscosità del sangue, con vari gradi di sforzo di taglio.
La riproducibilità è un aspetto essenziale del processo scientifico, in quanto consente ai ricercatori di convalidare le scoperte di altri e di basarsi su di esse per far progredire la nostra comprensione delle malattie vascolari. Inoltre, gli strumenti che consentono e promuovono le collaborazioni tra i gruppi sono essenziali per far progredire la conoscenza scientifica. EasyFlow rappresenta un esempio di tali soluzioni open-source e accessibili che possono essere facilmente prodotte e adottate da laboratori che lavorano su una vasta gamma di progetti nel campo delle scienze vascolari e non solo.
Segnaliamo che questa coltura del dispositivo mantiene la vitalità del tessuto arterioso per almeno 7 giorni e può essere utilizzata per modellare fasi specifiche della malattia vascolare. Usando questo, si potrebbero modellare le portate fisiologiche e le condizioni di pressione13. È importante sottolineare che questa coltura di perfusione è conveniente grazie ai bassi costi di produzione e al basso volume di terreno necessario per far funzionare il sistema.
Il design 3D può anche essere adattato a nuove applicazioni e possono essere testati nuovi materiali per la stampa. Anche nel suo formato attuale, lo spazio di alloggiamento del campione può essere facilmente adattato a campioni di diverse dimensioni modificando la lunghezza dei raccordi o il foro dei connettori luer. È importante notare che, data la natura modulare del dispositivo e le sue dimensioni ridotte, questo bioreattore può essere utilizzato in diverse configurazioni (Figura 5) e può essere applicato a colture multiplex, dove più campioni possono essere esposti a condizioni diverse contemporaneamente in bioreattori separati.
Si prevede che l'uso del sistema venga ampliato in futuro per supportare la coltura di vasi sanguigni di diversa origine (ad esempio, specie diverse) e di diversa natura (ad esempio, vene, linfatico), e forse applicato alla coltura di altri tessuti cavi (ad esempio, trachea, intestino). In particolare, la ricerca mostra che la coltura di scaffold di ingegneria tissutale in perfusione costante aiuta la distribuzione omogenea delle cellule all'interno del costrutto e la maturazione del tessuto risultante25,26. Inoltre, la semina di innesti vascolari in perfusione contribuisce a ottenere un lume vascolare più uniformemente cellularizzato, rispetto ai metodi statici27. Per questo motivo, prevediamo che il sistema venga applicato all'ingegneria tissutale per aiutare ad affrontare le sfide attuali, consentendo lo sviluppo futuro di sostituti sintetici riproducibili dei vasi sanguigni28.
Il protocollo qui descritto presenta alcuni passaggi importanti fondamentali per il successo della cultura del flusso. Stabilire e monitorare le condizioni di flusso appropriate non è banale e deve essere eseguito su ogni sistema quando viene impostato per la prima volta, per garantire che le condizioni di coltura siano fisiologiche. Il flusso e la pressione sono stati monitorati utilizzando sensori di pressione e immagini a ultrasuoni. Un altro punto critico è garantire che il tessuto sia vitale e intatto all'inizio della coltura. Ciò richiede una fonte nuova, un'attenta manipolazione e può essere verificato mediante analisi istologica. Inoltre, la risoluzione dei problemi deve essere eseguita all'inizio di ogni esperimento per identificare qualsiasi potenziale contaminazione batterica o fonte di perdita di fluidi.
È importante sottolineare che il sistema di perfusione descritto, pur fornendo condizioni fisiologiche di pressione e flusso, non è in grado di imitare completamente i complessi modelli di onde di pressione registrati in vivo. Questa limitazione è attribuibile all'utilizzo di una pompa peristaltica e può essere risolta utilizzando apparecchiature più specializzate per riprodurre condizioni emodinamiche avanzate. Anche la coltura di vasi sanguigni in un bioreattore non è in grado di affrontare studi in cui il sistema immunitario o l'interazione con altri organi sono critici.
In conclusione, viene presentato un semplice sistema di perfusione stampato in 3D in grado di imitare l'ambiente emodinamico fisiologico, che dovrebbe contribuire alla standardizzazione delle colture di vasi sanguigni ex vivo . Il suo potenziale di personalizzazione e applicazione alla coltura a lungo termine lo rende uno strumento essenziale per far progredire la comprensione di questi complessi sistemi biologici in fisiologia e condizioni patologiche.

La parete vascolare esiste in uno stato stazionario reattivo, che garantisce sia la reattività agli stimoli esterni (ad esempio, variazione di pressione, vasocostrittori) sia una superficie coerente non attivante che impedisce la coagulazione del sangue e l'infiltrazione di cellule infiammatorie1. In risposta agli stimoli dipendenti dall'invecchiamento e dallo stile di vita e in caso di danno diretto, la parete vascolare attiva processi di rimodellamento come la restenosi e l'aterosclerosi, che sono noti per contribuire alle comuni malattie cardiovascolari (CVD), come l'ictus ischemico e l'infarto del miocardio2. Sebbene siano disponibili approcci interventistici come la rivascolarizzazione percutanea e lo stent per affrontare le manifestazioni avanzate della malattia vascolare, è noto che questi provocano ulteriori danni vascolari, spesso portando a recidive. Inoltre, sono disponibili solo soluzioni preventive e in fase iniziale limitate. Comprendere i meccanismi che mantengono l'omeostasi della parete vascolare e ne guidano la disfunzione è al centro dello sviluppo di nuove cure3.
Nonostante il costante sviluppo e i progressi della biologia molecolare e dell'ingegneria tissutale, gli studi sugli animali rimangono una componente cruciale degli studi di biologia vascolare. Gli studi in vivo sugli animali hanno fornito enormi informazioni sui meccanismi dell'omeostasi e della patologia vascolare; Tuttavia, queste procedure sono costose, hanno un throughput relativamente basso e pongono problemi etici sostanziali. Inoltre, gli animali di piccola taglia sono scarsamente rappresentativi della fisiologia vascolare umana e gli esperimenti sugli animali più grandi sono molto più costosi e creano ulteriori considerazioni etiche 4,5. Con la crescente domanda di soluzioni farmaceutiche e mediche per una popolazione che invecchia rapidamente, gli svantaggi dell'uso degli animali sono amplificati, con un impatto sulla riproducibilità, l'affidabilità e la trasferibilità dei risultati alla cura del paziente6.
I sistemi in vitro offrono una piattaforma semplificata per studiare i meccanismi di base, ma non riescono a ricapitolare la complessità dell'intero tessuto, le interazioni tra le cellule e la matrice extracellulare e le forze meccaniche, che sono determinanti critiche nello sviluppo delle malattie vascolari7.
Gli studi ex vivo condotti su tessuti interi mantenuti in ambienti controllati artificialmente imitano la complessità in vivo, consentendo al contempo indagini ad alto rendimento8. Data la capacità di controllare da vicino le condizioni di coltura e l'ambiente, i modelli ex vivo consentono un'ampia gamma di studi complessi e forniscono un'alternativa adeguata per ridurre l'uso di procedure animali in biologia vascolare. Le colture statiche di anelli vascolari hanno offerto spunti interessanti, ma non sono riuscite a incorporare l'elemento emodinamico cruciale9. In effetti, lo studio del sistema vascolare ex vivo pone sfide specifiche legate alle numerose forze dinamiche che si applicano alle cellule all'interno della parete dei vasi sanguigni. Stimoli come il flusso luminale, la turbolenza, lo sforzo di taglio, la pressione e la deformazione della parete hanno un impatto significativo sulla fisiopatologia dei tessuti10,11,12.
I bioreattori a perfusione sono essenziali per lo studio dell'omeostasi vascolare e del rimodellamento in risposta a lesioni o cambiamenti emodinamici13. Inoltre, la coltura di perfusione può essere utilizzata per migliorare la maturazione e la durata dei vasi sanguigni di ingegneria tissutale (TEBV), fornendo alternative adeguate per gli innesti vascolari14.
I bioreattori a perfusione disponibili in commercio sono limitati in termini di flessibilità e adattabilità e sono costosi. Molti dei bioreattori esistenti sviluppati internamente sono invece difficili da replicare in altri laboratori, a causa delle descrizioni limitate e dell'indisponibilità dei componenti 7,8,9,10,11,12 appositamente realizzati. Per superare queste limitazioni, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo bioreattore (EasyFlow), che è economico da produrre, si adatta a una vasta gamma di tessuti e consente modifiche relativamente semplici per adattarsi alle diverse esigenze di ricerca13. L'inserto è stampato in 3D e si adatta come in un coperchio di una provetta da centrifuga standard da 50 ml. Il suo design modulare e la produzione di stampa 3D lo rendono accessibile e riproducibile in diversi laboratori, oltre che facilmente modificabile per adattarsi alle diverse esigenze scientifiche. Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di base del sistema del bioreattore in un ambiente di perfusione arteriosa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EasyFlow</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA12 - 3D printing</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>&#160;PD5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran&#160; from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8802-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat &#945;-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;eBioscience Fluoromount G</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-187-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX35 Premier + Microtome Blade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3052835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit &#945;-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-203760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90&#176; Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor&#174; 647-conjugated antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC1420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for laser cutting of components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of&#160; washers)</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>258-6590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of&#160; silicone seals)</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>840-5541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional pressure monitors:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>080-699PSX-3P-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SciPres Pressure Monitor</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>206-200-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-sterilized single use plasticware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 um filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1114.210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Sterile syringe</td>
			<td>IMS Euro</td>
			<td>40004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sarstedt - 62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-30800-10</td>
			<td>Barb Adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex&#160;Polycarbonate Luer Fittings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>AU-45504-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Miniature Check Valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>98553-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of&#160; silicone seals)</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>840-5541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel M2 Hex Nuts</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>527-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel M2 x 6 mm Screws</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>418-7426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel M5 Hex Nuts</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>189-585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical vessel loop</td>
			<td>Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies</td>
			<td>&#160;10-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way valves</td>
			<td>IMS Euro</td>
			<td>&#160;91000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07</td>
			<td>International Medical Supplies</td>
			<td>SKU: BD-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm</td>
			<td>International Medical Supplies</td>
			<td>SKU: BD-361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm</td>
			<td>International Medical Supplies</td>
			<td>SKU: FD-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100</td>
			<td>International Medical Supplies</td>
			<td>63114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M0740-2396</td>
			<td>System tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex&#160;PharMed BPT 3-Stop Tubing</td>
			<td>ISMATEC</td>
			<td>95714-48</td>
			<td>Soft wall tubing (for clamp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>667-8432</td>
			<td>Resistance tubing&#160;(small inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm)</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>525-30027-00-0</td>
			<td>One way valve tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>125-4042</td>
			<td>Pump Tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo perfusion culture of large blood vessels in a 3d printed bioreactor

Le malattie vascolari costituiscono la base della maggior parte delle malattie cardiovascolari (CVD), che rimangono la principale causa di mortalità e morbilità in tutto il mondo. Sono urgentemente necessari interventi chirurgici e farmacologici efficaci per prevenire e curare le malattie vascolari. In parte, la carenza di modelli traslazionali limita la comprensione dei processi cellulari e molecolari coinvolti nelle malattie vascolari. I bioreattori per colture a perfusione ex vivo forniscono una piattaforma ideale per lo studio di grandi vasi animali (compresi gli esseri umani) in un ambiente dinamico controllato, combinando la facilità della coltura in vitro e la complessità del tessuto vivo. La maggior parte dei bioreattori sono, tuttavia, realizzati su misura e quindi difficili da adottare, limitando la riproducibilità dei risultati. Questo documento presenta un sistema stampato in 3D che può essere facilmente prodotto e applicato in qualsiasi laboratorio biologico e fornisce un protocollo dettagliato per la sua configurazione, consentendo il funzionamento degli utenti. Questo innovativo e riproducibile sistema di coltura di perfusione ex vivo consente la coltura di vasi sanguigni fino a 7 giorni in condizioni fisiologiche. Ci aspettiamo che l'adozione di un bioreattore a perfusione standardizzato supporterà una migliore comprensione dei processi fisiologici e patologici nei grandi vasi sanguigni degli animali e accelererà la scoperta di nuove terapie.

The vascular wall exists in a reactive steady state, which ensures both responsivities to external stimuli (i.e., change of pressure, vasoconstrictors) and a consistent non-activating surface preventing blood coagulation and inflammatory cell infiltration1. In response to aging- and lifestyle-dependent stimuli and upon direct damage, the vascular wall activates remodeling processes such as restenosis and atherosclerosis, which are known contributors to common cardiovascular diseases (CVDs), such as ischemic stroke and myocardial infarction2. While interventional approaches such as percutaneous revascularisation and stenting are available to tackle advanced manifestations of vascular disease, these are known to provoke further vascular damage, often leading to recurrence. In addition, only limited preventative and early-stage solutions are available. Understanding the mechanisms maintaining vascular wall homeostasis and driving its dysfunction is at the heart of developing new cures3.
Despite the constant development and advances in molecular biology and tissue engineering, animal studies remain a crucial component of vascular biology studies. In vivo animal studies have provided enormous insight into the mechanisms of vascular homeostasis and pathology; however, these procedures are costly, have relatively low throughput, and pose substantial ethical issues. In addition, small animals are poorly representative of human vascular physiology, and larger animal experiments are vastly more expensive and create further ethical considerations4,5. With the increasing demand for pharmaceutical and medical solutions for a rapidly aging population, the downsides of animal use are magnified, impacting the reproducibility, reliability, and transferability of results to patient care6.
In vitro systems offer a simplified platform to study basic mechanisms but fail to recapitulate the complexity of the whole tissue, the interactions between cells and the extracellular matrix, and the mechanical forces, which are critical determinants in the development of vascular diseases7.
Ex vivo studies performed on whole tissues maintained in artificially controlled environments mimic the in vivo complexity while enabling relatively high-throughput investigations8. Given the ability to closely control the culture conditions and environment, ex vivo models allow a broad range of complex studies and provide a suitable alternative to reduce the use of animal procedures in vascular biology. Static vascular ring cultures offered interesting insights but failed to incorporate the crucial hemodynamic element9. Indeed, the study of the vascular system ex vivo poses specific challenges related to the many dynamic forces which apply to the cells within the blood vessel wall. Stimuli such as luminal flow, turbulence, shear stress, pressure, and wall deformation significantly impact tissue pathophysiology10,11,12.
Perfusion bioreactors are essential for studying vascular homeostasis and remodeling in response to injury or hemodynamic changes13. Furthermore, perfusion culture can be used to improve the maturation and durability of tissue-engineered blood vessels (TEBVs), providing suitable alternatives for vascular grafts14.
Commercially available perfusion bioreactors are limited in flexibility and adaptability and are costly. Many of the existing in-house developed bioreactors are instead difficult to replicate in other labs, due to the limited descriptions and unavailability of specially made components7,8,9,10,11,12. To overcome these limitations, we have recently developed a new bioreactor (EasyFlow), which is economical to produce, accommodates a range of tissues, and enables relatively simple modifications to adapt to different research demands13. The insert is 3D printed and fits as in a lid of a standard 50 mL centrifuge tube. Its modular design and 3D printing manufacture make it accessible and reproducible across different labs, as well as easily modifiable to adapt to different scientific needs. This protocol describes the assembly and basic operation of the bioreactor system in an arterial perfusion setting.

Autore in primo piano: EasyFlow - Un bioreattore di perfusione economico e adattabile per la coltura di grandi vasi sanguigni 

Ex Vivo Coltura di perfusione di grandi vasi sanguigni in un bioreattore stampato in 3D

We developed a simple cost-effective and adaptable bioreactor for the culture of blood vessels in vitro. The application of physiological flow and pulsatile forces to blood vessels ensures that the cells within the tissue remain viable. The application of bioreactors, such as the one we described here, enable the culture of blood vessels ex vivo and reduces the reliance on animal experiments in research.The application of hemodynamic forces is crucial to maintain a healthy blood vessel in culture, while profusion bioreactors are a great solution to achieve this dynamic environment. Systems described in the existing literature are often challenging to replicate, expensive, and not easy to adapt. We have developed a new perfusion system titled EasyFlow.This system is economic to produce, accommodates a different range of tissues, and is simple to modify so researchers can adapt it to their experimental needs. The production is open source, based on a 3D model, and is accessible through the paper. Also, it can be adapted to the needs of the research based on this 3D model.EasyFlow is currently being employed to test mechanism of vascular repair, such as stem cells or biomaterial-based therapies. We also aim to use this bioreactor to induce the maturation of tissue-engineered blood vessels.

Questo studio ha stabilito un sistema di perfusione versatile e conveniente (EasyFlow)13. Il design stampato in 3D del sistema facilita l'adozione del sistema da parte di altri laboratori e quindi incoraggia la riproducibilità.
L'inserto di perfusione fabbricato è alloggiato in una provetta da centrifuga da 50 mL, creando un ambiente isolato. Utilizzando due inserti di perfusione, è possibile creare un circuito di perfusione contenente un serbatoio e una camera di reazione, dove viene incubato il campione biologico. Il sistema di perfusione viene quindi collegato a una pompa peristaltica e a sistemi di acquisizione opzionali, come sensori di pressione e dispositivi a ultrasuoni, per monitorare le condizioni di coltura (Figura 2).
I campioni di arteria carotide suina sono stati raccolti e processati prima di essere coltivati in perfusione per 7 giorni. Per garantire la qualità del tessuto prima della coltura, sono stati eseguiti esperimenti preliminari in cui i campioni sono stati fissati al momento dell'escissione, dopo la preparazione del tessuto e dopo la perfusione. La colorazione fluorescente per i marcatori endoteliali (CD31) e della muscolatura liscia (αSMA) è stata utilizzata per valutare il mantenimento dell'integrità tissutale. Esempi di tessuti ben conservati e danneggiati sono presentati nella Figura 3 per il confronto. Le immagini mostrano l'importanza di una manipolazione delicata del tessuto al momento dell'escissione, poiché una lavorazione errata (allungamento eccessivo, schiacciamento, ecc.) può comportare la perdita dell'endotelio prima della coltura. I risultati mostrano anche l'importanza dell'instaurazione graduale della perfusione per evitare danni luminali.
La colorazione H&E è stata eseguita insieme alla colorazione a immunofluorescenza (IF) per mostrare il mantenimento della morfologia e della distribuzione complessiva delle cellule nella parete del vaso dopo 7 giorni di coltura (Figura 4). L'applicazione delle condizioni fisiologiche di coltura nel dispositivo garantisce il mantenimento della copertura endoteliale del lume, l'allineamento delle cellule muscolari lisce nei terreni e la conservazione del vasa vasa vasasorum nell'avventizia.
Il design compatto e modulare del sistema di bioreattori consente inoltre un'ampia gamma di configurazioni del sistema. La configurazione più piccola comprende un singolo bioreattore ed è ideale per studi farmacologici e a basso volume (perfusione a ricircolo20, volume totale di 50-70 mL). Per aumentare la lunghezza della coltura e ridurre il numero di cambi di terreno, è più ideale un sistema di circolazione a serbatoio singolo, come quello descritto in questo protocollo, o un sistema di alimentazione costante, in quanto hanno un volume maggiore di terreno in circolazione. È possibile stabilire una configurazione a doppia circolazione21 per esplorare ambienti sperimentali in cui la localizzazione degli stimoli è critica. L'attuale dispositivo può anche essere combinato con sistemi di controllo più sofisticati per consentire un controllo preciso del feedback di parametri come il pH e l'ossigeno disciolto (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig01.jpg"> Figura 1: Schemi di assemblaggio EasyFlow. (A) Schemi renderizzati in 3D che aiutano l'assemblaggio dell'inserto di perfusione. (B) Vengono forniti schemi dettagliati per facilitare il montaggio dei siti di connessione. (C) Una vista in sezione trasversale dello spazio di reazione evidenzia i componenti essenziali dell'inserto EasyFlow e la connessione del tessuto all'inserto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig02.jpg"> Figura 2: Rappresentazione schematica dell'assieme del sistema di perfusione. (A) Sistema di perfusione assemblato contenente tutti i componenti importanti, evidenziando la loro posizione relativa in un ambiente renderizzato in 3D. Non tutti i componenti sono scalabili. (B) Vengono presentate anche le singole viste isometriche dei componenti. (C) Viene mostrata una vista dall'alto del sistema di perfusione assemblato per facilitare l'assemblaggio e il collegamento dei diversi componenti. Le porte sono state etichettate e numerate in senso antiorario per navigare tra i vari siti di connessione attraverso il sistema di perfusione. Questo principio è stato applicato al serbatoio (R) e alla camera di reazione (C). Ai vari canali che collegano le due camere sono stati assegnati anche dei nomi di riferimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig03.jpg"> Figura 3: Mantenimento dei tessuti durante la lavorazione. (A) Le immagini confocali mostrano la struttura normale di un'arteria al momento del prelievo, (B) dopo la pulizia e la lavorazione e (C) dopo la coltura di perfusione, dimostrando il mantenimento di una morfologia ben conservata. (D) Esempi di tessuto danneggiato a causa di una manipolazione eccessiva o errata durante la lavorazione o (E) a causa dell'applicazione di condizioni di coltura non fisiologiche (ad esempio, l'inizio improvviso di un flusso elevato) mostrano l'esaurimento della copertura luminale e l'interruzione del terreno. (F) Il controllo negativo indica la specificità della colorazione. CD31: verde; αSMA: rosso; DAPI: blu. Barre graduate: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig04.jpg"> Figura 4: Valutazione istologica del tessuto prima e dopo la coltura di perfusione. (A e B) Il tessuto arterioso è stato valutato mediante istologia al momento del prelievo e (C e D) dopo 7 giorni di coltura con il sistema del bioreattore. (A e C) La colorazione H&E rivela la conservazione della struttura e dell'organizzazione della parete arteriosa. (B e D) La colorazione in immunofluorescenza dello stesso tessuto evidenzia la copertura endoteliale, l'allineamento delle cellule muscolari lisce e il vasa vasorum nell'avventizia. CD31: verde; SMA: rosso; DAPI: blu. Barre graduate: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig05.jpg"> Figura 5: Rappresentazione schematica di possibili configurazioni di perfusione. Con l'inserto di perfusione è possibile utilizzare varie configurazioni alternative per consentire diversi studi sperimentali. (A) La configurazione di perfusione a ricircolo riduce al minimo il volume di mezzo richiesto. (B) L'impostazione di alimentazione costante fornisce un apporto costante di terreno al tessuto. (C) La circolazione a serbatoio singolo (come descritto in questo documento) fornisce un volume maggiore di terreno per incubazioni a lungo termine e include una zona cuscinetto per il ricambio d'aria e l'equilibrio della pressione. (D) La configurazione a doppia circolazione fornisce due circuiti distinti che alimentano le circolazioni interna (all'interno dell'arteria) ed esterna (spazio di reazione) in modo indipendente. (E) La configurazione di perfusione dinamica include gas continui e controllo del pH da parte di un controller PID (proporzionale-integrale-derivativo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Componenti per la fabbricazione degli inserti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465_Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
File supplementare 1: modello 3D dell'inserto EasyFlow per la produzione di stampa 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/Supplementary%20File%201.stl" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 2: Schemi di progettazione del dispositivo costruito, della vista in sezione, della stampa e dei componenti di tenuta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/Supplementary%20File%202.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about EasyFlow  An Economical and Adaptable Perfusion Bioreactor for Large Blood Vessel Culture at JoVE.com

Questo protocollo presenta la configurazione e il funzionamento di un bioreattore di nuova concezione stampato in 3D per la coltura ex vivo di vasi sanguigni in perfusione. Il sistema è progettato per essere facilmente adottato da altri utenti, pratico, economico e adattabile a diverse applicazioni sperimentali, come la biologia di base e gli studi farmacologici.

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious ...

Abbiamo sviluppato un bioreattore semplice, economico e adattabile per la coltura di vasi sanguigni in vitro. L'applicazione del flusso fisiologico e delle forze pulsatili ai vasi sanguigni assicura che le cellule all'interno del tessuto rimangano vitali. L'applicazione di bioreattori, come quello che abbiamo qui descritto, consente la coltura di vasi sanguigni ex vivo e riduce la dipendenza dagli esperimenti sugli animali nella ricerca.L'applicazione delle forze emodinamiche è fondamentale per mantenere un vaso sanguigno sano in coltura, mentre i bioreattori a profusione sono un'ottima soluzione per ottenere questo ambiente dinamico. I sistemi descritti nella letteratura esistente sono spesso difficili da replicare, costosi e non facili da adattare. Abbiamo sviluppato un nuovo sistema di perfusione chiamato EasyFlow.Questo sistema è economico da produrre, si adatta a una vasta gamma di tessuti ed è semplice da modificare in modo che i ricercatori possano adattarlo alle loro esigenze sperimentali. La produzione è open source, basata su un modello 3D, ed è accessibile attraverso la carta. Inoltre, può essere adattato alle esigenze della ricerca basata su questo modello 3D.EasyFlow è attualmente impiegato per testare i meccanismi di riparazione vascolare, come le cellule staminali o le terapie basate su biomateriali. Miriamo anche a utilizzare questo bioreattore per indurre la maturazione dei vasi sanguigni ingegnerizzati nei tessuti.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Ex Vivo Perfusion Culture of Large Blood Vessels in a 3D Printed Bioreactor

2.0K Views.  University of Surrey. Abbiamo sviluppato un bioreattore semplice, economico e adattabile per la coltura di vasi sanguigni in vitro. L'applicazione del flusso fisiologico e delle forze pulsatili ai vasi sanguigni assicura che le cellule all'interno del tessuto rimangano vitali. L'applicazione di bioreattori, come quello che abbiamo qui descritto, consente la coltura di vasi sanguigni ex vivo e riduce la dipendenza dagli esperimenti sugli animali nella ricerca.L'applicazione delle forze emodinamiche è fondam...

Video: Autore in primo piano: EasyFlow - Un bioreattore di perfusione economico e adattabile per la coltura di grandi vasi sanguigni 

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious surgical and pharmacological interventions to prevent and treat vascular disease are urgently needed. In part, the shortage of translational models limits the understanding of the cellular and molecular processes involved in vascular disease. Ex vivo perfusion culture bioreactors provide an ideal platform for the study of large animal vessels (including humans) in a controlled dynamic environment, combining the ease of in vitro culture and the complexity of the live tissue. Most bioreactors are, however, custom manufactured and therefore difficult to adopt, limiting the reproducibility of the results. This paper presents a 3D printed system that can be easily produced and applied in any biological lab, and provides a detailed protocol for its setup, enabling users&#39; operation. This innovative and reproducible ex vivo perfusion culture system enables the culture of blood vessels for up to 7 days in physiological conditions. We expect that adopting a standardized perfusion bioreactor will support a better understanding of physiological and pathological processes in large animal blood vessels and accelerate the discovery of new therapeutics.

This protocol presents the setup and operation of a newly developed, 3D printed bioreactor for the ex vivo culture of blood vessels in perfusion. The system is designed to be easily adopted by other users, practical, affordable, and adaptable to different experimental applications, such as basic biology and pharmacological studies.

Ricerca

Bioingegneria

Assembly and Priming of the 3D-Printed Bioreactor for Perfusion Culture

Begin assembling the bioreactor under laminar flow by first assembling the two 3D printed easy flow inserts. Then using one insert as the reservoir, and the other as the reaction chamber, proceed to assemble the perfusion system. Attach two connected three-way valves to the reservoir R1 port using a system tube equipped with a one-way valve.Connect the resulting outlet with the pump head. Then connect the pump head to the reaction chamber's C4 port using similar tubing with a one-way valve. Next, connect the reaction chamber port C1 via soft wall tubing to the resistance channel with a smaller inner diameter.Create a perfusion return channel by extending the resistance channel with the system tubing, and closing the luminal circulation loop by connecting to the reservoir at R5.Create an overflow channel by connecting the reaction chamber port C3 to the reservoir port R3 using system tubing, Attach a ventilator filter through R2.Construct a pressure dampener by connecting a syringe filled with air and media to the reaction chamber C6.Using a perfusion media, prime the system through the media exchange ports and the reservoir.

Assemblaggio e adescamento del bioreattore stampato in 3D per la coltura di perfusione

Perfusion Culture of Blood Vessels in the 3D-Printed Bioreactor

To prepare the sample for perfusion culture using the 3D-printed bioreactor. In a laminar flow cabinet, place the isolated porcine carotid artery samples in cold transport media. Using a scalpel blade, remove excess connective tissue and trim the ends of the tissue.Then wash the tissue twice in cold transport media. Next, place the tissue in transport media on an orbital shaker for a minimum of 30 minutes for a thorough final washing. After that, connect a non-branching segment of the washed artery to the fabricated bioreactor system using two barbed lure connections.And secure it using a vessel bond made of vascular silicone ties. Using a small syringe attached to the first lure connection, gently flow media through the artery to ensure its patency. After securing the artery to the fabricated insert, fill the reaction space with perfusion media.Next, carefully fill the luminal circulation loop with media, removing any remaining air from the system. Lastly, connect the reaction space to the assembled perfusion system, completing the circulation. To perform the perfusion culture, place the perfusion system in an incubator.After connecting it to a peristaltic pump, connect any additional acquisition systems, such as pressure sensors. Allow the system to equilibrate overnight with a low media flow rate of approximately 10 to 15 milliliters per minute. The following day, incrementally increase the flow until a final flow rate of 35 milliliters per minute is achieved.Every three days, replace 50%of the media by connecting one syringe with fresh media to the media exchange port closer to the pump and an empty syringe to the port closer to the reservoir to collect the spent medium. After the experiment, using sterile surgical scissors, harvest the tissue from the reaction chamber by trimming the tissue ends connected to the bioreactor. Confocal imaging using endothelial and smooth muscle-specific markers revealed that the normal structure of an artery was well preserved and maintained throughout, starting from the time of harvest, to cleaning and processing, and even after perfusion culture.However, incorrect handling during processing resulted in the loss of the endothelium ahead of the culture, and the application of non-physiological culture conditions like abrupt initiation of high flow showed luminal damage. Histological evaluation of the tissue using hematoxylin and eosin staining and immunofluorescence staining at the time of harvest and after seven days of perfusion culture revealed that the morphology and overall distribution of the cells in the vessel wall were maintained throughout.