Questo lavoro è stato finanziato dal NIH (U54HD41857 e PL1EB008542, un P30 core Biomateriali all&#39;interno del Consorzio Oncofertility tabella di marcia di sovvenzione).

1. Follicolo di isolamento Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal National Institutes of Health Guide per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio e l&#39;uso degli animali istituito istituzionali e protocollo di cura presso la Northwestern University. Per risultati ottimali, tutti dissezioni sono svolte in L15 mezzi per il controllo del pH a livelli ambientali di CO 2, a 37 ° C fasi riscaldato per il controllo della temperatura, e su una panchina pulita per minimizzare la contaminazione batterica. I media dissezione (DM) è preparata con i media L15 integrata con 50 UI / ml penicillina e 50 microlitri / ml streptomicina e 1% FBS. I mezzi di manutenzione (MM) è preparata con i media αMEM integrata con 50 UI / ml penicillina e 50 microlitri / ml streptomicina e 1% FBS. <ol><li> Trasferimento ovaie appena sezionato da 16 giorni vecchio mouse in un piatto nuovo 35 millimetri Petri con 1-2 MM Collagenasi mL contenente 0,1% e 0,1% DNasi. Incubare per 15 minuti all&#39;interno di un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, eseguire diverse fasi di lavaggio in DM per rimuovere collagenasi, e poi il trasferimento ad un piatto 35 millimetri Petri con DM fresca. Isolare follicoli dall&#39;ovaio delicatamente sfogliando (o il taglio), follicoli di distanza dal ovaio intero utilizzando due aghi calibro 28 08/05 allegata al siringhe monouso. Rimuovere il stroma più possibile, senza danneggiare l&#39;integrità del follicolo. Sezionare i 20-40 follicoli secondari per dell&#39;ovaio (130-150mm). Questi follicoli di solito hanno 2-3 strati di cellule somatiche. </li><li> Aggiungere 1 ml di MM al pozzo centrale di mm FIV 60 (fecondazione in vitro) piastra di Petri, e 3 MM mL per l&#39;anello esterno. Trasferimento follicoli intatti con una pipetta per l&#39;anello esterno del piatto FIV per sciacquare brevemente, e poi selettivamente trasferirli nel pozzo centrale (vedi 1.4). Conservare questo piatto FIV nell&#39;incubatrice. </li><li> Dopo che tutti i follicoli sono raccolti, la fase di selezione viene effettuata con un microscopio da dissezione con un 5-ingrandimento 8x. Follicoli sani hanno le seguenti caratteristiche morfologiche: <ul><li> 2-3 strati di cellule somatiche </li><li> 130-150 millimetri </li><li> Nessuna separazione tra ovocita e cellule somatiche </li><li> Ovociti intatto e rotondo Trasferire i follicoli sani al centro di piatti FIV per l&#39;incapsulamento. </li></ul></li></ol> 2. Follicolo incapsulamento, Metodo 1 - &quot;Il metodo Drop&quot; <ol><li> Aggiungere 1 ml di 50 UI / ml di trombina in TBS con 40 mM CaCl 2 in mezzo e del piatto FIV. Scongelare e mantenere magazzino fibrinogeno (50 mg / mL in TBS) sul ghiaccio. Portare il fibrinogeno a temperatura ambiente a destra prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare il fibrinogeno / alginato soluzione mescolando 1x PBS, 0,5% di alginato in soluzione PBS e 50 mg / mL di soluzione di fibrinogeno nel rapporto 02:01:01 in un tubo da microcentrifuga 1,7 ml sterili. Evitare di introdurre bollicine nella soluzione. Delicatamente vortice e spin-down. La soluzione appare leggermente torbida e deve essere preparata immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Inserire due gocce di fibrinogeno / soluzione alginato nell&#39;anello esterno di un piatto FIV: un 90 gocce microlitri per l&#39;incapsulamento e 10 gocce microlitri per il lavaggio. Per diminuire l&#39;evaporazione, spegnere la fase di riscaldamento sul microscopio da dissezione. Trasferimento 10-15 follicoli in gocce 10 L con una minima quantità di terreni di coltura (&lt;5 mL) con un punta micropipetta 200 micron, e mescolare rapidamente. Trasferire tutti i follicoli in gocce 90 microlitri con una minima quantità di soluzione (&lt;5 mL) dalla prima goccia, e mescolare. </li><li> Contemporaneamente aspirare un follicolo e 5 ml di fibrinogeno / alginato soluzione con un punta di 10 microlitri pipetta, e rilascio nel trombina / soluzione di Ca 2 + nel piatto FIV. Ripetere questa operazione finché tutti i follicoli sono incapsulati. </li><li> Cross-link le perline per 5-7 minuti in trombina / soluzione di Ca 2 +. Le perle diventerà più scuro come gel di fibrina. Trasferire le perle in una capsula di Petri contenente MM, a partire dai grani più scura per primo. Incubare il piatto per 15-30 minuti InThe incubatore per sciacquare la trombina rimanenti. </li><li> Trasferire le perle in una piastra a 96 cultura e contenente 100 ml di mezzi di crescita del follicolo, e di immagine subito. I media di crescita (GM) si prepara con i media αMEM integrata con 10 mUI / ml di FSH ricombinante, 3 mg / mL di BSA, 1 mg / ml di bovini Fetuina, 5 mg / ml di insulina, 5 mg / ml di transferrina, e 5 ng / ml di selenio. </li></ol> 3. Follicolo incapsulamento, Metodo 2 - &quot;Il metodo Parafilm&quot; <ol><li> Preparare il fibrinogeno / alginato soluzione miscelando una soluzione di alginato 0,5% e 50 mg / mL di soluzione di fibrinogeno in un rapporto di 1:1 in una provetta da microcentrifuga 1,7 ml sterili. </li><li> Pipettare 7,5 ml di gocce del fibrinogeno / alginato miscela su un vetrino rivestito parafilm con distanziali da 3 mm. Trasferire 1 follicolo in ogni goccia con minimiquantità l di media. </li><li> Aggiungere 7,5 ml di trombina / Ca 2 + soluzione ad ogni goccia. La miscelazione è inutile perché il gel forme quasi istantaneamente. </li><li> Coprire il gel con il secondo vetrino parafilm rivestito, mettere le diapositive a testa in giù in una capsula di Petri 100 mm, e trasferimento in incubatore per 5 minuti. </li><li> Trasferire le perle in una capsula di Petri contenente MM, e poi nella cultura così come descritto in precedenza. Se i talloni stare insieme, che è causa di cross-linking tra le perle, possono essere separati delicatamente con una pinza. </li></ol> 4. Follicolo Imaging e cambiamento media <ol><li> Ogni 2 giorni, i follicoli colta sono esposte utilizzando un microscopio ottico e il diametro follicolare viene misurata con il software di programma ImageJ. </li><li> Ogni 2 giorni, la metà dei terreni di crescita (50 mL) è sostituito dal fresco, pre-equilibrato dei media di crescita. </li></ol> 5. Recupero follicolo da Matrix 3D e in maturazione in vitro degli ovociti (IVM) <ol><li> Dopo 8 giorni di coltura, la idrogel appare chiaro a causa della completa degradazione della componente fibrina, ed i follicoli espandersi ad un diametro di 300-400 micron. L&#39;alginato rimanente viene degradata da alginato-liasi, un impianto di derivazione enzima che degrada specificamente alginato e non influisce sulle cellule animali. </li><li> Rimuovere i supporti di crescita da pozzetti contenenti le perline e aggiungere 100 mL di 10 UI / ml in alginato liasi αMEM. Lascia la piastra nell&#39;incubatore per 25-30 minuti. </li><li> Rimuovere follicoli dalla perline sciolto con una punta fine smussata. Primo trasferimento per l&#39;anello esterno di un piatto contenente FIV DM, e poi verso il centro e, anche contenenti DM da lavare. </li><li> Dopo il lavaggio, trasferire i follicoli per l&#39;esterno, e poi l&#39;anello interno di un piatto FIV contenente i media stagionatura. In mezzi maturazione in vitro (IVM) è composto da αMEM, 10% FCS, 1,5 UI / ml di hCG, e di 5 ng / mL del fattore di crescita epidermico (EGF) </li><li> Trasferimento a CO 2 incubatore per 15-16 ore. Esaminare i follicoli per l&#39;espansione delle cellule cumuliformi. Per rimuovere le cellule del cumulo dal ovocita, aggiungere ialuronidasi soluzione a una concentrazione finale 0,1 mg / ml ed incubare nell&#39;incubatore per 2-3 minuti. Utilizzare una punta di 75 mm a taglio micropipetta cellule del cumulo dal ovocita pipettando su e giù parecchie volte. Determinare fase di maturazione dell&#39;ovocita sotto una luce o di un microscopio da dissezione. Le tappe possibili, dal meno al più maturi, sono i seguenti: <ul><li> Degenerata. L&#39;ovocita è frammentato in due o più pezzi. </li><li> Vescicola germinale (GV) stadio. L&#39;ovocita non ha ripreso la meiosi in risposta all&#39;esposizione hCG, che è evidente dalla presenza continua del nucleo dell&#39;ovocita (GV). </li><li> Vescicola germinale ripartizione (GVBD). La membrana nucleare è assente l&#39;ovocita, ma non è presente corpo polare. Pertanto, l&#39;ovocita è ancora in meiosi-I. </li><li> Metafase II ovocita arrestato (MII). L&#39;ovocita ripreso la meiosi, ed è ora arrestato in metafase II. Un corpo polare deve essere visibile su una luce o un microscopio da dissezione. L&#39;ovocita MII rimarrà a meno che non fecondate in esperimenti successivi. </li></ul></li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Abbiamo descritto un nuovo metodo di incapsulamento dei follicoli ovarici in una FA-IPN per la coltura in vitro (Figura 1). Follicoli ovarici costituito da un ovocita circondato da diversi strati di cellule somatiche. La comunicazione tra i comparti multipli cellulare è essenziale per lo sviluppo dei follicoli sani e la maturazione degli ovociti. Incapsulamento follicolo in un idrogel 3D supporta l&#39;espansione follicolo, pur mantenendo l&#39;architettura del follicolo 9,11,12. Come sviluppare follicoli, il loro volume aumenta in modo esponenziale e il incapsulamento biomateriale dovrebbe consentire questa espansione senza lo sviluppo di una forza inibire compressione. FA-IPN è una rete integrata di due materiali naturali, in cui la fibrina è proteoliticamente degradabile da plasmina attivata dal follicolo e alginato è biologicamente inerte 13 (Figura 2). Durante la crescita del follicolo, degradazione della fibrina inizia a livello locale nei pressi del follicolo, e continua fino a quando la fibrina viene cancellata dal idrogel. La componente non degradabile alginato, che rimane intatta per tutto il periodo della cultura, sostiene la struttura 3D del idrogel. Follicoli sono stati isolati nella fase secondaria di sviluppo (150-180 micron di diametro) e ampliato a 400 micron in fase antrale di sviluppo nel FA-IPN gel. Con la stimolazione con hCG, i follicoli colto può subire l&#39;espansione delle cellule cumulo, e ovociti può riprendere la meiosi e il progresso di metafase II per la fecondazione. Questi risultati suggeriscono che il metodo di incapsulamento e il materiale incapsulante permesso cultura follicolo e la maturazione in vitro di successo (Figura 3). Degradazione della fibrina attorno al encapsulfollicoli ated inizia il primo giorno di cultura, ed è completata da giorno 6. Aprotinina, un inibitore della plasmina solubili, possono essere utilizzati per alterare degradazione della fibrina e di estendere gradiente meccaniche nel materiale incapsulante (Figura 4). Se follicoli sono coltivati ​​con 0,01 TIU / ml aprotinina, la fibrina è più lento degrado per i primi 4 giorni. Tuttavia, i follicoli può ancora sviluppare allo stadio antrale e ovociti restano competenti per riprendere la meiosi di metafase II, dopo l&#39;aprotinina è removed.A alta concentrazione di aprotinina (0,1 TIU / mL) inibisce in maniera significativa degradazione della fibrina, matrice di rigidezza impedisce l&#39;espansione del follicolo e delle cellule somatiche invasione nella matrice si osserva. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagramma di flusso di sviluppo del follicolo. Il follicolo ovarico è costituito da un ovocita in posizione centrale circondato da uno o più strati di cellule somatiche, che sostengono lo sviluppo degli ovociti. Come sviluppare follicoli dalla secondaria alla fase preovulatoria antrale, le cellule somatiche che circonda l&#39;ovocita proliferare e differenziarsi, e l&#39;ovocita aumenta di dimensioni. Maturazione in vitro (IVM) è il passo finale per la cultura follicolo, quando le cellule somatiche adiacenti alla ovocita, chiamate cellule del cumulo, espandere dopo stimolazione con hCG, e l&#39;ovocita riprende la meiosi e progredisce ad un metafase II (MII) stadio. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2a.jpg" alt="Figura 2a" /> Figura 2a. Alginato e fibrina-alginato per la cultura follicolo 3D in vitro. (A) alginato è un biomateriale naturale che è adatto per la cultura follicolo in vitro grazie alla sua gelificazione dolce e caratteristiche biochimiche, come la dimensione delle maglie, rigidità controllabile e inerzia biologica. Alginato è un copolimero polisaccaride lineare di α-L-guluronic acido (G) e β-D-mannuronico acido (M). Le aree con monomeri G ripetere, denominato &quot;G-blocchi&quot;, sono interconnessi per formare un idrogel, in presenza di ioni calcio bivalenti. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2b.jpg" alt="Figura 2b" /> Figura 2b. (Bi) Piccoli follicoli incapsulato esperienza bassa forza di compressione in alginato all&#39;inizio della cultura. Tuttavia, poiché il follicolo si espande il volume spostato nel tallone è in aumento, che si traduce in una maggiore forza di compressione nella direzione opposta di espansione follicolo (b-ii). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2c.jpg" alt="Figura 2c" /> Figura 2c. Le catene di polimeri individuali sono completamente impigliata nella fibrina-alginato soluzione prima del cross-linking. Entrambi i componenti della FA-IPN iniziare a cross-link immediatamente in quanto sono esposti alla miscela di trombina e calcio. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3a.jpg" alt="Figura 3a" /> Figura 3a. Diagramma di flusso per l&#39;isolamento del follicolo e l&#39;incapsulamento in un FA-IPN. Follicoli secondari sono isolati da 16 giorni di vecchio mouse (Ai). Gli organi riproduttivi sono sezionato (A-II), e follicoli isolati sono trasferito in un piatto con i media manutenzione (A-III). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3b.jpg" alt="Figura 3b" /> Figura 3b Il metodo goccia per l&#39;incapsulamento follicolo in soluzione fibrinogeno alginato (B: I-IV).. Due gocce di fibrinogeno-alginato soluzione, la caduta di risciacquo (10 mL) e la caduta di incapsulamento (90 mL) sono pipettati nel piatto (Bi). Prossimi 3-5 follicoli vengono trasferiti in una goccia di risciacquo (B-II). Dopo il risciacquo e la rimozione dei media, i follicoli sono trasferiti al calo incapsulamento (B-III). Ogni follicolo è aspirato con 5 microlitri fibrinogeno-alginato soluzione con una punta di 10 microlitri pipetta e poi espulso in trombina / calcio soluzione (B-iv). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3c.jpg" alt="Figura 3c" /> Figura 3 quater. Il reticola tallone per 5 minuti. Il metodo di parafilm per l&#39;incapsulamento follicolo in soluzione fibrinogeno alginato (C: I-III). Fibrinogeno-alginato di soluzione (7,5 mL) è pipettati sul vetrino rivestito parafilm e follicoli vengono trasferiti individualmente ad ogni goccia dopo il risciacquo (Ci, ii). Trombina soluzione (7,5 mL) viene aggiunto a ogni goccia (C-III). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3d_e.jpg" alt="Figura 3d-e" /> Figura 3d - e. Le gocce sono coperti con un secondo vetrino parafilm rivestiti e la FA-IPN è reticolato in incubatrice per 5 minuti. (D) I follicoli incapsulati vengono trasferiti ai media la crescita in una piastra da 96 pozzetti. (E) L&#39;immagine di un follicolo incapsulato nel FA-IPN (freccia bianca). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Degradazione della fibrina dalla crescente FolliCLE. Follicoli degradare la fibrina componente della FA-IPN durante il periodo di cultura, che è dimostrato da un cerchio chiaro intorno al follicolo. Architettura 3D del follicolo è supportata dal alginato rimanenti. Il giorno 0 (D0) la fibrina è ancora intatta e la matrice di tutto il follicolo è nuvoloso; dopo 1 giorno in coltura (D1), l&#39;anello libero intorno al follicolo appare (freccia bianca) e la parte anteriore di degradazione della fibrina continua ad espandersi radialmente il giorno 2 (D2) e il giorno 4 (D4) della cultura. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Immagini di crescita del follicolo. Rappresentante la crescita del follicolo immagini ofsecondary nella FA-IPN il giorno 0 (A), 4 (B), 6 (C) e 8 (D) della cultura. Dopo 8 giorni, i follicoli antrali sono stati maturati in vitro, e la conseguente fase di ovociti MII sono mostrati (E, il corpo polare viene mostrata con freccia nera). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Fibrina degradazione è stata inibita da aprotinina. Crescente follicoli il giorno 2, 4, 10 e 12 sono riportati nella prima riga. Aprotinina a concentrazioni 0,01 TIU / mL (seconda fila) e 0,1 TIU / mL è stato aggiunto al terreno di coltura nei giorni 0, 2 e 4. Solo follicolo culture con 0,01 TIU / ml aprotinina degradato la fibrina dopo la rimozione aprotinina ed ha raggiunto fase antrale. Follicoli colto in 0,1 TIU / ml aprotinina non è cresciuto nella FA-IPN. <table border="1"><tbody><tr><td> Abbreviazione </td><td> Nome e cognome </td></tr><tr><td> CO 2 incubatore </td><td> 37 ° C incubatore al 5% di CO 2 </td></tr><tr><td> COC </td><td> Complessi cumulo oocita </td></tr><tr><td> 3D </td><td> Dimensionale 3 </td></tr><tr><td> DM </td><td> Dissezione dei media </td></tr><tr><td> FEG </td><td> Fattore di crescita epidermico </td></tr><tr><td> FA-IPN </td><td> Fibrina-alginato rete compenetrano </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Siero bovino fetale </td></tr><tr><td> GM </td><td> La crescita dei media </td></tr><tr><td> GV </td><td> Vescicola germinale </td></tr><tr><td> hCG </td><td> Gonadotropina corionica umana </td></tr><tr><td> ITS </td><td> Transferrina supplemento di insulina Selenio </td></tr><tr><td> FIV piatto </td><td> Centro ben 60 mm di piatto fecondazione in vitro </td></tr><tr><td> MM </td><td> Manutenzione mezzi di comunicazione </td></tr><tr><td> MII fase ovocita </td><td> Metafase II fase ovocita </td></tr><tr><td> rFSH </td><td> Ricombinante dell&#39;ormone follicolare Stimolare </td></tr><tr><td> TBS </td><td> Tris soluzione salina tamponata </td></tr><tr><td> TIU </td><td> Unità tripsina inibitorio </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Abbreviazioni

<ol>
	<li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+maturation,+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system.">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li><li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture.">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li><li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles.">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li><li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture,+in+vitro+follicle+development+and+transplantation:+implications+for+fertility+preservation.">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li><li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development.">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li><li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development.">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li><li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose.">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li><li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes.">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).</li><li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development.">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li><li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+Three-Dimensional+Culture+Supports+Development+of+Nonhuman+Primate+Secondary+Follicles.">Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles.</a> Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).</li><li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+follicle+micro+environment.">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li><li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+follicles+produce+live,+fertile+offspring.">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li><li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility.">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo presentato follicolo ovarico incapsulamento in una FA-IPN consente cultura follicolo in un ambiente 3D in vitro. Un FA-IPN è un processo dinamico, cellula-reattiva matrice in cui sono determinati le proprietà iniziali meccaniche dalla combinazione di entrambi fibrina e alginato. Durante la cultura, il follicolo incapsulato attiva proteasi che degradano solo una componente del IPN, la fibrina, che si traduce in una rigidità gel gradualmente decrescente che ha contribuito unicamente dal alginato che ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fetuin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>F3385</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Gibco</td>
<td>10082-139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aprotinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10236624001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wako</td>
<td>039-00475</td>
<td>40 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A412</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>rFSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hCG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I1884-1VL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;MEM+Gluta MAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>32561</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>30-002-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tisseel Fibrin kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>921030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Alginate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FMC BioPolymers</td>
<td>LF200DL</td>
<td>Mw 418kDa</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3 dimensional system

Il follicolo ovarico è l&#39;unità funzionale dell&#39;ovaio che secerne ormoni sessuali e supporta la maturazione degli ovociti. Follicolo Nelle tecniche in vitro fornire uno strumento per lo sviluppo del modello follicolo per studiare biologia di base, e sono ulteriormente sviluppata come una tecnica per preservare la fertilità del clinica 1-4. Il nostro sistema di coltura in vitro impiega idrogel in modo da simulare l&#39;ambiente nativo ovarico, mantenendo l&#39;architettura 3D follicolare, interazioni cellula-cellula e di segnalazione paracrina che lo sviluppo del follicolo diretta 5. In precedenza, i follicoli sono stati colti con successo in alginato, un inerte alghe polisaccaride derivato che subisce gelificazione con gli ioni calcio 6-8. Idrogel alginato formata ad una concentrazione di 0,25% w / v sono stati i più permissivi per la cultura follicolo, e mantenuto la massima competenza dello sviluppo 9. Idrogel alginato non sono degradabili e quindi un aumento del diametro del follicolo risultati in una forza di compressione sul follicolo che possono influenzare la crescita del follicolo 10. Successivamente abbiamo sviluppato un sistema di coltura basato su una rete di fibrina-alginato compenetrano (FA-IPN), in cui sono gelificato una miscela di fibrina e alginato contemporaneamente. Questa combinazione offre un ambiente dinamico meccanico perché entrambi i componenti contribuiscono alla rigidità matrice inizialmente, tuttavia, proteasi secreto dal follicolo crescente degrado fibrina nella matrice di alginato lasciando solo quello di fornire supporto. Con l&#39;IPN, il contenuto alginato può essere ridotto al di sotto dello 0,25%, il che non è possibile con alginato solo 5. Così, come il follicolo si espande, si sperimenterà una forza di compressione ridotto a causa del ridotto contenuto di solidi. Qui, descriviamo un metodo di incapsulamento e di un sistema di coltura in vitro di follicoli ovarici in una FA-IPN. L&#39;ambiente dinamico meccanico imita l&#39;ambiente naturale in cui follicoli ovarici piccolo risiedono in una corteccia rigido e passare a un midollo più permissiva in quanto aumentano di dimensione 11. La componente degradabile può essere particolarmente critico per la traduzione clinica al fine di supportare il maggiore di 10 aumento di 6 volte il volume che i follicoli umani normalmente sottoposti in vivo.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Un nuovo metodo per l&#39;incapsulamento follicolo ovarico in una rete di fibrina-alginato 3D compenetrano è descritto. Questo sistema combina un sostegno strutturale con degradazione proteolitica per sostenere lo sviluppo dei follicoli immaturi per la produzione di ovociti maturi. Questo metodo può essere applicato agli aggregati di coltura cellulare per mantenere la cellula-cellula contatti senza limitare l&#39;espansione.

Un metodo per l&#39;incapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 Sistema dimensionale

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

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Bioengineering

24.2K Views.  Northwestern University. Un nuovo metodo per l'incapsulamento follicolo ovarico in una rete di fibrina-alginato 3D compenetrano è descritto. Questo sistema combina un sostegno strutturale con degradazione proteolitica per sostenere lo sviluppo dei follicoli immaturi per la produzione di ovociti maturi. Questo metodo può essere applicato agli aggregati di coltura cellulare per mantenere la cellula-cellula contatti senza limitare l'espansione.

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Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotipiche Collagene I test: una piattaforma malleabile per valutare Comportamento cella in un 3-dimensionale Contesto

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Ricerca

Bioingegneria

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as well as substance testing. These models are mostly cultivated in membrane-insert systems, their permeability toward different substances being an essential factor. Typically, applied methods for determination of these parameters usually require large sample sizes (e.g., Franz diffusion cell) or laborious equipment (e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)). This study presents a method for determining permeability coefficients directly in membrane-insert systems with diameter sizes of 4.26 mm and 12.2 mm (cultivation area). The method was validated with agarose and collagen gels as well as a collagen cell model representing skin models. The permeation processes of substances with different molecular sizes and permeation through different cell models (consisting of collagen gel, fibroblast, and HaCaT) were accurately described.
Moreover, to support the above experimental method, a simulation was established. The simulation fits the experimental data well for substances with small molecular size, up to 14 x 10-10 m Stokes radius (4,000 MW), and is therefore a promising tool to describe the system. Furthermore, the simulation can considerably reduce experimental efforts and is robust enough to be extended or adapted to more complex setups.

A method for determination of permeability in a membrane insert system for multi-well plates and in silico parameter optimization for the calculation of diffusion coefficients using simulation are presented.

Un metodo per la determinazione e la simulazione di permeabilità e la diffusione in un modello 3D del tessuto in una membrana inserire sistema per piastre multi-pozzetto

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produzione di elastina-come proteina idrogeli per incapsulamento e Immunostaining delle cellule in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Acido ialuronico base di idrogel per cultura 3-dimensionale delle cellule di Glioblastoma paziente-derivato

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

Costruzione di un foglio di multistrato delle cellule staminali mesenchimali con un sistema di cultura dinamica 3D

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...