Ringraziamo i membri del laboratorio Meshorer, specialmente Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout e Alva Biran, per commenti critici e per la risoluzione dei problemi photobleaching esperimenti su base giornaliera. EM è un Joseph H. e R. Braun Belle Senior Lecturer in Life Sciences ed è sostenuta dalla Israel Science Foundation (ISF 943/09), il ministero israeliano della Sanità (6007) l&#39;Unione europea (IRG-206872 e 238176), Israele Cancer Research Foundation, l&#39;interno Grants applicativi Medica della Hebrew University e la Psicobiologia Israel Institute.

1. Placcatura le cellule ES T = 0 ore MEF placcatura <ol><li> Cappotto di imaging dal vivo ben 8-μ-Slides (ibidi, Monaco, Germania), con gelatina o in vetri a camera di copertura (Lab-Tek, Rochester, NY) o in fondo di vetro piatti cultura (MatTek, Ashland, MA). Lasciare agire per 5-30 minuti e aspirare via libera gelatina. </li><li> Seed 22.000 MEF / pozzetto in 250 microlitri di volume totale di DMEM [supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS)]. Consentono alle cellule di crescere in un tessuto culturale incubatore (37 ° C, 5% CO2). </li></ol> T = 6 ore ES cellula placcatura <ol start="3"><li> Aspirare DMEM. </li><li> Seme ogni MEF rivestito bene con 15.000 cellule R1 / bene in 250 microlitri di volume totale del supporto di cellule ES [supplementato con 10% ESC-grade siero fetale bovino (FBS), 1 mM sodio piruvato, 0.1 mM amino acidi essenziali, 0,1 mM β- mercaptoetanolo, e 1000 U / ml fattore inibente la leucemia (LIF)], per ottenere il 30% al 50% confluenza del giorno successivo. </li></ol> 2. Trasfezione le cellule ES T = 24 ore Trasfezione transiente <ol><li> Sostituire il supporto ES cella con 250 microlitri / pozzetto di mezzi freschi cellule ES. </li><li> In una da 1,5 ml in provetta sterile, aggiungere 100 microlitri di siero multimediale gratuito [Opti-MEM (Gibco)], quindi aggiungere 10 microlitri Transit-LT1 reagenti di trasfezione (Mirus) direttamente nel siero dei media liberi. Mescolare pipettando dolce e incubare a temperatura ambiente per 5-20 min. </li><li> Aggiungere 1,5 mcg GFP DNA plasmidico fusione (H1E, H1o o HP1) diluito al transito-LT1 reagente. Mescolare pipettando dolce e incubare a temperatura ambiente per 15-30 min. </li><li> Aggiungi 13,5 microlitri / e della miscela di trasfezione. Agitare bene l&#39;8-μ-Slides per assicurare anche la dispersione. Dopo 24 ore di sostituire i vecchi mezzi di cellule staminali con 250 ml di mezzi freschi cellule ES. </li></ol> 3. Esecuzione FRAP e FLIP T = 48-72 ore <ol><li> L&#39;esperimento può essere eseguita su qualsiasi microscopio confocale a scansione laser (CLSM), ma dal momento che in una normale FRAP / FLIP esperimento, molte immagini consecutive sono acquisite, si consiglia di utilizzare un disco rotante-microscopio confocale, che consente velocità di acquisizione e assicura che nessun campione indesiderati sbiancamento si verifica dopo l&#39;iniziale evento intenzionale sbiancamento. Qui, si consiglia di utilizzare la Rivoluzione filatura sistema confocale disco (www.Andor.com), con la CSU-X disco testa Yokogawa filatura. Questo sistema ha la capacità duplice photobleach utilizzando un modulo specializzato Frappa con un sistema di punti di scansione, e di passare rapidamente alla luce indietro per raccogliere le immagini utilizzando il disco rotante. Le 3 proteine ​​fluorescenti più comunemente utilizzato per gli esperimenti sono photobleaching GFP, YFP e Cherry. Se GFP o YFP vengono utilizzati, un laser a 488 nm ~ è richiesto. Per Cherry, utilizzare un laser ~ 560 nm. In tutti i casi, si consiglia di utilizzare i laser allo stato solido. Avere uno stadio automatizzato è utile ma non necessaria. Dato che le cellule vive sono ripreso, è indispensabile utilizzare una camera climatica (usiamo una da LIS, Svizzera), l&#39;ossigeno il controllo, l&#39;umidità, CO 2 e temperatura. FRAP viene eseguita utilizzando l&#39;intensità massima di imaging laser mentre si fa con la potenza del laser minima richiesta (in genere nel settore del 10%, quando il livello di fluorescenza è adeguato). Osservare le cellule con luce fluorescente della lunghezza d&#39;onda appropriata e selezionare una cella che esprime GFP 60X usando una lente di immersione in olio. Garantire la giusta distribuzione subcellulare. Occasionalmente, quando i livelli di espressione sono troppo alti, la localizzazione della proteina può &#39;fuoriuscita&#39; di altri comparti come il nucleolo. Tali cellule non deve essere selezionato. </li><li> Ora impostare un protocollo di imaging: raccogliere 3-5 fotogrammi prima della photobleaching, poi photobleach a eucromatina o eterocromatina (visti come focolai condensato GFP) e raccogliere 90-120 fotogrammi dopo la photobleach, con intervalli di 250-1000 ms: H1E-GFP, 1000 ms, H1o e HP1-GFP, 250 ms (intervallo di tempo cambia a seconda della dinamica delle proteine, in cui le proteine ​​altamente dinamico richiedono intervallo di tempo più breve). Normalmente usiamo intensità del laser 80-100% per photobleaching con un impulso laser di μseconds 20-40 (1-2 iterazioni), ma questi numeri possono variare a seconda delle proteine ​​analizzate ed i livelli di espressione. Quando photobleaching è appropriato, si dovrebbe osservare un &quot;buco nero&quot; nella vostra fluorescenza GFP. Il buco nero è gradualmente ri-pieno di fluorescenza di recupero successivo. Anche se il disco rotante possono ottenere fino a circa 60 immagini al secondo (con una buona intensità di fluorescenza e quando lo zoom su una singola cella), si consiglia di non utilizzare il sistema a velocità così elevata a causa della bassa qualità delle immagini e il potenziale fototossicità aumentata. </li><li> Per un esperimento FLIP, impostare un diverso protocollo di imaging: raccogliere 3-5 frame prima dello sbiancamento e inizia a ripetere lo sbiancamento nello stesso punto, mentre la raccolta delle immagini. Per H1E-GFP, candeggina ogni 5 secondi, per H1o-GFP, candeggina ogni 2 secondi, e per HP1-GFP candeggina ogni 1 sec. Candegginad raccogliere le immagini più volte durante l&#39;intero esperimento. </li><li> Per entrambe le tecniche, ripetere il processo su 20-30 cellule. A fini statistici, ripetere l&#39;esperimento 3 volte o più, preferibilmente in giorni diversi. Nelle popolazioni omogenee e le impostazioni corrette, la deviazione standard è generalmente basso (&lt;5%). Per entrambi FRAP e FLIP, la dimensione e la forma della regione sbiancato influenza la dinamica di recupero e deve rimanere costante all&#39;interno di un esperimento. Inoltre, quando due cellule si confrontano, i protocolli identici devono essere utilizzati e le cellule devono essere analizzate in sequenza, il giorno stesso laser di potenza e le altre condizioni possono variare e può influenzare l&#39;esito dell&#39;esperimento. </li></ol> 4. FRAP e FLIP Analisi dei dati <ol><li> In tutti i fotogrammi FRAP raccolti, misurare l&#39;intensità di fluorescenza del ROI (ritorno sull&#39;investimento b = area sbiancato), l&#39;area di sfondo (ROI bg), e il non sbiancata settore nucleare (ROI nb) in funzione del tempo prima e dopo lo sbiancamento. Quando la regione sbiancato è trascurabile l&#39;intero nucleo possono essere selezionati per scopi normalizzazione. </li><li> Per ogni punto di tempo, normalizzare i dati secondo la formula: (ROI b - ROI bg) / (ROI nb - ROI bg) / (pbROI b - pbROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg), pb denota pre-sbiancato. Per la pre-candeggina immagini si dovrebbe ottenere un valore di circa 1. La prima immagine dopo la candeggina indicherà la profondità Bleach. Sottrarre il valore 1 per il valore effettivo di profondità Bleach. Ripetere l&#39;operazione per ogni cellula e media 20-30 cellule di ogni esperimento. </li><li> In tutti i fotogrammi FLIP raccolti, misurare l&#39;intensità di fluorescenza nell&#39;area non sbiancata settore nucleare, e l&#39;area di sfondo (ROI = nb non sbiancato zona, ROI bg sfondo =). Calcolo dei dati FLIP è simile a una curva FRAP, solo il ROI analizzati (ROI nb) dovrebbe essere diverso da quello della regione reale sbiancato, che non viene utilizzato per il calcolo: ROI (nb - ROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg) . E &#39;anche possibile utilizzare una cellula vicina (ROI = n prossimo cellulare) per fini normalizzazione: il ROI (nb - ROI bg) / (ROI n - ROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg) / (pbROI n - pbROI bg ). A seguito di raccolta dei dati, è possibile adattare i dati sperimentali di simulazione al computer. Ciò consente di calcolare, con una buona vicinanza, la frazione mobile, la frazione immobile e la mezza massimo. Non discutere gli aspetti matematici e statistici di analisi FRAP qui e di rimandare il lettore ad altre pubblicazioni ottimo 4-9. La profondità bleach si riferisce alla distanza (in asse y) tra il pre-candeggina (100%) segnale e la prima immagine dopo candeggiante; la frazione mobile si intende la distanza (in asse y) tra la profondità candeggina e il segnale di ripresa, quando la cinetica raggiunge un plateau, e la frazione immobile si riferisce alla distanza (in asse y) tra il segnale di recupero e di pre-candeggina (100%) del segnale (vedi figure 1B e 2B). Al di là di questa analisi, ci sono buoni modelli matematici per adattarsi ai dati. Per un singolo esponente, l&#39;equazione  <img src="/files/ftp_upload/2696/eq0.jpg" alt="Equazione" width="80" /> dove T è il tempo, A è la frazione mobile, 1-A è la frazione di immobile e k è la costante di dissociazione fuori, possono essere utilizzati per adattare i dati, e una stima diretta del tasso di fuori del legame (k off) può essere ottenuti, così come per il parametro A, che può essere usata per calcolare il tasso di associazione. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A e B mostrano le curve rappresentative FRAP di HP1 (a sinistra), H1o (al centro) e H1E (a destra) in cellule ES R1. Per semplicità e chiarezza Figura 1a mostra i dati grezzi di una singola cellula prima di ogni normalizzazione e di calcolo. La curva giallo corrisponde alla regione sbiancato, la curva viola corrisponde al non sbiancata settore nucleare (in cui la regione sbiancato è trascurabile l&#39;intero nucleo può essere selezionato per scopi normalizzazione), e la linea rossa corrisponde alla fluorescenza di fondo, che è minimo in questo caso. Freccia verticale rappresenta il tempo di candeggina. Dati normalizzati e media è mostrata in Figura 1B. Si noti la ripresa più lenta di H1 (blu) rispetto al HP1 (rosso). Anche la variante H1E (blu scuro) è più lenta della variante H1o (luce blu). Frazioni mobile e immobile e la profondità Bleach sono indicati per HP1. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A e B mostrano le curve FRAP rappresentante confronto eucromatina (a sinistra) con eterocromatina (a destra) di HP1 in cellule ES R1. Allo stesso modo alla Figura 1, Figura 2A mostra i dati grezzi di una singola cella, curva giallo corrisponde alla regione sbiancato, la curva viola corrisponde al non sbiancata settore nucleare, e la linea rossa corrisponde alla fluorescenza di fondo. Freccia verticale rappresenta il tempo di candeggina. Dati normalizzati e media è mostrata in Figura 2B. Si noti la ripresa più lenta di eterocromatina (rosso scuro) rispetto a eucromatina (luce rossa). Frazioni mobile e immobile e la profondità Bleach sono indicati per eucromatina. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3.. Un tipico esperimento di FLIP H1o R1 cellule staminali embrionali è mostrato nella figura 3A (crudo, non normalizzata dei dati) e B (dati normalizzati e media). In questo esperimento la curva viola corrisponde al non sbiancata settore nucleare, la linea verde corrisponde ad un nucleo di cellula vicina e la linea rossa corrisponde alla fluorescenza di fondo.

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	<li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo:+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins.">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li><li>Meshorer, E., Girard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).</li><li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).</li><li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching.">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li><li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells:+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis.">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li><li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus.">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li><li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics:+what+do+we+really+know.">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li><li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+TransgeneOmics:+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals.">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li><li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells.">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li><li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug.">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

A differenza delle tecniche più disponibile, che coinvolgono cromatina purificato da popolazioni di cellule o cellule fisse, gli esperimenti FRAP seguire i cambiamenti nelle dinamiche delle proteine ​​della cromatina in cellule viventi. Abbiamo trovato la dinamica delle proteine ​​della cromatina per essere un buon indicatore per la plasticità cromatina. Tuttavia, perché richiede di fusione del gene di interesse con GFP, l&#39;aggiunta del tag fluorescenti possono interferire con la funzione della proteina. C...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Merck </td><td> 1,04078 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> Transit-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> 8-ben μ-Slides </td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) e Perdita Fluorescence In photobleaching (FLIP) consentono lo studio della dinamica delle proteine ​​nelle cellule viventi con una buona risoluzione spaziale e temporale. Qui si descrivono come eseguire FRAP e FLIP analisi delle proteine ​​della cromatina, tra H1 e HP1, nel topo staminali embrionali (ES) cellule. In un esperimento FRAP, le cellule sono transfettate, o transitoriamente o stabilmente, con una proteina di interesse fusa con la proteina fluorescente verde (GFP) o loro derivati ​​(YFP, CFP, Ciliegio, ecc.) Nel transfettate, cellule fluorescenti, un intenso fascio laser focalizzato candeggine una regione relativamente piccola di interesse (ROI). La lunghezza d&#39;onda laser è selezionato in funzione della proteina fluorescente utilizzato per la fusione. La luce laser sbiancanti irreversibilmente il segnale di fluorescenza delle molecole nella ROI e, subito dopo lo sbiancamento, la ripresa del segnale di fluorescenza nell&#39;area sbiancato - mediata dalla sostituzione delle molecole sbiancato con le molecole di greggio - è controllata mediante l&#39;imaging lasso di tempo. Le curve generate recupero fluorescenza fornire informazioni sulla mobilità della proteina. Se le molecole fluorescenti sono immobile, non il recupero fluorescenza sarà osservato. In un approccio complementare, perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP), il raggio laser decoloranti stesso punto ripetutamente e l&#39;intensità del segnale è misurata in altre parti della cellula fluorescenti. Esperimenti FLIP quindi misurare il decadimento del segnale, piuttosto che di recupero fluorescenza e sono utili per determinare la mobilità delle proteine ​​e proteine ​​la spola tra compartimenti cellulari. Legame transitorio è una proprietà comune della cromatina proteine ​​associate. Pur essendo la frazione principale di ogni proteina cromatina è legato alla cromatina in ogni momento allo stato stazionario, il legame è transitoria e maggior parte delle proteine ​​della cromatina hanno un elevato turnover di cromatina, con un tempo di permanenza nell&#39;ordine dei secondi. Queste proprietà sono cruciali per la generazione di elevata plasticità di espressione del genoma 1. Fotodecolorazione esperimenti sono quindi particolarmente utili per determinare la plasticità cromatina con GFP-fusione versioni della cromatina proteine ​​strutturali, specialmente nelle cellule ES, dove lo scambio dinamico delle proteine ​​della cromatina (tra cui le proteine ​​eterocromatina 1 (HP1), un linker H1 e istoni core) è più alto che in cellule differenziate 2,3.

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Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Descriviamo metodi photobleaching tra cui Recovery fluorescenza Dopo photobleaching (FRAP) e Perdita Fluorescence In photobleaching (FLIP) per monitorare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in staminali embrionali (ES) cellule. Cromatina proteine ​​dinamica, che è considerato uno dei mezzi per studiare la plasticità cromatina, è aumentata in cellule pluripotenti.

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in Living cellule staminali embrionali

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

27.0K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. Descriviamo metodi photobleaching tra cui Recovery fluorescenza Dopo photobleaching (FRAP) e Perdita Fluorescence In photobleaching (FLIP) per monitorare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in staminali embrionali (ES) cellule. Cromatina proteine ​​dinamica, che è considerato uno dei mezzi per studiare la plasticità cromatina, è aumentata in cellule pluripotenti.

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Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagazione di staminali embrionali umane (ES) Cellule

Ricerca

Biologia

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Patterning di cellule staminali embrionali che utilizzano il chip Bio flip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e scongelamento cellule staminali embrionali umane

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

L&#39;uso di LysoTracker per rilevare la morte cellulare programmata in embrioni e differenziazione delle cellule staminali embrionali

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; coni di crescita

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in Living cellule staminali embrionali

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine della cromatina in Living cellule staminali embrionali