YS-T è sostenuta dal Consiglio europeo della ricerca (CER), la Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israele Cancer Research Fund (ICRF), tedesco-israeliano Fondazione per la ricerca scientifica e lo sviluppo (GIF ), Stati Uniti-Israele binazionale Science Foundation (BSF), tedesco-israeliano di cooperazione Project (DIP), ei ministeri israeliani della scienza e della Salute, ed è il Jane Stern Fellow Famiglia LeBell in Scienze della vita alla Bar-Ilan University. YB è grato alla Fondazione Azrieli per l&#39;assegnazione di una borsa Azrieli.

Il sistema cellulare, deve contenere un costrutto integrato gene che comprende MS2 sequenze ripetute per il tagging mRNA nelle cellule viventi. In questo protocollo si usa una linea di cellule umane U2OS asilo ad un stabilmente integrato β-actina gene, che è fluorescente al DNA, RNA e livelli di proteina 8, come segue (Figura 1A): Il 5 &#39;del gene contiene operatore lac ( Laco) ripete - questi sono usato per codificare il gene (DNA) e, quindi, identificare il locus genomico di integrazione. Un fluorescente tag proteina repressore lac (Laci) si legano alle ripetizioni Laco e tag del DNA. L&#39;mRNA sono contrassegnati con YFP-MS2 proteine ​​che si legano alla MS2 ripetizioni (stem-loop). Il prodotto del gene è CFP-actina e quindi l&#39;induzione del gene comporta la comparsa di PCP-tagged citoscheletro di actina. Il costrutto gene è transfettate in un Tet-On linea cellulare U2OS stabile e la sua espressione è sotto il controllo trascrizionale Tet. 1. Placcatura e trasfezione delle cellule: <ol><li> 48 ore prima le misure, seme ~ 2 * 10 5 cellule su piatti a fondo la cultura dei tessuti di vetro (35 mm piastre di Petri con un 14 mm il fondo di vetro micropozzetti (0,16-0,19 mm di spessore;. Cat. No. P35G-1.5-14-C , MatTek, Ashland, MA)). Aggiungere 2 ml di medium per le cellule, in modo da raggiungere il 50-80% confluenza. </li><li> 24 ore prima dell&#39;esperimento, transitoriamente trasfezione delle cellule con costrutti che esprimono i marcatori fluorescenti per la codifica del DNA e l&#39;mRNA. Usa FuGENE6 reagente di trasfezione (Roche). I costrutti utilizzati: <ol type="a"><li> YFP-MS2-NLS sarà la tag MS2 staminali loop nelle trascrizioni mRNA. La sequenza di localizzazione nucleare (NLS) fornisce la sequenza nucleare voce per il YFP-MS2 proteine. </li><li> opzionale - CFP-Laci o RFP-Laci che legherà le ripetizioni Laco in 5 &#39;del gene e l&#39;etichetta del locus genico. Tagging il locus genico assiste nel tracciamento del gene durante l&#39;esperimento FRAP, ma non è necessario. </li></ol></li><li> Incubare le cellule per almeno 12 ore, per ottenere una buona espressione delle proteine ​​transitoria transfettate (vedi nota). </li><li> 6 - 12 ore prima dell&#39;esperimento aggiungere 1,5 mg / ml doxiciclina (Sigma) alle cellule per l&#39;attivazione del Tet-inducibile gene CFP-actina. </li></ol> Note: * E &#39;importante non raggiungere livelli molto alti di espressione delle proteine ​​trasfettate in modo da non mascherare il segnale ottenuto specificamente dal sito trascrizione, rispetto al segnale di fondo. I livelli di espressione può essere controllata da: a) regolando il tempo tra trasfezione e l&#39;esperimento; b) modificando la forza del promotore (ad esempio CMV è più forte della promotore L30), c) l&#39;aggiunta di un segnale di esportazione nucleare (NES) al YFP-MS2-NLS proteine, che contribuirà a distribuire il segnale YFP in tutta la cella. * Il fluoroforo utilizzato per le misure dovrebbero preferibilmente essere fotostabile tutta acquisizioni a lungo; fluorofori che emettono quindi verde / giallo sono meglio di fluorofori rosso. Informazioni sul fluorofori diversi si trovano in rif 10. * Stabilire che i canali luce diversa non sanguinano-through gli uni agli altri. Diapositive uso contenenti i campioni etichettati con ciascuno dei marcatori a parte, misura in ogni diapositiva l&#39;intensità di entrambi i canali, e quindi calcolare il bleed-through. 2. FRAP: L&#39;esperimento può essere eseguita su qualsiasi microscopio che è in grado sia di acquisire le immagini e l&#39;esecuzione di photobleaching con un raggio laser. Tipicamente, gli esperimenti FRAP vengono eseguiti con un microscopio confocale a scansione laser (CLSM). Tuttavia, poiché nel nostro caso l&#39;esperimento è relativamente lunga (15-30 minuti), e stiamo seguendo un locus piccola all&#39;interno del nucleo, è importante essere in grado di mantenere il luogo / sito trascrizione del gene a fuoco durante l&#39;intero esperimento. Ciò richiede l&#39;imaging rapido in 3 dimensioni nel tempo (4D), ei tassi di tale acquisizione sono difficili da ottenere utilizzando un microscopio a scansione confocale. Quindi, usiamo un sistema 3D-FRAP (Photometrics) costruita su un grande campo Olympus IX81 microscopio (63x Plan-Apo, 1,4 NA) dotato di un EM-CCD (Quant-EM, Roper) in grado di acquisire immagini ad alta velocità (fino a 30 immagini / sec). Il sistema dispone di 405 nm e 491 nm laser che può essere sincronizzata con la fotocamera per permettere photobleaching su una specifica regione di interesse (ROI) del campione. Il microscopio è dotato di una sorgente Lambda DG-4 luce (Sutter) e uno stadio XY &amp; Z (Prima) che permette l&#39;imaging rapido e preciso nella Z-asse. Tutta l&#39;attrezzatura è integrato e controllato da MetaMorph (Molecular Devices). Il live-cell esperimenti vengono eseguiti a 37 ° C con 5% di CO 2 con un live-cell sistema camerale (Tokai). <ol><li> Procedura: Mezz&#39;ora prima dell&#39;esperimento, accendere il dispositivo di riscaldamento, microscopio e laser. Durante l&#39;esperienzamento della temperatura deve rimanere costante, altrimenti potrebbe causare cambiamenti messa a fuoco durante il lunghi tempi di acquisizione. Potenza del laser deve essere stabile per l&#39;uscita di potenza costante. </li><li> Sincronizzare il laser con la fotocamera: <ol><li> Cerca in una zona della piastra che non contiene cellule (utilizzando DIC). </li><li> Utilizzare lo stesso canale di luce che verrà utilizzato per gli esperimenti. Qui usiamo il laser a 491 nm per il canale YFP. </li><li> Puntare il laser al centro dell&#39;immagine. </li><li> Utilizzare il pulsante di sincronizzazione (fornito macro). </li><li> Provare diversi punti sul campo per assicurare che il laser e la telecamera sono sincronizzati. </li></ol></li><li> Scegliere una cella buon candidato per l&#39;esperimento. Anche se lavoriamo con linee cellulari stabili, scopriamo che non tutte le cellule hanno livelli di espressione simili. Buoni candidati sarebbero cellule che: a) mostra una chiara YFP-MS2-tagged site al di sopra della trascrizione diffusa YFP-MS2 sfondo; e b) sono YFP-MS2 sufficiente proteina nella cellula in modo da essere in grado di recuperare completamente dopo l&#39; fotodecolorazione (esempio in figura 1B - confrontare le due celle, la cella di sinistra non è un buon candidato per lo sbiancamento). </li><li> Scegli appropriate condizioni di misura. La procedura FRAP richiede l&#39;acquisizione di molte immagini, e quindi è importante trovare un equilibrio tra tempi di esposizione accettabile e con la luce bassa possibile. Elevati livelli di luce potrebbe influenzare la cellula a causa di fototossicità, e causerà photobleaching. Si raccomanda di mantenere i parametri di imaging costante tra i diversi esperimenti. Le cellule sono ripreso nel canale YFP tempi di esposizione con 150 msec, e nel canale PCP per la rilevazione di CFP-Laci (locus genomico). Dopo la PCP-Laci locus tag consente la rilevazione del gene, anche quando il segnale-MS2 YFP mRNA è fotodecolorate (opzionale). Per ogni acquisizione, 7 Z-fette vengono effettuate ogni 350 nm. Il sito trascrizione attivo è sbiancata usando il laser a 491 nm. </li><li> Eseguire l&#39;esperimento pieno, ma senza sbiancamento. L&#39;esperimento FRAP misura il tempo necessario per il sito di trascrizione per tornare a stato stazionario. In primo luogo, vogliamo verificare che il sito attivo trascrizione è funzionale e stabile allo stato stazionario. Quindi, eseguire un esperimento completo FRAP, ma senza sbiancamento per garantire che l&#39;intensità misurata del sito trascrizione non cambia durante l&#39;arco di tempo esperimento. Noi usiamo questo esperimento per testare anche le nostre condizioni di imaging misurando il photobleaching totale causato dalla serie completa di imaging. Come regola generale, la photobleach film pieno non dovrebbe essere più del 30% dell&#39;intensità iniziale. Questo può essere misurato in base al rapporto di intensità dello stesso punto, nel nucleo dall&#39;ultima immagine, diviso per prima immagine (il rapporto dovrebbe essere maggiore di 0,7). </li><li> FRAP: Il YFP-MS2 segnale nel sito trascrizione attivo è sbiancata usando il laser a 491 nm. 6 pre-candeggina immagini sono state acquisite. Post-candeggina immagini vengono acquisite in una sequenza di 3 frequenze tempo: 15 immagini ogni 3 secondi, 15 immagini ogni 6 secondi, e 26 (o 45 per esperimenti a lungo) le immagini ogni 30 secondi. I cambiamenti nella frequenza di acquisizione di immagini permette di acquisire più immagini durante i tempi che mostrano la variazione più alta intensità (recupero iniziale), e meno le immagini verso la fine quando le variazioni di segnale sono meno evidenti. </li></ol> Note: Questo esperimento è diverso da FRAP &quot;regolare&quot; in quanto: FRAP * di mRNA nel sito trascrizione misura il legame di YFP-MS2 proteine ​​al mRNA nascente, mentre gli esperimenti FRAP tipici misurare la mobilità dei differenti proteine ​​all&#39;interno della cellula. Pertanto, non vi è alcun interesse a misurare la piscina diffusiva di YFP-MS2 proteine. Quando il tempo che intercorre tra lo sbiancamento e la prima immagine acquisita è relativamente lungo, è possibile ignorare questo pool di diffusione del libero YFP-MS2 proteine. * Dal momento che il recupero della YFP-MS2 segnale è relativamente lunga (15-30 min), è importante mantenere il sito trascrizione a fuoco. Questo è il motivo di una serie di Z-fette viene acquisita in ogni punto del tempo. 3. Normalizzazione dei dati FRAP: Il 4D FRAP dati vengono analizzati utilizzando il software di analisi Free Image ImageJ (NIH, Bethesda, MD; <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Che segue è l&#39;analisi effettuata con le macro disponibili attraverso il software ImageJ, ma ovviamente auto-scritto le macro possono essere generati. <ol><li> Z-stack sono al massimo proiettati in ogni time-point, risultando in un film in 2D nel corso del tempo per ulteriori analisi. </li><li> Il sito trascrizione viene monitorato in ogni fotogramma e l&#39;intensità media è misurata utilizzando lo strumento Tracker Spot. 11 I dati vengono salvati in un foglio Excel per ulteriori analisi. </li><li> Per ogni time-point, l&#39;intensità media di altre regioni di interesse (ROI) sono valutate come segue (l&#39;analizzatore Time Series plug-in di ImageJ): a) La parte posterioreterreno è tratto da un ROI al di fuori della cellula = B (t). b) un ROI in nucleoplasma, ma per quanto possibile dal sito candeggina = C (t). c) Il sito di trascrizione = S (t) (misurata con il tracker posto). </li><li> Correggere i dati per photobleaching causati durante l&#39;imaging: Sottrarre il fondo da tutte le altre misurazioni e quindi correggere la candeggina. Sc (t) è l&#39;intensità corretta del sito di trascrizione al tempo t. </li></ol> eq. 1: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq1.jpg" alt="Equazione 1" /><ol start="5"><li> Normalizzare i dati: in primo luogo calcolare la media delle pre-candeggina immagini, che mostra l&#39;intensità del sito di trascrizione allo stato stazionario (= &lt;Sc (pre-bleach)&gt;). </li></ol> Poi normalizzare i dati: eq. 2 <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq2.jpg" alt="Equazione 2" /> I dati sono normalizzati per almeno 10 esperimenti. Calcolare la media degli esperimenti e la deviazione standard (STD) per l&#39;errore-bar ad ogni time-point (Figura 1C). Note: La diffusione del YFP-MS2 proteine ​​durante l&#39;analisi FRAP è stato ignorato in quanto la velocità di diffusione libera nucleoplasmic YFP-MS2 è molto rapido, mentre il limite YFP-MS2 è associata ad alta affinità per l&#39;mRNA, e non ricollegare alla trascrizione sito. È per questo che la prima immagine dopo lo sbiancamento deve essere rimosso prima dell&#39;analisi. 4. Analizzando i dati utilizzando un modello matematico: Al fine di recuperare i parametri cinetici da questo tipo di set di dati, abbiamo usato il modello più semplice descritto che può andare bene questo tipo di dati. La spiegazione completa di questo specifico modello possono essere lette qui 5. Il modello contiene le seguenti equazioni che descrivono il sistema in figura 2A: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq3.jpg" alt="Equazione 3" /> <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq4.jpg" alt="Equazione 4" /> Avendo i parametri del modello, è possibile calcolare il tasso di allungamento: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq5.jpg" alt="Equazione 5" /> Abbiamo analizzato la curva utilizzando Berkeley Madonna ( <a href="http://www.berkeleymadonna.com">http://www.berkeleymadonna.com</a> ), come precedentemente modellati 5 ma le altre opzioni sono disponibili (MatLab, cella virtuale, COPASI ecc.) I dati sono stati adatti al modello e costanti di velocità sono stati estratti. Noi attribuiamo il codice a Berkeley Madonna. Al fine di soddisfare al meglio i dati che abbiamo calcolato lo stato stazionario e quindi inserire i dati normalizzati sperimentali al modello normalizzato. 5. Rappresentante dei risultati: Noi fotodecolorate il segnale mRNA marcato nel sito trascrizione attiva utilizzando laser ad alta potenza, e seguito il recupero della YFP-MS2-segnale nel tempo. Il segnale fluorescente al sito trascrizione è costituito dalla cinetica allo stato stazionario della sintesi di mRNA e mRNA rilasciato dal sito. Misurare l&#39;intensità del sito trascrizione nel tempo senza sbiancamento dà un segnale di &#39;costante&#39; (figura 1C, i punti rossi), il che implica che questo gene è attualmente in uno stato relativamente stabile. Ciò significa che il segnale che si accumula sul mRNA appena trascritto è uguale al segnale che lascia quando un mRNA viene rilasciato dal sito trascrizione. Quando fotodecolorate, questo sistema continua nel suo stato stazionario, ma ora è possibile misurare il tempo impiegato dal segnale per recuperare. Pertanto, il recupero di fluorescenza dipende soprattutto dalle proprietà allungamento della polimerasi. Il sistema FRAP 3D ha permesso l&#39;acquisizione del pieno volume 3D nucleare durante il recupero FRAP, e quindi nessun segnale è stato perso durante gli esperimenti. Per calcolare i parametri cinetici dai dati, la curva normalized è stato montato per l&#39;allungamento modello cinetico che descrive, che si basa su equazioni differenziali. 5 Il vantaggio di utilizzare un semplice modello ODE è che può essere adatto solo a un ristretto numero di parametri . La fase iniziale del modello (punto di ingresso) è l&#39;allungamento, cioè il processo responsabile della sintesi di nuovi MS2 siti di legame. La fase finale (punto di uscita) è uscita mRNA nel nucleoplasma. Il modello si basa sulle curve di recupero, che consistono di due componenti cineticamente risolto, uno veloce e piu &#39;lento. La componente veloce si riferisce alla allungamento, mentre la componente più lento è stato modellato come polimerasi durante la pausa di allungamento. I due stati polimerasi sono stati modellati come allungamento con una transizione stocastica di pausa. Abbiamo ottimizzato le equazioni differenziali di questo modello, che ha dato una velocità di allungamento di 3,3 kb / minuto con una transizione stocastica ad un tasso più lento di sintesi (la pausa per un tempo complessivo di 2,5 minuti). Modellazione mostrato that questa transizione da allungamento per una pausa colpito solo l&#39;11% della polimerasi che è entrato allungamento. <table border="1"><tbody><tr><td> K fuori </td><td> 0,0112 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_in </td><td> 0,0015 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_out </td><td> 0,0067 </td><td></td></tr><tr><td> Allungamento tempo </td><td> (K + k pause_out) -1 </td><td> 56 sec </td></tr><tr><td> Tempo di pausa </td><td> (K pause_out) -1 </td><td> 2,5 minuti </td></tr><tr><td> Pausa probabilità </td><td> (K pause_in) / (K pause_in + k) </td><td> 11% </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Il modello di risultati in una tabella di parametri. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) Il sistema a celle sperimentali utilizzati per seguire l&#39;espressione genica in vivo. Rappresentazione schematica della PCP-actina gene costruire. Il 5&#39;-end contiene una serie di 256 ripetizioni Laco che sono vincolati da RFP-Laci (rosso) e contrassegnare il sito d&#39;integrazione del gene. Induzione trascrizionale da parte del promotore minimo CMV è raggiunto dal legame di invertire tetraciclina attivatore trascrizionale (rtTA o Tet-On) per Tet-responsive elementi (TRE) in presenza di dox. L&#39;mRNA trascritto contiene la sequenza codificante per CFP-β-actina, e 24 MS2 ripete che sono vincolati dal YFP-MS2 proteina di fusione. Alla 3&#39;-end, una porzione di una β-globina di coniglio esone-esone-introne modulo è seguito da una scissione-polyA segnale. Lo schema descrive anche il test di allungamento mostrando MS2 proteine ​​fluorescenti (giallo), collegato al mRNA appena trascritto trascritti da RNA Pol II. (B) Un sito trascrizione attivo (YFP-MS2, la cella a destra) è stato fotodecolorate e il recupero di fluorescenza è stato rintracciato nel tempo (frame in basso). Abbiamo misurato l&#39;intensità di fluorescenza di entrambi i candeggina (linea centrale) e non sbiancato (bottom line) siti di trascrizione attivo. Si noti la cella a sinistra non è adatto per un esperimento fotoscolorimento. (C) Le misure sperimentali effettuate sui siti gene CFP-actina trascrizione. In blu le curve il recupero della YFP-MS2 misure FRAP. In rosso, un non-sbiancata cella da lo stesso esperimento che mostra la YFP-MS2 segnale nel sito trascrizione allo stato stazionario. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) Schema del modello che descrive la cinetica entrata e uscita degli mRNA marcati con YFP-MS2 molecole sul sito della trascrizione. (B) YFP-MS2 dati FRAP e la simulazione dotata (la media di dieci esperimenti è stato montato sul modello) . I residui calcolato del fit sono riportati in basso.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo per la misurazione dell&#39;attività cinetica polimerasi nelle cellule viventi possono essere suddivisi in due parti. La prima parte descrive la procedura di &#39;umido&#39;, che consente la misurazione e il recupero dei dati cinetici di trascrizione mRNA, mentre nella seconda parte, i dati vengono analizzati utilizzando un modello ODE. 5 Una serie di studi hanno utilizzato questo metodo per l&#39;estrazione cinetica di trascrizione nelle cellule viventi 5, 6, 8, 12-14. La principale dif...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th></tr><tr><td> Doxiciclina </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> FuGENE 6 reagenti di trasfezione </td><td> Roche </td></tr></tbody></table>

measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells

L&#39;attività trascrizionale della RNA polimerasi II (Pol II) è un processo dinamico e quindi misurare la cinetica del processo di trascrizione in vivo è di importanza. Pol cinetica II sono stati misurati utilizzando metodi biochimici o molecolari. 1-3 Negli ultimi anni, con lo sviluppo di nuovi metodi di visualizzazione, è diventato possibile seguire la trascrizione di quanto avviene in tempo reale in cellule viventi solo 4. Qui si descrivono le modalità di eseguire analisi di Pol II cinetica allungamento su uno specifico gene in cellule viventi. 5, 6 Utilizzando una linea cellulare in cui un locus specifico gene (DNA), il suo prodotto l&#39;mRNA, e il prodotto finale può essere proteina fluorescente e visualizzati in vivo , è possibile rilevare la trascrizione reale di mRNA del gene di interesse. 7, 8 L&#39;mRNA è fluorescente tag MS2 utilizzando il sistema di tagging per mRNA in vivo, dove il 3&#39;UTR dei trascritti di mRNA contiene 24 MS2 stem-loop ripete, che forniscono i siti di legame altamente specifico per il YFP-MS2 proteina di rivestimento che le etichette l&#39;mRNA come è trascritto. 9 Per monitorare la cinetica di trascrizione usiamo il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) metodo. Dal fotodecolorazione il YFP-MS2-tagged trascrizioni nascente nel sito di trascrizione e poi dopo il recupero di questo segnale nel tempo, si ottiene il tasso di sintesi del mRNA di nuova fabbricazione. 5 In altre parole, YFP-MS2 recupero fluorescenza riflette la generazione di nuovo MS2 staminali loop nelle trascrizioni nascente e il loro legame con fluorescente libero YFP-MS2 molecole che entrano dalla nucleoplasma circostante. Le curve di recupero FRAP vengono poi analizzati utilizzando modelli meccanicistici matematici formalizzati da una serie di equazioni differenziali, al fine di recuperare i parametri cinetici tempo di trascrizione.

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Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

RNA polimerasi II cinetica trascrizionali sono misurate su specifici geni nelle cellule viventi. mRNA trascritto dal gene di interesse sono fluorescente tag e l&#39;utilizzo di recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) la cinetica in vivo di allungamento della trascrizione si ottengono.

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

measuring-the-kinetics-of-mrna-transcription-in-single-living-cells

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Views.  Bar-Ilan University. RNA polimerasi II cinetica trascrizionali sono misurate su specifici geni nelle cellule viventi. mRNA trascritto dal gene di interesse sono fluorescente tag e l'utilizzo di recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) la cinetica in vivo di allungamento della trascrizione si ottengono.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

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Biologia

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in Living cellule staminali embrionali

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

Trascrizione in vitro e tappatura mRNA Luciferase Gaussia Seguito da cellule HeLa Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Cella di misura Kinetics progressione del ciclo con la marcatura metabolica e citometria a flusso

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Misurare il osmotica dell&#39;acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub&gt; F</sub&gt;) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...