In questo video, forniamo una guida passo dopo passo alla raccolta dei pipistrelli in modo umano, destinata a ridurre al minimo l'impatto sulle popolazioni e massimizzare il valore scientifico. I vantaggi del nostro approccio sono che massimizziamo la quantità di potenziali dati molecolari e morfologici per ogni pipistrello, conserviamo i tessuti per mantenere il loro valore futuro e riduciamo al minimo la raccolta di individui selvatici. I protocolli di dissezione sono difficili da dimostrare verbalmente.
Molte delle tecniche di preparazione dei tessuti che presentiamo qui sono meglio comunicate visualizzando come vengono identificati diversi organi, e quindi correttamente sezionati e conservati. Preparare tutte le fiale prima di iniziare eventuali dissezioni per evitare ritardi. Per l'RNA, mettere da parte il numero di fiale necessarie per ogni campione.
Etichettare ogni tubo con il tipo di tessuto che verrà raccolto, nonché le informazioni standard sull'identificazione del campione. Riempire le fiale 50% piene di soluzione stabilizzante dell'RNA e raffreddare a quattro gradi celsius. Fare attenzione a non riempire completamente le fiale con soluzione stabilizzante dell'RNA, poiché il tubo potrebbe esplodere quando lo si posiziona in azoto liquido.
Immediatamente dopo l'eutanasia, eseguire la decapitazione dell'esemplare di pipistrello come descritto nel protocollo di testo. Scuoiare il cranio dai muscoli dei capelli, della fascia e del cranio, inclusa la pelle sul naso. Fare attenzione a non rompere l'estremità anteriore del naso.
Rimuovere gli occhi con le forcelle, usando una forza abbastanza forte da staccare il nervo ottico. Posizionare gli occhi in una fiala a due millilitri di soluzione stabilizzante dell'RNA. Usa le forbici per fare un taglio sagittale sulla porzione dorsale del cranio a partire dal collo, facendo attenzione a non danneggiare il cervello.
Quindi, usa le forcep per tirare delicatamente indietro entrambi i lati del cranio, fino a quando non viene aperto per esporre il cervello. Assicurarsi che il cranio dell'estremità cranica sia stato rimosso, in modo che le forcep possano facilmente raschiare via il cervello. Raschiare delicatamente il cervello con le forcep.
Il cervello sarà molto morbido. Il bulbo olfattivo diventerà visibile, seduto nella porzione ventrale dell'interno del cranio. Cerca di tenere attaccato il bulbo olfattivo.
Se possibile, mantenere intatta la forma del cervello e posizionarla immediatamente sul ghiaccio secco, o in una fiala da cinque millilitri di soluzione stabilizzante dell'RNA. All'estremità caudale del cranio, i cochlei dovrebbero ora essere visibili lateralmente su ciascun lato della testa. Utilizzare le forcep per tirare delicatamente i cochlei.
Quindi, mettili in una fiala a due millilitri di soluzione stabilizzante dell'RNA. Fare due incisioni in cui la mascella superiore e inferiore si uniscono e rimuovere la mandibola. La piastra cribriforme diventerà evidente.
Questo è un osso critico per mantenere il ricercatore orientato. Può essere identificato come la regione più anteriore del cranio, con forame multipli e con due scanalature dove poggia il bulbo olfattivo. Una volta rimossa la mattiere, rimuovere il rostro dalla parte rimanente del cranio.
Assicurarsi che la mascella includa la piastra cribriforme. Posizionare il naso nella soluzione stabilizzante dell'RNA e conservare a quattro gradi celsius durante la notte. Dalla mattiera inferiore, tagliare la lingua con le forbici e mettere in una fiala a due millilitri di soluzione stabilizzante dell'RNA.
Posizionare la fiala del naso in azoto liquido dopo l'immersione notturna nella soluzione stabilizzante dell'RNA. Dopo 24 ore di ammollo sul ghiaccio o in frigo, posizionare i campioni in azoto liquido. Utilizzare un bisturi per perforare la cavità addominale, facendo un'incisione longitudinale fino alle costole.
Questo perde il telaio scheletrico. Spogliare la pelle per rivelare il muscolo pettorale e prelevare almeno due campioni di muscoli. I tessuti sia per l'RNA che per il DNA vengono raccolti durante queste dissezioni.
Posizionare i tessuti per il DNA ad alto peso molecolare in crioviali secchi e congelare il flash nell'azoto liquido. Posizionare i tessuti per l'RNA nella soluzione stabilizzante dell'RNA. Tagliare lo sterno e tirare via le costole.
Ora, recupera il polmone e il cuore. Utilizzare il bisturi e le fusa per separare il cuore dal polmone. Utilizzare un bisturi per rompere il polmone e posizionare nella soluzione stabilizzante dell'RNA.
Raccogli il cuore, che può essere preso intero, ma dovrebbe essere sezionato a metà, in modo che la soluzione stabilizzante dell'RNA si immergi completamente. Ora, prendi dei campioni dal fegato. Prelevare almeno due campioni di fegato.
Posizionare un campione in una fiala per rimanere congelato per il DNA ad alto peso molecolare e posizionare l'altro campione in soluzione stabilizzante dell'RNA. Seguire il condotto epatico per trovare il pancreas e la cistifellea. Trasferire la cistifellea in una fiala di soluzione stabilizzante dell'RNA.
Trova lo stomaco e la milza simile a una piuma alla sua base, apparendo come una diversa tonalità di viola. Il pancreas dovrebbe anche essere visibile qui come struttura del peso. Raccogliere lo stomaco, la milza e il pancreas, nelle rispettive fiale della soluzione stabilizzante dell'RNA.
Raccogliere piccoli campioni dell'intestino tenue e crasso. Posizionare nelle rispettive fiale della soluzione stabilizzante dell'RNA. Prendere uno dei reni e seguire i loro dotti alla vescica, quindi posizionare nelle rispettive fiale della soluzione stabilizzante dell'RNA.
Usa l'altro rene come guida per trovare i teste se maschio, o utero e ovaie se femmina. Raccogliere una o entrambe le gonadi, se possibile. Prendi anche campioni di varie parti della pelle dell'ala e tienili in fiale separate.
Il vantaggio principale del nostro approccio è che ci permette di campionare gli animali in modo non letale, pur generando abbastanza materiale per studi genomici, così come studi molecolari funzionali. Il nostro protocollo consente la preparazione di fibroblasti primari dal tessuto alare. Le cellule rappresentano una preziosa fonte rinnovabile di materiale genetico, nonché un modello per esplorazioni funzionali e molecolari nei pipistrelli.
Le clip alare che sono state conservate nei mezzi di crescita come da sezione sei del protocollo scritto dovrebbero essere trasferite alla struttura di coltura tissutale. Trasferire il contenuto del tubo in un tubo di centrifuga conico da 15 millilitri. La biopsia della membrana alare viene utilizzata per questa dimostrazione.
Rimuovere con cura il mezzo di crescita. Lavare delicatamente la biopsia due volte con 500 microlitri di PBS sterile. Aggiungere 500 microlitri di un milligrammo per millilitro collagenasi quattro al tubo.
Ciò causerà la digestione del tessuto in singole cellule. Incubare durante la notte a 37 gradi celsius senza agitazione. Il secondo giorno, fai un nuovo mezzo di crescita e prewarm a 37 gradi celsius.
Preparare una piastra di coltura di sei tessuti del pozzo aggiungendo due millilitri di mezzo di crescita fresco prebellicato in ogni pozzo della piastra da utilizzare. Conservare questa piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi celsius e 5% fino a quando necessario. Rimuovere il tubo da 15 millilitri contenente le cellule dall'incubatore e dissetare la reazione di digestione aggiungendo un millilitro di mezzo di crescita fresco.
Rimescolare le celle triturando accuratamente la soluzione con una punta di pipetta P1000 per ottenere una sospensione a cella singola. Ruotare delicatamente le cellule in una centrifuga da tavolo per tre minuti a 300 volte G.Scartare il supernatante rimuovendo delicatamente dall'80 al 90% del liquido con una pipetta P1000. Resuspend il pellet in 500 microlitri di mezzo di crescita prebellico.
Triturare delicatamente la sospensione per garantire che il pellet non sia più visibile e che le cellule siano sufficientemente sospese, assicurandosi di evitare piccoli pezzi di tessuto che possono essere ancora visibili sulle pareti. Pipettare delicatamente l'intero volume della sospensione cellulare in un unico pozzo della piastra a sei pozzi preparata in precedenza, contenente il supporto di crescita prebellica. Scuotere delicatamente la piastra da un lato all'altro e da davanti a dietro due o tre volte per aiutare le cellule a distribuire sulla superficie del pozzo in un unico strato.
Controllare le cellule placcate al microscopio. Dovrebbero essere singole cellule che appaiono ballate e galleggianti, ma molto dense. Posizionare con cura la piastra in un'incubatrice preimpostata a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica.
Dopo circa 24 ore, osservare le cellule al microscopio per determinare la salute della coltura. Le celle devono ora essere attaccate alla superficie della piastra e apparire appiattite. Mantenere le cellule in un incubatore umidificato preimpostato a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica.
Le cellule devono essere osservate regolarmente al microscopio per determinare la necessità di ristoro o scissione dei supporti. Quando necessario, aspirare con cura circa il 50% del mezzo dal pozzo e aggiungere delicatamente un millilitro di mezzo di crescita prebellificato sul lato del pozzo, in modo da non disturbare le cellule. Quando è necessario passare le cellule, aspirare attentamente circa il 90% del mezzo di crescita.
Lavare le cellule molto delicatamente aggiungendo un millilitro di PBS sterile alla parete del pozzo, in modo da non disturbare le cellule. Scuotere delicatamente la piastra avanti e indietro e da un lato all'altro da due a tre volte. Aspirare con cura tutto il PBS dalla piastra prima di lavare di nuovo le celle.
Aggiungere l'EDTA alla tripina al pozzo e scuotere delicatamente la piastra per coprire l'intera superficie del pozzo con edta di tripina e incubare per un minuto e mezzo a temperatura ambiente. Dissetare la reazione aggiungendo un millilitro di nuovo mezzo di crescita prebellica. Pipetta su e giù circa cinque volte per lavare le cellule dalla superficie della piastra e assicurarsi che le cellule siano in sospensione.
Posizionare la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e far girare le cellule in una centrifuga da tavolo per tre minuti a 300 volte G.Scartare il supernatante rimuovendo delicatamente dall'80 al 90% del liquido con una pipetta P1000. Rimospendare il pellet in un millilitro di mezzo di crescita prebellico e triturare delicatamente la sospensione. Assicurarsi che il pellet o i grandi frammenti del pellet non siano più visibili e che le celle siano in una singola sospensione cellulare.
Per contare la cella utilizzando un contatore di celle automatizzato, mescolare un'aliquota di dieci microliter delle celle sospese una a una con trypan blue per rilevare celle vitali. Incubare per un minuto e pipettare 10 microlitri della soluzione sullo scivolo di conteggio. Inserire la diapositiva di conteggio in un contatore di celle automatico per contare le celle utilizzando le impostazioni appropriate.
Preparare i supporti di congelamento combinando il mezzo di crescita con DMSO per ottenere una concentrazione finale del 10%DMSO. Il pellet deve essere preparato da un pozzo confluente dell'80-90% di una piastra a sei pota. Resuspend il pellet in un millilitri e mezzo di mezzo di congelamento.
Posizionare circa 750 microlitri di sospensione cellulare in ciascuno dei due crioviali separati. Posizionare le fiale in un contenitore di congelamento criogenico, in modo che le cellule si congelino lentamente per mantenere la vitalità cellulare. Posizionali immediatamente a meno 80 gradi Celsius.
Per scongelare le cellule congelate, preparare una piastra a sei po porsi contenente due millilitri di mezzo di crescita prebellico in ogni pozzo che verrà utilizzato. Mantenere la piastra nell'incubatore di anidride carbonica di 37 gradi celsius e 5% fino a quando necessario. Prendi una fiala di cellule dall'azoto liquido e mettila in un bagno d'acqua calda per scongelare rapidamente le cellule.
Questo dovrebbe richiedere da due a tre minuti. Non appena la soluzione nel flaconcino si è scongelata, pipettare delicatamente su e giù per omogeneizzare la soluzione e posizionare immediatamente l'intera soluzione in un pozzo della piastra dei sei pozzi. Scuotere delicatamente la piastra da un lato all'altro e da davanti a dietro due o tre volte per aiutare le cellule a distribuire sulla superficie del pozzo in un unico strato.
Posizionare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24-48 ore. Monitorare e passare le cellule come dimostrato. Risultati rappresentativi delle estrazioni di DNA sono mostrati per le analisi standard del DNA di tre specie di pipistrelli.
Una singola banda grande indica una frammentazione minima e frammenti di DNA di dimensioni simili provenienti da ogni rispettiva estrazione. Un indicatore comune di successo per le estrazioni di RNA è il numero di integrità dell'RNA, o RIN, con valori superiori a otto che rappresentano un'alta qualità nell'RNA del tatto. Ecco i valori RIN delle estrazioni di RNA da 13 diversi tipi di tessuti di specie di pipistrelli neotropicali, campionati in quattro diverse località.
I tessuti campionati da specie delle Ande, del Costa Rica e della Repubblica Dominicana sono stati collocati direttamente in azoto liquido dopo essere stati immersi in soluzione stabilizzante dell'RNA a quattro gradi celsius durante la notte. I tessuti campionati da specie in Amazzonia sono stati collocati in azoto liquido circa una settimana dopo aver posizionato una soluzione stabilizzante dell'RNA e mantenuti continuamente a quattro gradi Celsius. Anche in questi casi, i valori RIN erano paragonabili a quelli immediatamente collocati nella soluzione stabilizzante dell'RNA e direttamente nell'azoto liquido.
Seguendo la coltura tissutale, le colture di cellule pipistrello dovrebbero coprire dall'80 al 90% della superficie della piastra e mantenere la loro morfologia originale. Questo rappresenta lo stadio ottimale per la divisione. Dopo più di sei passaggi, le cellule cambieranno la loro morfologia per diventare sempre più grandi e più lunghe, e le cellule entreranno in senescenza.
Le cellule luminose a sfera rappresentano cellule morte. Le cellule in coltura rappresentano una fonte rinnovabile di materiale, come DNA, RNA e proteine. Queste linee cellulari possono essere congelate, fornendo così una risorsa che può essere utilizzata per molti anni di ricerca.
Ciò consente studi genomici, trascritomici e funzionali che saranno impegnativi utilizzando tessuti primari. Ad esempio, le cellule possono essere modificate geneticamente o chimicamente per osservare gli effetti sui fenotipi cellulari.
